הקמה ותחזוקה של מקקים אמריקאים גנוטוביוטיים (Periplaneta americana)

פרוטוקול יצירת ג'וקים gnotobiotic מאפשר בדיקה של ההשפעה של הסרת הקהילה מיקרוביאלית במעיים מקוריים והחלפה על בריאות המארח הרכבה מיקרוביום. טכניקה זו משתמשת בשיטות ממקורות מרובים כדי ליצור זרימת עבודה מלוכדת ויעילה ליצירת מקקים gnotobiotic ללא שימוש בציוד מעבדה מיוחד יקר. בהתחשב בחלקים הנעים השונים הרבים של פרוטוקול gnotobiotic זה, הדמיה מסייעת לחוקרים להקים בקלות רבה יותר משלהם בקנה מידה קטן, בעלות נמוכה, ספסל העליון gnotobiotic מתקנים.

כדי להקל על איסוף המספר המתאים של נקבות הנושאות אותקי לניסויים המתוכננים, השתמש במלקחיים כדי להזיז את צינורות הקרטון המכילים נקבות גראביד במיכל המלאי. אם צינור קרטון מכיל חרקים מרובים בנוסף לנקבה הכבידה, לנער את תכולת הצינור לתוך מיכל פלסטיק נוסף מוקף ג'לי נפט ולעודד את חרק היעד לטפס בחזרה לתוך צינור הקרטון לבד. עם הגבייה, העבירו כל נקבה מגרדת למחלקת היולדות.

ברגע שהנקבות הפילו את הביוטקאין שלהן, החזירו את הנקבות למיכל המלאי והשתמשו במלקחיים כדי להחזיר את הoothecae מהפסולת. כדי לנקות את oothecae, למקם עד חמישה ארגזי ביצה בצינור צנטריפוגה חמישה מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של נתרן דודציל סולפט ומערבולת oothecae במשך 10 שניות. לאחר שטיפה שנייה כפי שהוכח זה עתה, השתמש במגבון משימה עדין כדי לשפשף בעדינות את פני השטח של כל בותקה כדי להסיר את כל הפסולת ולמקם את הootheca ניקה לתוך סירת שקילה.

לפני עיקור, למלא שני צינורות צנטריפוגה 1.5 מיליליטר לכל ootheca עם מיליליטר אחד של מים סטריליים לכל צינור. כמו כן להוסיף 10 microliters של 32% תמיסת מלאי חומצה peracetic ל 3.2 מיליליטר של מים מזוקקים כפול בצינור צנטריפוגה חמישה מיליליטר במכסה המנוע אדים. כובע והפך מספר פעמים כדי לערבב ולמקם עד חמישה oothecae ניקה בתמיסת חומצה 0.1% טרי מוכן במשך חמש דקות, היפוך הצינור מספר פעמים כל 60 שניות.

חומצה Peracetic היא חמצון חזק עין, עור, ומרגיז הנשימה, והוא דליק ומאכל. תמיד ללבוש את PPE הנכון במהלך הטיפול להיפטר הפסולת שלך כראוי. בסוף הדגירה, להשתמש מלקחיים סטריליים מכסה המנוע זרימה למינאר להעביר כל ootheca לצינור צנטריפוגה משלה של מים שטיפים סטריליים.

הפוך מספר פעמים לערבב לפני העברת oothecae לקבוצה השנייה של צינורות של מים לשטוף. לאחר השטיפה השנייה, השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר את הביותקיי לנטיות BHI בודדות. מניחים את הנטיות לתוך מיכל משני מעוקר ומעבירים את המיכל לאינקובטור לח של 30 מעלות צלזיוס במשך ארבעה עד חמישה שבועות עד לבקיעה.

בדוק את ההטלות באופן קבוע פעם עד פעמיים בשבוע לצמיחה פטרייתית או חיידקית עד השבוע הרביעי, ובשלב זה יש לבדוק את ההטלות מדי יום. כאשר הנימפות מתחילות לבקוע, השתמש במלקחיים סטריליים ובמכסה המנוע של זרימה למינארית כדי להעביר באופן לא נכון גלולה של צ'או עכברוש מעוקר לבקבוק BHI מוכן. כבדיקת סטריליות, הנח את הבקבוק במיכל המשני באינקובטור 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות כדי לאשר חוסר צמיחה מזהמת.

אם הבקבוק נשאר סטרילי, לנער את הנימפות מתוך השיפוע, לתת להם ליפול לתוך הבקבוק במכסה המנוע לזרום למינאר. ואז להשקות את הנימפות עם 300 מיקרוליטרים של מים סטריליים פעם בשבוע במכסה המנוע של זרימת למינאר. כאשר צואת נימפה מתחילה לכסות את הרצפה הבינונית, להעביר את הנימפות בקבוק BHI חדש המכיל צ'או עכברוש מעוקר הוסיף 24 שעות מראש, כפי שהוכח.

נקבות בהריון ניתן לזהות על ידי ootheca מחובר הבטן האחורית שלהם. oothecae בוקע בממוצע 34 ימים לאחר עיקור. במקרים של עיקור לא מוצלח, הצמיחה יכולה להופיע סביב oothecae במהלך הדגירה, להתפשר על המצב gnotobiotic של הגוזלים.

לאחר מכן ניתן לעקוב אחר קצב הגדילה של הנימפה על ידי מדידת אורך גוף החרקים. ניתן להשתמש בפולימורפיזם באורך שבר ההגבלה של הדנ"א הריבוזומלי 16S מנימפה הומוגנית כדי לאשר מצב גנוביוטי. גנוטוביוטיקה מקקים יכול להיות מחוסן עם קהילות מיקרוביאליות סינתטי או xenobiotic.

בעוד זרימת עבודה מסוימת זו היא חדשה, מחקרים קודמים באמצעות גנוביוטיים ג'וקים יצרו תובנה לתוך הרכבה מיקרוביום במעיים ותפקידים מיקרוביאליים בעיצוב התנהגות חברתית, בריאות המעיים, וחסינות של מארחי החרקים שלהם.