הידרוג'לים אלג'ינאט מפורקים ופרוטאוליטית ומיקרוביו-סיבה לאנקלוסציה של פורצין אוציט

מוצגים כאן שני פרוטוקולים לתחינה של ציטים שונים בתנאי תרבות תלת-מידוד. בתחילה, קומפלקסים cumulus-oocyte (COCs) הם עטוף חרוזים fibrin-אלגינט. בשנייה, הם מוקפים פלואורציה אתילן פרופילן אבקת חלקיקי (microbioreactors). שתי המערכות מבטיחות תנאים אופטימליים לשמירה על ארגון תלת-מיוד.

פרוטוקול זה עבור אנקפסולציה של oocytes פורצ'ין מאפשר לשמור על ארגון כדורי של COCs. הדבר מונע את שיטוחם ואת שיבושם של צמתים פער בין oocyte ותאי זקיקים שמסביב. היתרונות העיקריים של שני הפרוטוקולים המתוארים הם ידידותיים למשתמש ומאפשרים שליטה יעילה הן בהישרדות של אוציטים והן של תאי כימותרפיה.

שתי מערכות התרבות הן כלים בעלי ערך למחקר בסיסי בביולוגיה של הרבייה, ועשויות להיות רלוונטיות קלינית לשיפור הטיפול בפוריות. הם יכולים להיות מיושמים גם לפיתוח שיטות ביוטכנולוגיה חדשניות ושיפור בעלי חיים. לאחר שטיפה השחלות, להעביר אותם מקור מלא מדיום HM ולאחסן אותם באינקובטור ב 38 מעלות צלזיוס במהלך כל המניפולציות הבאות.

שאפו את הנוזל הזקיקי מזקיקי פורצ'ין גדולים וצנטריפוגו אותו פי 100 G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, סנן את העל-טבעי באמצעות מזרק סטרילי המחובר למסנן נקבוביות קרום 0.2 מיקרומטר, והצמד אותו ב-80 מעלות צלזיוס שליליות. כדי לבודד את ה- COCs מזקיקים בגודל בינוני, מעבירים שתיים עד שלוש שחלות לתבשיל פטרי סטרילי באורך 10 ס"מ מלא ב- HM. חותכים בעדינות את פני השטח של זקיקי השחלות הבולטים עם להב כירורגי סטרילי מספר 15, אשר יגרום לנוזל הזקיקים ול- COCs לזרום החוצה לתוך צלחת פטרי.

שאפו את תכולת הזקיקים עם מחט 28 מד מחובר מזרק חד פעמי, ולהעביר אותו לתוך צלחת פטרי אחרת. כדי להכין את מנות הפריה חוץ גופית פטרי, להוסיף מיליליטר אחד של HM ל בארות המרכזיות, ולה מניחים שלוש עד ארבע טיפות של HM בטבעות החיצוניות. לאחר מכן השתמש micropipette פוליקרבונט להעביר את COCs ניזוק טיפות של HM בטבעות החיצוניות, ולשטוף אותם לזמן קצר שלוש עד ארבע פעמים.

בסיום, מעבירים אותם בנפרד לתוך באר מרכזית. אחסן את צלחות ההפריה החוץ גופית באינקובטור. הכן פתרונות תרמובין ופיברינוגן כמתואר בכתב היד של הטקסט.

ביום ההליך, לאט להפשיר את פתרון פיברינוגן על קרח, ולהביא אותו לטמפרטורת החדר ממש לפני השימוש. מערבבים 0.5% פתרון אלגינט ואת פתרון פיברינוגן ביחס של אחד לאחד עבור נפח סופי של שני מיליליטר בעדינות מערבולת את התערובת. תקן תאי דגירה על ידי החלת רצועות דקות של סרט פרפין על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית.

פיבט 7.5 טיפות microliter של תערובת FA על החלקת זכוכית מצופה סרט פרפין עם מפרידים רווחים, הצבת שמונה עד 10 טיפות מסודרים בשתי שורות. השתמש micropipette להעביר שלושה עד חמישה COCs למרכז טיפת FA, יחד עם נפח מינימלי של אמצעי התבגרות. הוסף 7.5 מיקרוליטרים של פתרון טרומבין על גבי כל טיפת FA כדי לכסות אותו.

אין צורך לערבב אותם כי הג'ל נוצר כמעט מיידית. מכסים את תא הדגירה במגלשת זכוכית שהוכנה בעבר, ואז הופכים את התא ומנחים אותו בצלחת פטרי 100 מ"מ מרופדת בנייר מסנן לח. שים את צלחת פטרי ב 5% פחמן דו חמצני ב 38 מעלות צלזיוס אינקובטור במשך חמש עד שבע דקות.

לאחר הדגירה, מעבירים כל קפסולת FA לתוך באר של צלחת 96 באר המכילה 100 microliters של מדיום התבגרות. כל יומיים, החלף חצי מהמדיום במדיום התבגרות טרי שמצוייד מראש. COC תמונה משתמש במיקרוסקופ אור הפוך בהגדלה של פי 10.

לאחר culturing COCs במשך ארבעה ימים, להסיר את מדיום ההבשלה מן הבארים ולהוסיף 100 microliters של 10 יחידות בינלאומיות לכל מיליליטר אלג'נית lysate ב DMEM. השאירו את צלחת התרבות באינקובטור למשך 25 עד 30 דקות. הסר את ה- COCs מהכמוסות המומסות.

לשטוף אותם DMEM מספר פעמים, ולאחר מכן להעביר אותם לטבעת הפנימית של צלחת IVF המכיל PBS. הפוך מיטה של חמישה גרם של אבקת FEP בצלחת פטרי 30 מילימטר. הפץ טיפה אחת של מדיום התבגרות המכילה שלושה עד חמישה COCs על אבקת FEP.

לסובב את הצלחת בעדינות בתנועה מעגלית כדי להבטיח כי החלקיקים לכסות לחלוטין את פני השטח של טיפת הנוזל וליצור גולות נוזליות, או LMs. להכין כמה 60 מילימטר IVF פטרי מנות, ולהוסיף שלושה עד ארבעה מיליליטר של מים סטריליים לטבעות החיצוניות כדי ליצור תא לחות. להרים את LM נוצר עם פיפטה 1000 microliter ולמקם אותו לתוך באר המרכזית.

דגירה הגולות במשך ארבעה ימים ב 38 מעלות צלזיוס באינקובטור 5 אחוז פחמן דו חמצני. כדי לשנות את המדיום, להחיל 30 microliters של מדיום התבגרות על כל LM, אשר יגרום לו להתפשט. כאשר תכולת השיש מתמוססת, מעבירים את ה- COCs המשתחררים מהכור הביולוגי לירידה של מדיום התבגרות טרי בצלחת פטרי.

לאחר שלוש עד ארבע שטיפות במדיום התבגרות, מעבירים את ה- COCs, יחד עם 30 מיקרוליטרים של מדיום טרי, למיטת אבקת FEP. בעדינות לסובב את הצלחת בתנועה מעגלית כדי להבטיח כי חלקיקי האבקה לכסות לחלוטין את פני השטח של טיפת הנוזל ו ליצור LM חדש.לאחר מכן, להעביר את LM לצלחת IVF פטרי. שתי מערכות ההבשלה במבחנה ייצרו COCs עם תאי גרנולוזיס שהיו דבקים זה בזה בחוזקה ושכבות שלמות של תאי קומולוס.

ניתוח הכדאיות של COC אישר כי תנאי צמיחה אופטימליים הושגו בשתי מערכות אנקפסולציה. בשתי הקבוצות נצפו רק אתרי אוציטים בעלי כדאיות גבוהה. הוציטים דימוי עם מיקרוסקופ אלקטרונים שידור.

המיטוכונדריה חולקה באופן שווה והייתה לה צורה דמוית קליפה. רק מעטים מהם התארכה והאשכולות שלהם נצפו באופן ספורדי. ריקולום אנדופלסמי היה קשור למיכוכונדריה או בחינם בציטופלסמה של הוציטים.

טיפות נוזליות הופיעו כמבנים קטנים, כהים ועגולים, ומנגנון גולגי הגיח עם ציסטה שונה. חשוב להיות מדויקים וזהירים בעת העברת קפסולות FA תא הדגירה לתוך צלחות תרבות וכאשר להרים ולהעביר LM בפורמט לתוך צלחת IVF פטרי.