הפעלה אופטוגנטית של מסלולים אפרנטיים בפרוסות מוח וויסות תגובות על ידי הרדמה נדיפה

ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לחקור אם חומרי הרדמה נדיפים משבשים תקציר מסוים יותר מאחרים, כדי לקבוע אם ההשפעות שלהם הן סוג תא או כספציפיות למסלול, וכדי לקבוע אילו השפעות מתרחשות ברמת האוכלוסייה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הספציפיות שבה אנו יכולים להעריך את ההשפעות של חומרי הרדמה נדיפים. אנו יכולים למקד מסלולים וסוגי תאים ספציפיים בפעילות אוכלוסייה בו-זמנית.

התחל בהכנת גוש הרקמה לחתך. הרם בעדינות את המוח מחלל הגולגולת והניח אותו על נייר הסינון. בצע חתך לאורך המישור הסגיטלי של המוח במקביל לקו האמצע והנח את גוש הרקמה על מישור סגיטלי זה.

הנח את נייר הסינון מעל התבנית החוסמת, ויישר את המוח עם קווי המתאר של התבנית הבסיסית. בצע חתך מקביל במישור העטרה כפי שמצוין על ידי הקווים בתבנית, הוסף טיפה קטנה של aCSF פרוסה כדי לשמור על נייר הסינון רטוב במידת הצורך. הנח את גוש הרקמה בארבע מעלות צלזיוס תוך חיתוך aCSF והחל כמות קטנה של דבק על שלב הדגימה הקרה כקרח.

הרם את גוש הרקמה מה-aCSF החיתוך והניף עודפי תמיסה בעזרת פינה של מגבת סופגת. הדביקו את המישור העטרתי האחורי של גוש הרקמה לשלב הדגימה כאשר המשטח הגבי של המוח פונה ללהב הספיר. אוספים פרוסות מוח קורונליות בעובי 500 מיקרומטר ומניחים אותן על רשת ניילון ב-34 מעלות צלזיוס תוך חיתוך aCSF.

הניחו למיכל להגיע לטמפרטורת החדר. להכנת שקיות aCSF ניסיוניות עם איזופלורן מומס, הוסף 600 מיליליטר של aCSF ניסיוני ו-600 מיליליטר של תערובת גז 95% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני לשקית גז פוליטטרפלואורואתילן ריקה. סמן את בקרת התיק הזו.

הוסף 300 מיליליטר של aCSF ניסיוני לשקית גז פוליטטרפלואורואתילן אחרת, וסמן את השקית הזו איזופלורן. המשך בהכנת שקית האיזופלורן לפי הוראות כתב היד. הגדר את פרוטוקולי הדמיית האור על ידי הקצאה אקראית של צורות גל לכל פרופיל.

כל פרופיל עם צורת הגל שהוקצתה לו מתאים לפולס טריגר אחד מכניסת TTL דיגיטלית או ניסוי אחד. בסיום, שמור את רצף הפרופיל. כדי למקם את הגשושית הרב-ערוצית בשקופית רקמת המוח ex vivo, החדרת aCSF ניסיוני מבעבע במהירות של שלושה עד שישה מיליליטר לדקה, והעבירו את פרוסת המוח המכילה את אזור העניין לרשת הרשת בתא הזלוף של המיקרוסקופ.

עוגן את פרוסת המוח עם נבל פלטינה. סובב את רשת הרשת כך שקו מגעי האלקטרודה בקצה הדיסטלי של הגשושית הרב-ערוצית יהיה בערך בניצב למשטח הקליפה. תחת תאורת שדה רחבה ובקרה עדינה של המיקרומניפולטור, הורד את הגשושית הרב-ערוצית לכיוון פני השטח של הפרוסה.

הפעל את קוביית המסנן המתאימה להדמיה של חלבון המדווח הפלואורסצנטי המתבטא במסופי אקסון של מוליכים בקליפת המוח. במידת הצורך, סובב את הפרוסה כדי ליישר בצורה מדויקת יותר את הגשושית עם משטח הקליפה. מקם את הגשושית ממש מעל מישור הפרוסה במרחק של 200 מיקרומטר ממיקום המטרה הסופי לאורך ציר ה-x, והשאיר לפחות תעלה אחת מחוץ לאזור הרקמה הרשומה.

הכנס לאט את הגשושית לפרוסה לאורך ציר האורך שלה. כדי למזער את הנזק לרקמה, קדם את הגשושית רק במידה שהקצוות החדים נראים רק מתחת לפני השטח של הרקמה. החלף את מקור ה-aCSF הניסיוני לתמיסת בקרה בשקית וזהה את התא המסומן בשקית להקלטת מהדק תיקון ממוקד.

הגבל את הצמצם לקוטר הקטן ביותר והפעל את מטרת הטבילה במים בעוצמה גבוהה, תוך הקפדה על הימנעות ממגע בין הגשושית הרב-ערוצית לעדשת האובייקטיב. הביאו את הרקמה למיקוד. מרכז את האור על אזור רקמה הסמוך אך לא חופף לבדיקה הרב-ערוצית.

הפעל את ערכת המסננים המתאימה כדי לאפשר הדמיה של תאים המבטאים את הסמן הפלואורסצנטי התלוי ב-Cre. הרם את עדשת האובייקט כדי ליצור מקום מספיק להורדת פיפטת תיקון. טען פיפטת תיקון עם תמיסה פנימית והרכיב אותה על מחזיק האלקטרודה.

השתמש במזרק מיליליטר אחד כדי להפעיל לחץ חיובי המתאים לכ-0.1 מיליליטר אוויר. הורד את פיפטת המדבקה לתוך התמיסה המביאה את הקצה למיקוד בהנחיה חזותית, וקבל תיעוד תא שלם מהתא הממוקד. החיות ששימשו בפרוטוקול זה ביטאו חלבון מדווח פלואורסצנטי tdTomato בסומטוסטטין או באינטרנוירונים חיוביים לפרוואלבומין.

אינטרנוירונים אלה היו מיועדים להידוק טלאי בהנחיה חזותית עם קוביית הסינון המתאימה מופעלת. פוטנציאלים פוסט-סינפטיים נצפו באינטרנוירונים בתגובה לרכבת של ארבעה פולסים של שתי אלפיות שנייה של אור. פוטנציאל שדה מקומי נרשם גם כן.

צפיפות המקור הנוכחית ופעילות מרובת יחידות הופקו מפוטנציאל השדה המקומי. משרעת כיורי הזרם המופקים מצפיפות מקור הזרם גדלה כפונקציה של עוצמת האור. משוואה לוגיסטית לא ליניארית של שלושה פרמטרים התאימה לנתונים לצורך השוואות בין מסלולים.

משרעת הפוטנציאל הפוסט-סינפטי גדלה גם היא עם משרעת כיור הזרם. תגובות סינפטיות לתשומות התלמוקורטיקליות והקורטיקו-קורטיקליות נמדדו בתנאי בקרה, איזופלורן והתאוששות. תגובות פוסט-סינפטיות של גירויים סומטוסטטין וקורטיקו-קורטיקליים וכיורי הזרם המעוררים דוכאו בתנאי איזופלורן.

בעת הכנת פרוסות המוח, שמירה על בריאות הרקמה היא בעלת חשיבות עליונה. חשוב לשמור על הרקמה קרירה לאורך כל הליך החיתוך, לעבוד במהירות מבלי לפגוע ברקמה. הקלטות חוץ-תאיות רב-ערוציות עשויות להיות מעובדות לאחר מכן במגוון דרכים.

לדוגמה, סינון מעביר גבוה של אות הפס הרחב מבודד את פעילות הזינוק באוכלוסייה בעוד שחישובי צפיפות המקור הנוכחיים מדגישים פעילות סינפטית. יחד, טכניקות אלה אפשרו לנו לחקור את השפעות ההרדמה על רכיבים מבודדים ספציפיים של מעגלים בקליפת המוח, ולספק תובנה לגבי המנגנונים העומדים בבסיס אובדן ההכרה in vivo.