צינור באמצעות אלקטרופורציה דו-צדדית ברחם כדי לחקור השפעות גנטיות על התנהגות מכרסמים
21 במאי 2020
התפקיד של גנים הקשורים למחלות שהתגלו לאחרונה בפתוגנזה של הפרעות נוירופסיכיאטריות נשאר מעורפל. דו-צדדי שונה בטכניקת אלקטרופורציה ברחם מאפשר העברת גנים באוכלוסיות גדולות של נוירונים ובחינת ההשפעות הסיבתיות של שינויים בביטוי גנים על ההתנהגות החברתית.
שימוש בשיטה זו יכול לאפשר גילוי כיצד שינויים מסוימים בביטוי גנים יכולים לייחס לפתולוגיות הקשורות למחלות נוירולוגיות. היתרון של טכניקה זו הוא שהיא עוקפת את הצורך ליצור או לרכוש קווים גנטיים של בעלי חיים שיכולים לקחת שנים ליצור ולתקף. טכניקה זו מאפשרת לחקור גנים המעורבים בהפרעות נוירולוגיות.
קביעת האופן שבו גנים ספציפיים תורמים לפתולוגיה היא צעד חשוב בפיתוח טיפולים חדשים. היתרון של פרוטוקול זה הוא ללמוד לתמרן את העוברים כך שהנסיין ישלים את שלב העברת הגנים מבלי להפחית את שיעורי ההישרדות. הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה מכיוון שהעוברים שבירים מאוד ולכן מועיל לראות כיצד נסיין מנוסה מתמרן אותם במהלך ההליך.
הביאו סכרים בהריון לאזור הניתוח לפחות 30 דקות לפני הניתוח. עקר את כל אתר הניתוח באמצעות מגבונים קוטלי חיידקים מעוקרים ולאחר מכן אתנול 70%. ואז לעקר כלי חיטוי במעקר חרוזי זכוכית.
העבירו PBS סטרילי לצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר והניחו את הצינורות באמבט מים שחומם ל-38 עד 40 מעלות צלזיוס. בדוק את טמפרטורת המלח הסטרילית בעזרת מדחום. הפעל את משאבת זרימת חימום המים כך שהיא תתחמם ל -37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן הפעל את מזרק הלחץ והאלקטרופוטור והקפד על תפקוד תקין. סובב בקצרה את תמיסת ה-DNA של הפלזמה על צנטריפוגה על השולחן והנח אותה על קרח. משוך פיפטות זכוכית על חולץ פיפטות כך שקצה פיפטת הזכוכית הנמשכת יהיה בקוטר של כ- 50 מיקרומטר.
לאחר מכן מלאו את הפיפטה ב -20 עד 40 מיקרוליטר של תמיסת DNA. הגדר את כל הפריטים הדרושים לניתוח כולל קרם להסרת שיער, יוד, אתנול 70%, צמר גפן, טיפות עיניים, תפרים וגזה. הכינו דף ניתוח ומלאו את הפרטים הדרושים.
שקלו את העכבר לפני הניתוח ורשמו את המשקל. לאחר הרדמת העכבר, יש לתת משככי כאבים לפני הניתוח ולהסיר את הפרווה מהבטן באמצעות קרם להסרת שיער או סכין גילוח. עקר את הבטן על ידי ספיגתה ביוד פובידון ואתנול 70% שלוש פעמים.
צור שדה סטרילי סביב הבטן עם גזה סטרילית ווילונות. בצע חתך בקו האמצע בעור הבטן תוך הרמת העור כלפי מעלה בעזרת מלקחיים כדי למנוע חיתוך דרך השריר. לאחר מכן הרם את השריר למעלה וחתוך אותו תוך הקפדה להימנע מחיתוך איברים חיוניים.
משוך בזהירות את קרני הרחם מהסכר באמצעות מלקחיים טבעתיים והנח אותן בעדינות על השדה הסטרילי וודא שהן נתמכות בריפוד ואינן מושכות רחוק מדי מהסכר. שמור על קרן הרחם לחה לאורך כל שאר הניתוח עם PBS סטרילי שחומם מראש. מקם עובר בעזרת מלקחיים או אצבעות, ולאחר מכן הכנס בזהירות את פיפטת הזכוכית המשוכת לתוך האנך הצדדי והזריק שניים עד שלושה מיקרוליטר לכל חדר על ידי הכנסת הפיפטה לחדר אחד ולאחר מכן לחדר השני.
החדר ממוקד בהצלחה אם קיימת צורת סהר לאחר ההזרקה. כדי להעביר תאים באופן דו-צדדי בקליפת המוח הקדמית, מקם את שתי האלקטרודות השליליות בצידי ראש העובר רק לרוחב ומעט זנב לחדרים הצדדיים ומקם את האלקטרודה החיובית בין העיניים ממש מול החוטם המתפתח. ודא שהעובר מרטיב בנדיבות והחל ארבע פולסים מרובעים.
להזריק ולאלקטרופאט את כל העוברים, בזה אחר זה כך שכל עובר עובר אלקטרופוטציה מיד לאחר הזרקת תמיסת ה-DNA. לאחר שכל העוברים עברו אלקטרופורציה, הכנס בזהירות את קרני הרחם בחזרה לחלל הבטן. מצפים את חלל הבטן ב-PBS סטרילי כדי לסייע במיקום קרן הרחם.
מלאו את חלל הבטן ב-PBS סטרילי כך שלא יישארו כיסי אוויר לאחר השלמת התפירה. לתפור את השריר בתפרים נספגים ואת העור בתפרי משי שאינם נספגים. אפשר לסכר להתאושש לחלוטין בתא מחומם למשך שעה לפחות.
בדקו את הסכרים באופן קבוע ב-48 השעות הקרובות. כאשר הסכר מתאושש מההרדמה וחוזר להכרה, הוא יתחיל לנוע ולהקציף. שיטה זו שימשה להעברת כ-5,000 נוירונים פירמידליים בשכבה 2/3 עם הפלסמיד pCAG-GFP.
רוב התאים הללו היו ממוקמים באזורים הקדמיים של קליפת המוח. דוגמה מייצגת מציגה את ההתפלגות הזנבית הרוסטרלית של נוירונים שעברו טרנספטציה בעכבר ביקורת בוגר, המאשרת את יכולתם של IUEs דו-צדדיים למקד ולתייג גנטית אוכלוסיות גדולות של נוירונים פירמידליים בקליפת המוח הקדמית. החלק הראשון של משימת האינטראקציה האימהית בודק את יכולתם של עכברי ביקורת P18 שעברו טרנספטקטציה למצוא מצעי קן.
עכברי ביקורת בילו יותר זמן בחקר מצעי הקן שלהם מאשר בחקר מצעים טריים, מה שמרמז על כך שיש להם יכולות מוטוריות חושיות שלמות והתנהגות חקרנית. החלק השני של המשימה מנצל את הנטייה של עכברים להיות בעלי מוטיבציה לקיים אינטראקציה עם אמם. במשימה זו, גורים בילו את רוב זמנם ליד אמם תוך שהם מבלים פחות זמן בחקר הכוס הריקה או מצעי הקן.
עכברי ביקורת בוגרים בילו כ-35% מהזמן בחקר אובייקט חדש. כאשר הוצגו להם רומן וחפץ מוכר, עכברים בוגרים בילו זמן רב יותר בחקר האובייקט החדש. במשימת החברותיות, עכברי ביקורת בוגרים בילו כמויות דומות של זמן בחקר עכבר חדש וכוס ריקה.
מעקב אחר התנהגות זו בוצע באופן אוטומטי באמצעות תוכנת DeepLabCut על ידי תיוג נקודות שונות בעכבר, כולל הגפיים, המרכז, הראש והאוזניים. התוכנה שימשה גם כדי לקבוע מתי עכברים מגדלים על ידי בחינת אורך גוף העכבר מכיוון שמרחק זה מתקצר כאשר העכבר מסתובב. בעקבות הליך זה, ניתן לענות על שאלות מולקולריות תאיות רבות על ידי בחינת הרקמה ובדיקת מדדים שונים כגון צפיפות עמוד השדרה או רמות ביטוי של חלבונים שונים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את תפקידם של גנים הקשורים למחלות בפתוגנזה של הפרעות נוירופסיכיאטריות, באמצעות שימוש בטכניקה מודגית של אלקטרופורציה דו-צדדית ברחם (in utero electroporation). טכניקה זו מקלה על העברת גנים לאוכלוסיות גדולות של נוירונים, ובכך מאפשרת לבחון שינויים בביטוי גנים ואת השפעתם על התנהגות חברתית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- הפרעות נוירופסיכיאטריות
- ביטוי גנים ופתולוגיה
- הערכת התנהגות חברתית
רקע
- הבנת תפקידם של גנים במחלות נוירולוגיות היא חיונית לפיתוח טיפולים.
- שיטות קונבנציונליות ליצירת קווי בעלי חיים גנטיים הן ארכות תהליך ודורשות משאבים רבים.
- טכניקת האלקטרופורציה המשופרת מגבירה את שיעורי ההישרדות של העוברים במהלך הניסוי.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- אלקטרופורציה דו-צדדית ברחם להעברה של גנים
- עוברי עכבר
- הליכים הכוללים הזרקת DNA ואלקטרופורציה
תוצאות עיקריות
- טרנספקציה מוצלחת של נוירונים פירמידליים בשכבה 2/3 עם פלסמיד GFP בקורטקס הפרונטלי.
- עכברי בקרה הפגינו התנהגות חקירה רגילה ואינטראקציות חברתיות, מה שמעיד על יכולות סנסורי-מוטוריות תקינות.
- המתודולוגיה מאפשרת ביצוע של חקירות תאיות ומולקולריות בהמשך.
מסקנות
- המחקר מדגים שיטה מהימנה לשינוי ביטוי גנים בעוברים של עכברים, המסייעת להבנת הפרעות נוירופסיכיאטריות.
- טכניקה זו רלוונטית למחקרים עתידיים בגנטיקה ובביולוגיה של ההתפתחות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
אלקטרופורציה דו-צדדית ברחם (Bilateral in utero electroporation) מאפשרת מניפולציה גנטית מהירה וספציפית לסוגי תאים במודלים של מכרסמים, ובכך עוקפת את הפיתוח הממושך של קווי תרנסגנים. גישה זו מאיצה את בחינת תפקוד הגנים בהתפתחות העצבית ובהתנהגות, ותומכת בתיקוף של מטרות בשלבים מוקדמים עבור פורטפוליו של מחלות נוירולוגיות. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בקישור בין הפרעות גנטיות לפנוטיפים תפקודיים, ובכך מספקת מידע לקבלת החלטות על קידום מבוסס ניהול סיכונים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של תפקוד גנים הקשורים למחלות in vivo ללא צורך ביצירת קווי טרנסגניתים.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבהרת תרומת הגנים להתפתחות מעגלים עצביים ולהתנהגות.
- מקל על בדיקה מהירה של היפותזות עבור מטרות גנטיות חדשות שזוהו במחקרי אסוציאציה.
- משפר את הביטחון החזוי בבחירת מטרות עבור אינדיקציות נוירופסיכיאטריות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין מודלים מאושרים של מכרסמים עבור בדיקות התנהגותיות ומולקולריות המשך.
- מנ 표준טי את העברת הגנים לאוכלוסיות נוירונליות גדולות, ובכך תומך בדבקיות התוצאות.
- מאפשר קריאות התנהגותיות כמותיות באמצעות תוכנה למעקב אוטומטי.
- תומך בהערכה ניתנת להרחבה של מספר מבני גנטיים במקביל.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מניפולציה גנטית למעגלים עצביים הרלוונטיים למחלה ולנקודות קצה התנהגותיות.
- מספקת רצף מגילוי גנטי ועד לתיקוף תפקודי במודלים פרה-קליניים.
- מאפשרת הערכה של ביומרקרים תרגומיים כגון ביטוי חלבון וצפיפות קוצים.
- מפחיתה סיכונים בקידום מטרות גנטיות על ידי קישור שינויים מולקולריים לפנוטיפים ניתנים לצפייה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות גנטיות מוקדמות ועד לתיקוף התנהגותי פרה-קליני, ובכך היא תומכת בזיהוי מועמדים פוטנציאליים (leads) ובצמצום סיכונים מכניסטיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בחקירה מונחית-השערה של תפקוד גנים בהתפתחות עצבית ובהתנהגות.
- סריקה: מספקת תוצרי התנהגות ומולקולות כמותיים וניתנים לשחזור לצורך ניתוח השוואתי.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה אוטומטית של נקודות קצביות התנהגותיות ומסמנים מולקולריים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאי קשר גנטי לתוצאות תפקודיות במערכות הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר להערכה מהירה של מטרות גנטיות מגוונות על פני אינדיקציות נוירולוגיות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מייעל את זרימות העבודה של מניפולציות גנטיות ומשפר את השחזוריות.
- ערך אסטרטגי: מאיץ החלטות "המשך/עצור" (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון בשלבי הגילוי המוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של מטרות גנטיות עבור תוכניות למחלות נוירולוגיות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במניפולציות עובריות ובטכניקה כירורגית.
- נדרשת גישה לציוד אלקטרופורציה, כלי ניתוח סטריליים ותוכנה למעקב התנהגותי.
- נדרשת סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לצורך הדירות והשוואת נתונים.
- ייתכן הצורך בהתאמות עבור זני מכרסמים שונים או שלבים התפתחותיים שונים.
- שבריריות העוברים ושיעורי ההישרדות מהוות מגבלות מעשיות הדורשות טיפול מיומן.
