Name: חקירת תנועתיות מונחית פלאגלה באשריציה קולי על ידי יישום שלוש טכניקות מבוססות בסדרה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: חקור תנועתיות חיידקית מונחית פלאגלה באשריצ'יה קולי באמצעות שלוש טכניקות מבוססות בסדרה. השיטות מאפשרות ניתוח תנועה פרטנית וקולקטיבית ותורמות להבנת התנהגות פתוגנית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק GM118085 ובחלקו על ידי קרן רוברט וולש (מענק F-1811 ל- R.M.H.).

1. בידוד מוטציות מדכאות בזנים חסרי תנועתיות
הערה: השתמש בשיטה זו כ'מלכוד הכל ' רחב כדי לזהות את האופי הכללי של פגם תנועתיות.
<ol><li>הכנת צלחת אגר רכה הערה: רך אגר, המכונה גם תנועתיות - או לשחות אגר, הוא אגר אחוז נמוך (~ 0.2-0.35% w / v), ארוך המשמש כדי assay chemotaxis31,32.<ol>
<li>יש להוסיף 3 גרם של bacto-agar (0.3% w/v) ו-20 גרם של LB לבקבוקון תחתון עגול בנפח 2 ליטר. מוסיפים לבקבוקית 1 ליטר של ddH2O (מים מזוקקים כפולים) ומערבבים באופן שווה את המתלים באמצעות מוט ערבוב וצלחת ערבוב מגנטית.</li>
		<li>כלave אוטומטית במשך 20 דקות ב 121 °C (70 °F).</li>
		<li>אפשר להתקרר עם עצבנות עדינה באמצעות המוט / צלחת כמו לעיל. כאשר הטמפרטורה מגיעה כ 50 °C (50 °F), לשפוך 25 מ"ל לתוך מנות פטרי סטריליות (100 מ"מ x 15 מ"מ), ולאפשר אגר מותך להגדיר עם מכסה במקום לפחות 1 שעה, לשימוש בתוך 16 שעות.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת תרבות, חיסון ובידוד של מוטנטים מדכאים הערה: E. coli מחוסן במרכז של מדיה עשירה בחומרים מזינים מוצק עם אגר רך לצרוך חומרים מזינים באופן מקומי, יצירת שיפוע מתזונה שהם עוקבים. כשהם נעים החוצה, מופיעות 'טבעות' מוגדרות (איור 1A), הקשורות לכימותרפיה ספציפית שהחיידקים מגיבים לה. פגמים במערכת chemotaxis או רכיבים מבניים של מנוע flagella יכול לסכן את הביצועים ב- assay זה. לעתים קרובות, מוטנטים עם יתרון תנועתיות מתעוררים במהלך ההקרנה, וניתן לראות אותם מגיחים מנקודות בודדות או ממספר נקודות לאורך הפריפריה של הטבעת, משם הם "מתלקחים" החוצה (איור 1C). ישימו לב שהקצה החיצוני ביותר של חזית השחייה מנוגד בקלות לאגר הבתולה הרכה הלא מכובסת.<ol>
<li>לגדל תרביות לילה של זן תנועתיות-לקוי הרצוי ב 5 מ"ל של מרק לנוקס (LB; 10 גרם / L טריפטון, 5 גרם / L תמצית שמרים, ו 5 g / L NaCl, שולחן חומרים) ב 30 °C עם רעד אופקי (220 r.p.m.). למחרת, תת-תרבות (1:100 דילול) ב- LB טרי, גדל באותם תנאים לשלב מעריכי (OD600 של 0.6).</li>
		<li>לחסן 6 μL של התרבות למרכז צלחת אגר רך (1.1) באמצעות pipette, דוחף את הקצה סטרילי טעון לתוך אגר לגרש בעדינות את התוכן. מעבירים ל-30 מעלות צלזיוס ודגרה (איור 1B),עד ל ניכרים "התלקחויות" תנועתיות, הנובעות מנקודת החיסון או מהפריפריה של טבעות תנועתיות, בדרך כלל ב-24-36 שעות(איור 1C). הערה: בבוחות תנועתיות, לחסן זן מסוג פראי לצד המבודדים המוטנטיים לשם השוואה. זן בר זה יציג את הטבעות הכימיות הקונצנטריות האופייניות (איור 1A) וימלא את הצלחת בתוך 8-10 שעות.</li>
		<li>השתמש בלולאת תיל סטרילית כדי להרים את התאים מאזור 'התלקחות' ולפגוע כדי לטהר מושבות בודדות על צלחת אגר קשה LB (LB מוכן כנ"ל, מגובש עם 15 גרם / L bacto-אגר).</li>
		<li>בחרו מושבות בודדות מצלחת הפס באמצעות לולאת תיל סטרילית וטוהרו מחדש על ידי פסים למושבות בודדות כדי להבטיח בידוד של מבודד מושבה 'טהורה'.</li>
	</ol></li>
	<li>אישור, ואפיון של מוטציות מדכאות
	<ol>
<li>אשר שהמוטנטים המבודדים החזירו את תנועתיותם. הכן לוחות אגר רכים (1.1), ותרבויות לזנים מעניינים (כמו ב-1.2.1), כולל סוג פראי ומתח 'חסר תנועתיות' התחלתי להשוואה.</li>
		<li>לחסן את הצלחות (כמו 1.2.2) ודגור ב 30 °C (8-10 שעות.</li>
		<li>להקליט את הקוטר של הטבעת החיצונית ביותר (קצה המעגל) ולהשוות כדי לקבוע מי של מבודדים יש תנועתיות משוחזרת באופן משמעותי. הערה: מומלץ לצלם צלחות לאורך כל מהלך הניסוי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש בהתקן "דלי של אור"30, שבו מצלמה דיגיטלית מותקנת מעל מקור אור להארה טובה יותר כדי למדוד את הקוטר של מושבת השחייה ולהבדיל אותו אגר לא קוטבי.</li>
		<li>הנבדק אומת מבודד ל- WGS כנדרש, ומאפשר 'כיסוי רצף' מספיק כדי לזהות באופן חיובי את המוטציות ששיקמו פונקציה מסוג בר.</li>
	</ol></li>
</ol>2. כימות התנהגות מוטורית פלאגלה באמצעות קשירת תאים
הערה: השתמש בשיטה זו כאשר נראה שהתנהגות רגילה של ריצה-נופלת (chemotaxis) נפגעת.
<ol><li>
הכנת תרבות וגזלת דגלה
	<ol>
<li>הכן תרבות שלב מעריכית של זן העניין כמתואר בשלב 1.2.1.</li>
		<li>פלט 10 מ"ל של תאים לפי צנטריפוגה ב 2,000 x גרם במשך 3 דקות לפני הוצאה חוזרת ב 10 מ"ל של מאגר תנועתיות מעוקר מסנן (MB; 10 mM אשלגן פוספט חוצץ [0.0935 M K2HPO4, 0.0065 M KH2PO4, pH 7.0], 0.1 mM EDTA [pH 7.0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl). הערה: MB תומך תנועתיות, אבל אינו תומך בצמיחה חיידקית</li>
		<li>חזור על שלב 2.1.2 פעמיים נוספות לפני ususpending הכדור הסופי ב 1 מ"ל של MB.</li>
		<li>מעבירים את ההשעיה של התא למזרק של 1 מ"ל ומצמידים מחט 23G לסוף. להרכיב מזרק זהה / מחט מנגנון ולחבר את השניים יחד באמצעות 6 אינץ 'של צינורות פוליאתילן (קוטר פנימי של 0.58 מ"מ) נדן בחוזקה על כל קצה מחט.</li>
		<li>גנו את הדגלה (הם שבירים ונשברים בקלות) על ידי העברת מתלה התא בעדינות הלוך ושוב ממזרק אחד לשני 50x, עם הפסקות של דקה אחת בין כל 10 מעברים.</li>
		<li>צנטריפוגה התאים הגוזלים ב 2,000 x g במשך 3 דקות resuspend בנפח סופי של 500 μL של MB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת שקופיות וקשירת תאים
	<ol>
<li>הכן תא קיבוע תאים על-ידי ערימת כיסוי 18 מ"מ x 18 מ"מ מעל שקופית מיקרוסקופ זכוכית בגודל 3 אינץ' x 1 אינץ' x 1 מ"מ, המופרדת באמצעות סרט דו-צדדי(איור S1).</li>
		<li>לשטוף את התא עם 0.01% (w/v) פתרון פולי-ליסין על ידי החלה על החלק העליון של התא. הטה את הקצה התחתון (כיסוי ריק עם שקופית המיקרוסקופ) על מגב משימות (נייר טישו) כדי לעזור לצייר פתרון דרך התא(איור S1). לאחר מכן לדגור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.</li>
		<li>לשטוף את התא שלוש פעמים עם 40 μL של MB באמצעות כמתואר בשלב 2.2.2</li>
		<li>הוסף 40 μL של השעיית תא גיהון (מוכן לעיל) לחלק העליון של התא ודגור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות כדי לאפשר לתאים להתחבר כיסוי.</li>
		<li>יש לשטוף בעדינות את התא עם 40 μL של MB כמו ב 2.2.3 כדי להסיר תאים לא מחוברים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הקלטה וכימות סיבוב תאים
	<ol>
<li>העבר את שקופית המיקרוסקופ העמוסה בתאים קשורים לשלב המיקרוסקופ.</li>
		<li>באמצעות מיקרוסקופיה משולבת פאזה ומטרה 100x, לסרוק את האוכלוסייה עבור תאים קבועים במקום, ומסתובב על ציר אחד, כלומר, סיבובים חלקים על נקודה קבועה במקום להציג בזווית שבה התא נע פנימה והחוצה של המוקד (וידאו 1).</li>
		<li>השתמש במיקרוסקופ מסחרי ובמצלמה משויכת. פתח את התוכנה המשויכת, ודא שתאי העניין נמצאים במוקד ולחץ על רכישת וידאו כדי להקליט את סיבוב התא למשך דקה אחת (ב- 10 פריימים לשנייה ומעלה).</li>
		<li>מהפעלת וידאו, לכמת את מספר הסיבובים המלאים לדקה ואת מספר הפעמים שהתא משנה כיוון (תדירות מיתוג). הערה: מהירויות סיבוב ותדירות מיתוג עשויות להיות מהירות מדי לאמוד אחר עין ולכן מומלץ להשתמש בתוכנת וידאו המציעה הפעלה איטית / עדינה, או מאמצת מערכת תוכנה אוטומטית לכימות דפוסי סיבוב33. חלופה תהיה להגדיל את הצמיגות של MB באמצעות תאית מתיל (או סוכן דומה) כדי לעזור להאט ולפתור את הסיבוב של חיידקים מהירים יותר או לפצות כאשר מצלמות עם קצבי מסגרת נמוכים נמצאים בשימוש.</li>
		<li>חזור על שלב 2.3.2 עם שכפולים ביולוגיים כדי להרכיב ייצוג של אוכלוסיית העניין.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הכנת נחילים בבדיחת מעבר גבול
הערה: השתמש בשיטה זו להערכת ההשפעה של מוטציה או תנאי על תנועתיות קבוצתית. נחיל אגר מתייחס אגר שבו האחוז הוא בדרך כלל גבוה יותר מזה של אגר רך. באגר רך (0.3 %), תאים שוחים בנפרד בתוך אגר. באגר נחיל (0.5% ומעלה), התאים נעים כקבוצה על פני השטח. בעוד לוחות נחיל חייב לשמש כמפורט כאן, צלחות שחייה יש חיי מדף ארוכים יותר, והוא עשוי לשמש במשך כמה ימים. ההעדפה האישית שלנו היא להשתמש בעוד 1-2 ימים.
<ol><li>
הכנת אגר נחיל
	<ol>
<li>הוסף 5 גרם של אגר אייקן (0.5% w/v) ו-20 גרם של LB לבקבוקון תחתון עגול של 2 ליטר. מוסיפים 1 ליטר של ddH2O לבקבוק ומערבבים באופן שווה את המתלים באמצעות מוט ערבוב וצלחת ערבוב מגנטית.</li>
		<li>כלave אוטומטית במשך 20 דקות ב 121 °C (70 °F).</li>
		<li>אפשר להתקרר עם עצבנות עדינה כדי למנוע בועות אוויר באמצעות המוט / צלחת כמו לעיל. כאשר כ 50 °C (50 °F), להוסיף גלוקוז מעוקר מסנן לריכוז סופי של 0.5 %.</li>
		<li>יוצקים 25 מ"ל לתוך מנות פטרי סטריליות (100 מ"מ x 15 מ"מ) ומאפשרים להגדיר בטמפרטורת החדר לפחות 14 שעות ולא יותר מ 20 שעות. אין לאחסן לשימוש עתידי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
חיסון ודגורה של לוחות נחיל
	<ol>
<li>לחסן 6 μL של תרבות מעריכית בינונית (מוכן כמו 1.2) על ידי תצפית על גבי אגר.</li>
		<li>משאירים את המכסה למשך 5-10 דקות ומחליפים כאשר האינוקולום התייבש לתוך משטח אגר.</li>
		<li>דגירה ב 30 °C (50 °F) במשך 8 שעות. הימנע הפיתוי לבדוק את התקדמות הנחיל על ידי הסרת המכסה, שכן זה יתרום לייבוש של אגר ולפגום נחילים. הערה: זמן הדגירה עשוי להשתנות בהתאם פנוטיפ המתח. מוטציות מבודדות מסוימות עלולות לפגוע ביכולת הנחיל ויחייבו אחוז מופחת של אגר או תקופה ממושכת יותר של דגירה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת לוחות אסי של מעבר גבול הערה: בדיקת ישבן זו משתמשת בצלחת פטרי מותאמת, שבה חלוקת פלסטיק (גבול) יוצרת שני תאים, ולא אחד(איור 2A). כל תא יכול להיות מוכן ללא תלות בשני, ומציע תנאים שונים לנחיל, לפני "חיבור" בין השניים. בהתאם לתכנון ניסיוני, ניתן להכין את התא הראשון (המיועד משמאל) עם אגר שחייה (0.3% w/v) או אגר נחיל (0.5% w/v) שממנו החיידקים יכולים לנדוד מעבר לגבול לתא הימני המכיל אגר נחיל +/- כל תוספת או אתגר נדרשים (למשל, אנטיביוטיקה). נדידה על כל אגר נמדדת /בהשוואה בדרך כלל על ידי רישום הקוטר הרחב ביותר של קולוניזציה חיידקית (מקצה לקצה) מנקודת החיסון המקורית.<ol>
<li>הכן אגר שחייה כמתואר ב-1.1 במידת הצורך.</li>
		<li>הכן אגר נחיל כמתואר ב 3.1.</li>
		<li>יוצקים ~ 30 מ"ל של אגר נחיל (עם תוספי הרצוי במידת הצורך) לתא הימני של צלחת פטרי כפולה (100 מ"מ x 15 מ"מ), עד לנקודה שבה הוא מאוזן עם מחיצת הפלסטיק בין התאים, אך לא עולה על גדותיו לשמאל(איור 2B).</li>
		<li>לאחר שהאגאר התקשה, מלאו את התא השמאלי ב-30 מ"ל של שחייה או אגר נחיל, שוב עד כדי מגע עם חלוקת הפלסטיק(איור 2C). לפני שהוא קובע, השתמש בקצה פיפטה סטרילי כדי לגרור בעדינות את הגר מעבר לגבול כדי לחבר את שני הצדדים עם גשר אגר בגובה ~ 1 מ"מ המשתרע על כל אורך החלוקה (איור 2D).</li>
		<li>אפשר לצלחת להתייבש בטמפרטורת החדר (3.1). הערה: שיטה חלופית ליצירת גשר היא לאפשר אגר התא השמאלי להתייבש ולאחר מכן לאט pipette ~ 100 μL של אגר נחיל מותך לאורך מחיצת הפלסטיק לגשר בין שני התאים (3.4). לחסן את הצלחות על התא השמאלי כמפורט לעיל לשחייה (1.2.2) או נחיל (3.2) אגר, לפני הדגירה ב 30 °C (12-16 שעות), או עד נחילים עשו התקדמות מספקת מעל התא הימני כדי לאפשר השוואות בין זנים של עניין.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הבידוד והאפיון של מוטציות מדכאות תרמו בהצלחה לזיהוי מרכיבים מרכזיים של מערכת הכימוטקסי35,36,37, כמו גם את המכונות המוטוריות עצמן38,39,40. בעת השימוש בפרוטוקול 1, חשוב לכלול שכפולים עצמאיים מרובים כדי להבטיח בידוד של ספקטרום גדול של מוטציות אפשריות שיכולות לפצות על אובדן תנועתיות. הגדלת מספר החיידקים על ידי פסים של התרבות בשורה ולא נקודה...

חיידקים מעסיקים נספחים רבים לתנועה ופיזור בנישות האקולוגיות שלהם1. תנועתיות המונעת על ידי פלאגלה היא המהירה שבהן, מקדמת קולוניזציה של אזורים נוחים בתגובה לאותות סביבתיים, ותורמת באופן משמעותי ליכולת הפתוגנית של מינים מסוימים2,3. חיידקים מוכים יכולים לשחות בנפרד בנוזל בתפזורת, או נוהרים כקולקטיב על פני משטח חצי מוצק4. פלאגלה חוץ-תאית מתחברת ומונעת על ידי מנועים סיבוביים המוטמעים בממברנה, אשר רותמים את העוצמה של שיפועי יונים כדי ליצור מומנט שגורם לסיבוב1,2,4,5,6,7,8. ב- E. coli, שהמנועים שלו פועלים על מומנט קבוע9, ניתן לסווג את פלט המנוע במונחים של מהירות סיבובית ומיתוג הרוטור בין כיווני נגד כיוון השעון (CCW) ובכיוון השעון (CW). סיבוב CCW מקדם היווצרות של חבילת flagellar קוהרנטית המניעה את התא קדימה (ריצה), בעוד מתג ארעי בכיוון הסיבוב (CW) גורם לחבילה להתפרק באופן חלקי או מלא10, והתא כדי לכוון מחדש את כיוון השחייה שלו (ליפול). אי קולי בדרך כלל לרוץ לשנייה ליפול במשך עשירית שנייה. תדירות המיתוג של הרוטור או 'הטיית הנפילה' נשלטת על ידי מערכת איתות chemotaxis, שבה chemoreceptors transmembrane לזהות אותות כימיים חיצוניים ולהעביר אותם באמצעות זרחן למנוע flagellar להאריך ריצות בתגובה למשוך, או לדכא אותם בתגובה כימיקלים רעילים11,12. תנועתיות השחייה נמדת ב-0.3% אגר רך.
במהלך ההמולה, חיידקים מנווטים על משטח מוצק למחצה כקולקטיב צפוף, שבו חבילות של חיידקים זורמות בתנועה מסתחררת רציפה2,13,14,15. נחילי E. coli מציגים פיזיולוגיה כימוסנסורית שונה (הטיית טבילה נמוכה יותר), מהירויות גבוהות יותר, וסובלנות גבוהה יותר לאנטי מיקרוביאלים מעל תאים שוחים בנוזל בתפזורת16,17. נחילים משתנים בפריסתם של שפע של אסטרטגיות המסייעות לתנועה, כולל ייצור פעילי שטח, היפרפלציה, והארכות תאים2. נחיל מציע חיידקים יתרון תחרותי הן מבחינה אקולוגית והן בסביבה קלינית18,19,20. ישנן שתי קטגוריות של חיידקים נוהרים: נחילים ממוזגים, אשר יכול לנחיל רק על מדיה מוצק עם 0.5-0.8% אגר, ונחילים חזקים, אשר יכול לנווט על פני ריכוזי אגר גבוהיםיותר 21.
קיימים מגוון של חקירות כדי לחקור תנועתיות שחייה והרגולציה שלה. כאשר הוא נפגע ממוטציות או מתנאים סביבתיים, תנועתיות עצמה מציעה מבחר חזק לזיהוי מוטציות מדכאות רווח-של-פונקציה. מדכאים אלה יכולים להיות חוזרים מקוריים של המוטציה המקורית, או חוזרים מדומים, שבהם מוטציה שנייה משחזרת את הפונקציונליות. מוטציות כאלה ניתן לזהות על ידי ריצוף גנום שלם (WGS). חלופה לבחירת מדכאים משוחדים היא אסטרטגיית מוטה של מוטגנסיס ממוקדת (למשל, מוטאגנסיס PCR). מתודולוגיות אלה שופכות לעתים קרובות אור על התפקוד או הרגולציה הסביבתית של מנגנון תנועתיות. אם המטרה היא ללמוד פונקציה מוטורית, אז שיקום תנועתיות מסוג פראי כפי שנמדד אגר רך לא בהכרח להצביע על שיקום של תפוקת מנוע מסוג בר. הבדיקה הקשורה לתא, שבה תאים מחוברים למשטח זכוכית על ידי flagellum יחיד וסיבוב של גוף התא מנוטר לאחר מכן, יכול להיות הבדיקה הראשונית של בחירה להערכת התנהגות מוטורית. למרות מתודולוגיות מתוחכמות יותר זמינים כעת כדי לפקח על תכונות מנוע, הגדרת המצלמה במהירות גבוהה הנדרשת ויישום של חבילות תוכנה לניתוח תנועה להגביל את השימוש הנרחב שלהם22,23,24,25. ההסרה הקשורה לתא דורשת רק להטות את הדגלה, ומאפשרת חיבור של הסיבים הקצרים למגלשת זכוכית, ואחריה צילום סיבוב גוף התא. למרות שמהירויות המנוע המתועדות נמוכות במיון זה בגלל העומס הגבוה שגוף התא מפעיל על הפלסטלום, ניסיון זה בכל זאת תרם לתובנות יקרות ערך על תגובות כימיות26,27,28,29, ונשאר כלי חקירה תקף כפי שנדון להלן.
תנועתיות נוהרת מציבה בפני החוקרים מערכת אתגרים שונה. מבחר מדכאי ההשגה עובד רק בנחילים המייצרים פעילי שטח בשפע ונוהרים בקלות13. פעילי שטח שאינם מפיקים כגון E. coli הם בררניים ביחס לבחירה של אגר, הרכב מדיה ולחות שלהסביבה 2,13,14,21. לאחר קביעת תנאי ההמולה, חוצה הגבול17 הוא מתודולוגיה שימושית לחקור את היכולת של נחיל לנווט בתנאים חדשים / קשים. למרות הפרוטוקולים המוצגים להלן מתייחסים E. coli, הם יכולים להיות מותאמים בקלות ליישום במינים אחרים.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בקטו אגר מיובש</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>DF0140-15-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA מלח דיסודיום, דיהידראט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-002-786</td><td></td></tr><tr><td>אייקן אגר</td><td>אייקן כימיקל ושות' יפן</td><td>E-MJ00</td><td>חיוני לנחיל אי קולי</td></tr><tr><td>גלוקוז D (+)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td></td><td></td>410955000</tr><tr><td>LB (Lennox) מרק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פולי-L-ליזין (0.1%)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>18-605-496</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי (K2HPO4)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td><חזק>חומרים וציוד</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellSense תוכנת הדמיית מיקרוסקופ (V. 1.6)</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>או תוכנה מקבילה למיקרוסקופ בשימוש</td></tr><tr><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td><td>Fisher</td><td>50-285-28</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ חלביות 3x1x1 מ"מ</td><td>פישר</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אולימפוס BX53</td><td>אולימפוס</td><td>BX53</td><td>ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ פאזה זקוף או הפוך ניתן להשתמש</td></tr><tr><td>בצלחות פטרי (קוטר 100 מ"מ)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB0875712</td><td>לבדיקות אגר רך</td></tr><tr><td>פוליאתילן נבולייזר צינורות נימיים (0.58 מ"מ x 99 מ"מ 3.0 מ')</td> <td>פרקין אלמר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי עגולה 9908265 עם 2 תאים</td><td>VWR</td><td>89200-944</td><td>לבדיקות חוצות גבולות</td></tr><tr><td>בטיחות מחטים היפודרמיות (23G)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>14-826A</td><td></td></tr><tr><td>מזרק סטרילי - 1 מ"ל</td><td>פישר מדעי</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>מגבוני משימה/טישו</td><td>פישר מדעי</td><td>06-666</td><td>או שווה ערך מגבוני טישו לשימוש חד פעמי</td></tr><tr><td>VWR מיקרו כיסוי-זכוכית 18x18 מ"מ</td><td>VWR</td><td>48366205</td><td></td></tr><tr><td>XM10 מצלמה</td><td>אולימפוס</td><td>XM10</td><td>או מצלמת מיקרוסקופ שווה ערך</td></tr></tbody></table>

חקירת תנועתיות מונחית פלאגלה באשריצ'יה קולי על ידי יישום שלוש טכניקות מבוססות בסדרה

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

תנועתיות חיונית להישרדותם ולהצלחתם של מינים חיידקיים רבים. מתודולוגיות רבות קיימות כדי לנצל תנועתיות כדי להבין נתיבי איתות, כדי לבהיר את הפונקציה וההרכבה של חלקים flagellar, ולבחון ולהבין דפוסי תנועה. כאן אנו מדגימים שילוב של שלוש מתודולוגיות אלה. תנועתיות בגר רך היא העתיקה ביותר, המציעה מבחר חזק לבידוד מוטציות מדכאות רווח-של-תפקוד בזנים לקויי תנועתיות, שם תנועתיות משוחזרת באמצעות מוטציה שנייה. טכניקת קשירת התא, המשמשת תחילה כדי להדגים את האופי הסיבובי של המנוע flagellar, ניתן להשתמש כדי להעריך את ההשפעה של משפיעי איתות על מהירות המנוע ואת יכולתה לעבור כיוון סיבובי. בדיקת "מעבר הגבול" היא עדכנית יותר, שבה חיידקי שחייה יכולים להיות מוכנים לעבור לנוע באופן קולקטיבי כנחיל. בשילוב, פרוטוקולים אלה מייצגים גישה שיטתית ועוצמתית לזיהוי רכיבים של מכונות תנועתיות, ולאפיון תפקידם בהיבטים שונים של שחייה ונחילה. הם יכולים להיות מותאמים בקלות כדי ללמוד תנועתיות במינים חיידקיים אחרים.

הבידוד של פסאודו-חוזרים בזן E. coli אשר תנועתיות נפגעת על ידי רמות גבוהות של מולקולת האיתות c-di-GMP, פורט בעבודה האחרונה מהמעבדה שלנו34. זן זה (JP1442) טפח שתי מוטציות: ΔyhjH ו ΔycgR. YhjH הוא הזרחן הפעיל ביותר שמשפיל את C-di-GMP ב- E. coli. היעדר YhjH מוביל רמות גבוהות c-di-GMP ועיכוב תנועתיות. YcgR הוא מחולל C-di-GMP. במתחם עם c-di-GMP, YcgR נקשרת לרוטור flagellar כדי לגרום תחילה לסיבוב מנוע CCW ולאחר מכן להקטין את מהירות המנוע. קשירת תאים וחרוזים הראו כי התנ...

חיידקים רבים משתמשים בתנועתיות המונעת על ידי פלאגלה כדי לנווט בסביבתם וליישב סביבה נוחה הן בנפרד והן כקולקטיב. הוכח כאן הוא השימוש בשלוש שיטות מבוססות המנצלות תנועתיות ככלי בחירה לזיהוי רכיבים / מסלולים התורמים לשחייה ותנועתיות נחיל.

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

את הפרוטוקולים המודגמים בסרטון זה ניתן לשחזר בכל מעבדה בעולם. בשילוב, הם מייצגים גישה שיטתית ורבת עוצמה לאפיון תנועתיות חיידקים. תנועתיות היא היבט מכריע של התפשטות חיידקים והישרדותו, ושלוש השיטות הללו הן כלים שימושיים ורבי עוצמה לניתוח תנועתיות אישית וקולקטיבית כאחד.ניתן ליישם בקלות את הטכניקות המתוארות כאן כדי לחקור מערך של חיידקים, כולל אלה המסווגים כפתוגנים באופיים. כאשר מנסים הליך זה בפעם הראשונה, זכור שאם צלחות הנחיל מוכנות בצורה לא נכונה, ניתן להבחין בהתנהגות לא עקבית או בדפוסים המחקים אך אינם משקפים באמת תנועה קולקטיבית. גדל תרביות לילה של הזן חסר התנועתיות הרצוי בחמישה מיליליטר של מרק לנוקס ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטול אופקי, ולאחר מכן תת-תרבות ב-LB טרי באותם תנאים לשלב האקספוננציאלי.חסנו שישה מיקרוליטרים של התרבית למרכז צלחת אגר רכה, ודחפו את קצה הפיפטה הטעון לתוך האגר כדי להוציא בעדינות את התוכן. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עד לניכרות התלקחויות תנועתיות, הנובעות מנקודת החיסון או מהפריפריה של טבעות התנועתיות. השתמש בלולאת תיל סטרילית כדי להרים את התאים מאזור ההתלקחות ולפס אותם על צלחת אגר קשה LB על מנת לטהר מושבות בודדות.כדי לאשר שהמוטנטים המדכאים המבודדים החזירו את התנועתיות, תרבו אותם על צלחות אגר רכות לזנים מעניינים. כלול סוג פרא וזן חסר תנועתיות התחלתי להשוואה. לאחר דגירה של לוחות התרבית ב-30 מעלות צלזיוס במשך שמונה עד 10 שעות, רשום את קוטר הטבעת החיצונית ביותר כדי לקבוע למי מהמבודדים החזיר את התנועתיות באופן משמעותי.הכינו תרבית פאזה אקספוננציאלית של הזן המעניין. לאחר מכן גלולה 10 מיליליטר תאים על ידי צנטריפוגה ב-2000 פעמים G למשך שלוש דקות, והשעויה אותם מחדש ב-10 מיליליטר של מאגר תנועתיות מעוקר מסנן, או MB. שטפו את התאים פעמיים נוספות ב-MB והשעו אותם מחדש במיליליטר אחד של MB לאחר הצנטריפוגה הסופית. העבירו את מתלה התאים למזרק של מיליליטר אחד והצמידו מחט בגודל 23 לקצה.הרכיבו מזרק ומחט זהים והצמידו את השניים יחד באמצעות שישה סנטימטרים של צינורות פוליאתילן, עטופים היטב מעל כל קצה מחט. גזור את הדגל על ידי העברת מתלה התא בעדינות קדימה ואחורה ממזרק אחד למשנהו 50 פעמים עם הפסקות של דקה אחת בין כל 10 מעברים. לאחר מכן צנטריפוגה של התאים הגזוזים ב -2000 פעמים G למשך שלוש דקות והשעיה אותם מחדש ב -500 מיקרוליטר של MB.To הכנת תא קיבוע תאים, ערימת תלוש כיסוי בגודל 18 על 18 מילימטר מעל שקופית מיקרוסקופ זכוכית המופרדת על ידי סרט דו צדדי.הוסף תמיסת פוליליזין של 0.01% לחלק העליון של החדר כדי לשטוף אותו. הטה את הקצה התחתון על מגבון משימות כדי למשוך את התמיסה דרך החדר, ואז השאר אותו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. שטפו את החדר שלוש פעמים עם 40 מיקרוליטר מגה-בייט והוסיפו 40 מיקרוליטר של מתלה תאים גזוזים לחלק העליון של החדר.אפשר לתאים להיצמד להחלקת הכיסוי למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטוף בעדינות את החדר עם 40 מיקרוליטר MB כדי להסיר תאים לא מחוברים. העבירו את השקופית לשלב המיקרוסקופ והשתמשו במיקרוסקופ ניגודיות פאזה ובמטרה של פי 100 כדי לסרוק את האוכלוסייה לאיתור תאים קבועים במקומם ומסתובבים על ציר יחיד. פתח את תוכנת המיקרוסקופ, וודא שהתאים נמצאים בפוקוס, והתחל ברכישת וידאו כדי להקליט את סיבוב התא למשך דקה אחת.מהפעלת וידאו, כמת את מספר הסיבובים השלמים לדקה ואת מספר הפעמים שהתא משנה כיוון. חסנו שישה מיקרוליטרים של תרבית מעריכית בינונית על ידי זיהויה על גבי האגר. השאירו את המכסה סגור למשך חמש עד 10 דקות והחליפו אותו כאשר החיסון התייבש על פני השטח של האגר.לאחר מכן דגרו את הצלחת בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך שמונה שעות. יוצקים כ -30 מיליליטר אגר נחיל לתא הימני של צלחת פטרי כפולה, ומוודאים שהיא מיושרת עם מחלק הפלסטיק בין החדרים, אך לא עולה על גדותיה לשמאל. לאחר התקשות האגר, מלאו את החדר השמאלי בכ-30 מיליליטר אגר שחייה או נחיל.לפני שהוא מתייצב, השתמש בקצה פיפטה סטרילי כדי להניע בעדינות את האגר מעל הגבול ולחבר את שני הצדדים עם גשר אגר בגובה מילימטר אחד המשתרע לכל אורך המחיצה. הניחו לצלחת להתייבש בטמפרטורת החדר. כשאתה שופך את האגר, שימו לב לעומקו.אם הוא גבוה מדי, הוא יעלה על גדותיו. אם הוא נמוך מדי, לא תוכל לגשר בין שני החדרים. פרוטוקול זה שימש לבידוד התלקחויות פסאודו-חוזרות בזן E.coli עם מוטציה כפולה עם תנועתיות לקויה.אחד מהמחזירים הללו הפגין תנועתיות קרובה לסוג פראי. ההורה המוטנטי הכפול וזן הבר האיזוגני שימשו כבקרות. צילומי וידאו נותחו כדי לחשב סיבובים לדקה, ואת חלק הזמן שבו מנועים מסתובבים בכיוון השעון, או הטיית נפילה.המוטציה yhjH הראתה כמה סיבובים בדקה והטיית נפילה נמוכה יותר בהשוואה ל-E.coli מסוג בר, כצפוי. גם המוטציה הכפולה וגם המדכא שלה הראו התנהגות מוטורית דומה לסוג פראי. מבחן מעבר הגבול שימש להשוואת היכולות של סוג הבר והמדכא לבודד לנחיל ואז לחצות את הגבול ולתקוף אגר בתוספת קנמיצין.שני הזנים הראו שיעורים דומים של נחילים מנקודת חיסון זהה, אך הצלבה של הנחיל לתא האנטיביוטיקה הייתה גדולה יותר באופן עקבי עבור סוג הבר מאשר המדכא. ההבדל בין שני הזנים היה בולט יותר בריכוזי קנמיצין גבוהים יותר. מבחני הנחיל יכולים להיות מסובכים להגדרה.ייתכן שתצטרך להקדיש זמן לאופטימיזציה של תנאי הציור כך שיתאימו לחיידקים המעניינים שלך, כמו גם לתנאי המעבדה שלך במהלך הכנת המדיה. הטכניקות בפרוטוקול זה יושמו על מערך של חיידקים מסומנים, וסביר להניח שניתן ליישם אותן על שפע של מינים שלא נבדקו.

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח של המכשיר microfluidic לחקירת chemotaxis חיידקים הדרגתיים ריכוז יציב של chemoeffectors.

מכשיר microfluidic לכימות Chemotaxis חיידקים Gradients ריכוז אורווה

מקור: Morales-Soto, N. et al., הכנה, הדמיה וכימות של מבחני תנועתיות פני השטח של חיידקים. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים בדיקת נחיל באמצעות חיידקים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק כדי לצפות בתנועתיות פני השטח על אגר רך. הדמיית זמן-lapse לוכדת התרחבות מתואמת והיווצרות קנוקנות, ומדגישה את תנועתיות פני השטח של החיידקים.

בדיקת נחיל להמחשת תנועתיות פני השטח של חיידקים

מקור: Pioli, R., et al., דפוס של מיקרואורגניזמים ומיקרו-חלקיקים באמצעות הרכבה בסיוע נימיות רציפה. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את השיטה של לכידת תאי Escherichia coli (E. coli) בודדים מתויגים פלואורסצנטית במלכודות מיקרופלואידיות באמצעות תרחיף נטול פחמן וזרימה מבוקרת, ואחריו תוספת חומרים מזינים כדי לעורר צמיחה והדמיה פלואורסצנטית של מיקרו-מושבות.

דפוס מיקרופלואידית ומעקב מבוסס פלואורסצנטי של צמיחת חיידקים חד-תאיים

מקור: שיידוויילר, ד., ואחרים. שילוב מכשירים נוזליים עם מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה לחקר הובלה מיקרוביאלית במדיה נקבובית בקנה מידה מרחבי. J. Vis. Exp. (2020).הסרטון הזה מדגים את השימוש במכשיר מיקרופלואידי לכימות תנועתיות חיידקית באמצעות מטריצה נקבובית המורכבת מעמודים מסודרים באקראי. חיידקים מסומנים פלואורסצנטית מוכנסים למכשיר, מצולמים במיקרוסקופיה כשהם נעים דרך המטריצה הנקבובית אל ערוץ התצפית, ומנותחים ליצירת עקומת פריצת דרך (BTC).

הערכת תנועתיות חיידקית באמצעות מכשיר מיקרופלואידי

תנועתיות הנחיל מושפעת מגורמים פיזיקליים וסביבתיים. אנו מתארים פרוטוקול דו-שלבי והנחיות לעקיפת האתגרים הקשורים בדרך כלל להכנת בדיקת נחילים ואיסוף נתונים. נעשה שימוש בטכניקת הדמיה מקרוסקופית כדי לקבל מידע מפורט על התנהגות נחיל שאינו מסופק על ידי טכניקות הניתוח הנוכחיות.

הכנה, הדמיה, וכימות של מבחני תנועתיות Surface בקטריאלי

ממצאים אחרונים מצביעים על כך שמנועי דגל חיידקים חשים מגוון אותות סביבתיים ומעצבים מחדש בתגובה. מבחני החרוזים שנדונו כאן צפויים לעזור להסביר את תפקיד העיצוב מחדש בהסתגלות התאים לגורמי לחץ סביבתיים.

אפיון Biophysical של פונקציות flagellar Motor

הדמיה של תאים חיידקיים היא גישה ביולוגיה מערכות מתפתחים התמקדו הגדרת תהליכים סטטיים ודינאמיים המכתיבים את הפונקציה של מכונות macromolecular גדולות. כאן, שילוב של הדמיה תא כמותי לחיות וטומוגרפיה מסוג ההקפאה משמשת לחקר הלגיונרים האלה הפרשת מערכת הפרשה ופונקציות.

החלת הדמיית תאים בשידור חי וטומוגרפיה ממוחשבת כדי לפתור את התכונות הספאטימיות של הלגיונרים האלה מערכת הפרשות

עבודה זו מציגה שיטת מיקרוסקופיה המאפשרת הדמיה חיה של תא יחיד של Escherichia coli לניתוח וכימות של ההתנהגות הסטוקסטית של מעגלי גנים סינתטיים.

מדידה רציפה של רעש ביולוגי ב Escherichia קולי באמצעות מיקרוסקופיה לשגות זמן

כאן, אנו מתארים את הבנייה של מוטציות ריקות של אירומונס בגליקוזילטרנספראזות ספציפיות או באזורים המכילים גליקוזילטרנספראזות, מבחני תנועתיות וטיהור פלגלה שבוצעו כדי לבסס את המעורבות והתפקוד של האנזימים המקודדים שלהם בביוסינתזה של גליקאן, כמו גם את תפקידו של גליקאן זה בפתוגנזה חיידקית.

יצירת מוטציות ריקות כדי להבהיר את תפקידם של גליקוזילטרנספראזות חיידקיות בתנועתיות חיידקית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי תנועתיות חיידקים בהתבסס על תגובת צבע. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם כי קל להעריך ומדויק יותר, ואינו דורש ציוד מיוחד.

המחשת תנועתיות חיידקים בהתבסס על תגובת צבע

פרוטוקול זה מציג שיטה מהירה ויעילה לזיהוי גורמים גנטיים המעורבים בסוגים שונים של תנועתיות ב-Pseudomonas aeruginosa.

שיטה בעלת תפוקה גבוהה להתבוננות בפנוטיפים של תנועתיות ב-Pseudomonas aeruginosa

חקור תנועתיות חיידקית מונחית פלאגלה באשריצ'יה קולי באמצעות שלוש טכניקות מבוססות בסדרה. השיטות מאפשרות ניתוח תנועה פרטנית וקולקטיבית ותורמות להבנת התנהגות פתוגנית.

חקירת תנועתיות מונחית פלאגלה באשריצ'יה קולי על ידי יישום שלוש טכניקות מבוססות בסדרה

גלה סרטונים נוספים