גישות כמותיות לניקוד ב-vivo Neuronal Aggregate ו-Organelle הבלטה בוויקות Exopher גדולות ב C. elegans

פרוטוקול זה מתאר גישות לזיהוי וכמות של הבלטות גדולות של צבירה ו/או אורגנל (~4 μm) המיוצרות על ידי תאי C. elegans בצורה של exophers המאוגדים קרום. אנו מתארים זנים, תנאי גדילה, קריטריונים ניקוד, תזמון, ושיקולי מיקרוסקופ הדרושים כדי להקל על ניתוח של מנגנון גירוש פסולת זה.

אנו מאפיינים את מנגנוני in vivo של שבלט מצרפי ואברבל מתאי עצב באמצעות תהליך הנקרא אקסופרגנזה, ביולוגיה מובנת היטב שסביר להניח שרלוונטית להתפשטות פתולוגית של מחלות נוירודגנרטיביות. גישות אלה נחוצות להשגת ניקוד לשחזור של exophers עצבי מובלט ולהדגים פלטפורמה עבור ניתוח מכני של חיסול אשפה הסלולר באמצעות העברה עצבית לתאים שכנים. הגדרת מנגנוני in vivo של איך נוירונים להוציא אגרגטים עשוי למעשה להשפיע על העיצוב של אסטרטגיות חדשניות כדי לסייע בטיפול בתנאים ניווניים אנושיים.

עבור מצבים בזלתיים, בית C.Elegans באותו גיל ביולוגי בטמפרטורה קבועה של 20 מעלות צלזיוס. להדמיה חיה של הדינמיקה תאית ומאפיינים של exophergenesis, למקם עד 20 בעלי חיים על כרית agaros על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית, ולשתק את בעלי החיים. מניחים בזהירות כיסוי להחליק על התולעים משותקים למקם את השקופית על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal.

השתמש במטרה 10 עד 40x כדי לזהות את מישור Z הרצוי בברייטפילד, לרשום הערות של מיקום התולעת, כיוון זנב הראש, ואת מיקום הפות, המהווים ציוני דרך לזיהוי עצבי מאוחר יותר exopher. להישאר באותו מישור Z, לעבור לצפייה פלואורסצנטיות שדה רחב ב 10 עד 40x עבור הכתב הציטוסולי שנבחר, ולגלול בתוך ציר Z כדי לבחון את עומק החיה ואת ביטוי הפלואורסצנטיות במישור המוקד. לראש תהיה טבעת עצב פלואורסצנטי, והזנב המחודד יותר יכיל 1-2 נוירונים גלויים למגע הצדדי.

הגדלה גבוהה יותר עם עדשה 63x יכולה לעזור לזהות את טבעת העצבים, תהליכים עצביים וגופי סומא. תחילה מומלץ לזהות את טבעת העצבים הממוקמת בראש החיה ותהליכים עצביים אופטיביים. כדי לעשות זאת, להתחיל בראש התולעת לאט לגלול דרך ציר Z כדי לזהות את המישור של טבעת העצב שבו התהליכים העצביים מחוברים.

לאחר טבעת העצב זוהה, בתצוגת פלואורסצנטיות בצע את התהליך העצבי המצורף באופן מאוחר בכיוון האחורי לכיוון הפות, שם סומא יהיה ברור. לאחר הגוף או הגוף soma עגול נמצאים בפוקוס, חשוב לזהות את כל הנוירונים הסמוכים. לזיהוי נוירון מגע, מצא תחילה את ALML, ALMR ו- AVM soma, שאמורים להיות האותות הבהירים ביותר המסומנים על ידי גוף תא עגול בסוף התהליך.

לאחר סומא העצבי ביותר בפוקוס כבר ממוקם, להשתמש בתא AVM, תא גחוני, כדי לעזור להקצות את הכיוון. אם הנוירון AVM נמצא באותו מישור כמו ALM, אז החיה נחה על צידה ואת הנוירון הצדדי הוא ALMR. אם נוירון AVM אינו באותו מישור כמו ALM המדובר, נוירון המגע הקרוב ביותר למישור המוקד הוא נוירון ALML.

מועיל גם הוא לזהות את נוירון PVM, שהוא נוירון מגע גחוני הממוקם ליד הזנב. מישור המיקוד של PVM יציין אם נוירון המגע המוקדם הוא ALML או ALMR. אם ALM המדובר הוא באותו מישור כמו PVM, אז נוירון מגע שנצפה הוא נוירון ALML.

לאחר ש-ALM המוקדת ביותר זוהתה והוקצתה, חשוב לקבוע את מיקומם של גופי ה-soma האחרים בקרבת אזור העניין ובכל מטוסי ה-Z, כדי לא לטעות ולחשוב שהם אקסופרים. לאחר נוירון מגע של עניין כבר ממוקם, ALMR או ALML, לבדוק את הנוירון עבור תחומים גדולים בולטים exopher, גדול מספיק כדי להיחשב exopher ניצן, שהוא לפחות חמישית הגודל של סומא שמקורו. אם לא נצפתה שום תחום ניצן או exopher, לבדוק עוד יותר את סומא עצבי עבור סיסם דק מצורף הנבוא מגוף סומא.

אקסופרים מחוברים נוטים להיות ממוקמים קרוב יותר לסומה המקורית ובמישור Z דומה. כדי לזהות אקסופר לא מחובר, חפשו חלבונים פלואורסצנטיים מרוכזים, שלעתים קרובות בהירים יותר מהסומה. למרות שתואר כאן, יש exopher אחד גדול.

ייתכן שיש יותר מישות פלואורסצנטית אחת שמקורה ב soma יחיד. חפשו אקסופרים לא מחוברים במישורי מוקד שונים ובאזור ההדרגתי המרוחק שממנו נמצאה הומה המקורית. האקסופרים בדרך כלל בולטים הרחק מהסומה בכיוון אחורי מהתהליך העצבי.

בדוק אם קיימים עצמים כדוריים גדולים שלא ממוקמים ומזוהים כמוסות עצביות. למרות exophers הם בדרך כלל מבנים ספריריים, הם יכולים להיות מושפלים לאורך זמן, רכישת צורה לא סדירה יותר. חפש את נוכחותם של אירועי לילה כוכבים ומופעים של אירועי אקסופר מרובים.

כדי למנוע טעות וסומה מחוץ למטוס עבור exopher, זה קריטי כדי לזהות את כל גופות סומא הסמוכות, אפילו somas מחוץ לפוקוס בתחילת התצפית. ניתן לצפות ב-soma מורחב או מחודד, אך אין להבקיע הרחבה ללא אתר התכווצות ברור כאקסופר. דחה ניצנים קטנים שנפתרו כי לא להשיג חמישית מגודלה של soma לכמת אירוע exopher.

למרות נוריטים בוגרים יכולים להאריך באופן דרמטי עם הגיל, וחלבונים פלואורסצנטיים יכולים לנדוד לתוך הקצה הדיסטלי של מבנים כאלה, לא לספור נויריטים גדלים כמו exophers. כדי לזהות ישויות פלואורסצנטיות שאינן אקסופרים, הקפד לא לכלול כל שפעת אוטומטית, אשר עשוי להיות טועה עבור פסולת כלי רכב לילה כוכבים תחת פלואורסצנטיות שדה רחב. כדי לא לכלול אותות פלואורסצנטיים עובריים, לעבור בין פלואורסצנטיות ותאורת שדה בהיר, ולבדוק אם יש קשר של האות עם ביצים בתוך הרחם.

טבלה זו מספקת סיכום של נוירון מגע שונה הביע כתבים פלואורסצנטיים ששימשו לניטור ייצור exopher. מטענים הידועים להיות extruded exophers כוללים אגרגטים כגון Q128, היתוך של הנטינגטון האנושי מורחב פוליגלוטמין חוזר, lysosomes GFP מתויג עם חלבון קרום הקשורים lysosomal, ו מיטוכונדריה מתויג עם מטריצה מקומית GFP. GFP ציטופלסמי אינו מגורש בחוזקה, והוא נשמר רצוי בסומה, אם כי GFP יכול לשמש כדי לדמיין באופן חלש exophers.

באופן כללי, ייצור exopher על ידי ALMR נוירון הבעת mCherry בתנאים הבסיסיים מתחיל ביום הראשון של הבגרות נע בין חמישה ל 25% של ALMRs נבדק במסגרת הזמן העיקרית לייצור exopher של יום אחד עד שלוש מבוגרים. לחצים מסוימים והתגרויות גנטיות יכולים להגדיל מאוד את ייצור האקסופר בתוך נוירונים ALMR. זה חיוני כדי לאתר את כל הנוירונים הסמוכים לפני בדיקת הנוירון של עניין והסביבה עבור תחומי exopher, exophers שלם, או אירועי לילה כוכבים.

כאשר אתה מרגיש בנוח עם זיהוי ידני exophers, שיטות תפוקה משופרת עבור הקרנה בקנה מידה גדול באמצעות הדמיה תוכן גבוה ניתן להשתמש, המאפשר ניתוח גנום שלם וניתוח exophergenesis מכוניסט.