Name: גישות כמותיות לניקוד ב-vivo Neuronal Aggregate ו-Organelle הבלטה בוויקות Exopher גדולות ב C. elegans (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: למד שיטות כמותיות לניקוד אקסופרים נוירונליים ב-C. elegans באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצניה חיה. חקור את מנגנוני הדחייה של אגרגטים ואברונים ואת השלכותיהם למחלות נוירודגנרטיביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים במענקי NIH הבאים: R01AG047101 ו- R37AG56510. חברי מעבדות דריסקול וגרנט תרמו רבות לפיתוח ולכוונון עדין של פרוטוקולים המתוארים, עם ניסויים קפדניים ותקשורת חזקה.

<ol><li>Davis, A. A., Leyns, C. E. G., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+Spread+of+Protein+Aggregates+in+Neurodegenerative+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Intercellular Spread of Protein Aggregates in Neurodegenerative Disease.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 545-568 (2018).</li>
<li>Davis, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+degradation+of+axonal+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcellular degradation of axonal mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), 9633-9638 (2014).</li>
<li>Torralba, D., Baixauli, F., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+Know+No+Boundaries%3A+Mechanisms+and+Functions+of+Intercellular+Mitochondrial+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria Know No Boundaries: Mechanisms and Functions of Intercellular Mitochondrial Transfer.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 107(2016).</li>
<li>Stahl, P. D., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+Exosomes+and+Microvesicles+Integrators+of+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%2C+Md.%29%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: Exosomes and Microvesicles Integrators of Homeostasis.</a> Physiology (Bethesda, Md.). 34 (3), 169-177 (2019).</li>
<li>Melentijevic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-elegans+neurons+jettison+protein+aggregates+and+mitochondria+under+neurotoxic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">C-elegans neurons jettison protein aggregates and mitochondria under neurotoxic stress.</a> Nature. 542 (7641), 367(2017).</li>
<li>Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+a+prion+domain+from+cell-to-cell+by+vesicular+transport+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 9 (3), 1003351(2013).</li>
<li>Tyson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+animal+model+defines+genetic+contributions+for+neuron-to-neuron+transfer+of+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel animal model defines genetic contributions for neuron-to-neuron transfer of alpha-synuclein.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li>
<li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+spreading+of+huntingtin+aggregates+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 5427-5433 (2015).</li>
<li>Pearce, M. M. P., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+transmission+of+neuronal+huntingtin+aggregates+to+phagocytic+glia+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain.</a> Nature Communications. 6, 6768(2015).</li>
<li>Fu, H., Li, J., Du, P., Jin, W., Cui, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+wastes+are+extracellularly+disposed+by+excretosomes%2C+nanotubes+and+exophers+in+mouse+HT22+cells+through+an+autophagic+vesicle+clustering+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Metabolic wastes are extracellularly disposed by excretosomes, nanotubes and exophers in mouse HT22 cells through an autophagic vesicle clustering mechanism.</a> bioRxiv. 10 (1), (2019).</li>
<li>Ghose, P., Park, E. C., Tabakin, A., Salazar-Vasquez, N., Rongo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxia-reoxygenation+regulates+mitochondrial+dynamics+through+the+hypoxia+response+pathway%2C+SKN-1%2FNrf%2C+and+stomatin-like+protein+STL-1%2FSLP-2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Anoxia-reoxygenation regulates mitochondrial dynamics through the hypoxia response pathway, SKN-1/Nrf, and stomatin-like protein STL-1/SLP-2.</a> PLoS Genetics. 9 (12), 1004063(2013).</li>
<li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-sensitive+green+fluorescent+protein%3A+probes+for+dynamic+intracellular+redox+responses.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox-sensitive green fluorescent protein: probes for dynamic intracellular redox responses. A review.</a> Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2008).</li>
<li>Perkins, L. A., Hedgecock, E. M., Thomson, J. N., Culotti, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+sensory+cilia+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mutant sensory cilia in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 117 (2), 456-487 (1986).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+Elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+growth+and+aging+of+Caenorhabditis+elegans+in+the+presence+of+fluorodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine.</a> Journal of Gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).</li>
<li>Weicksel, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+small+molecule+that+disrupts+a+key+event+during+the+oocyte-to-embryo+transition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A novel small molecule that disrupts a key event during the oocyte-to-embryo transition in C. elegans.</a> Development. 143 (19), 3540-3548 (2016).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+and+long-term+immobilization+in+a+hydrogel-microbead+matrix+for+high-resolution+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+and+other+small+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms.</a> PloS One. 13 (3), 0193989(2018).</li>
<li>Toth, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+sprouting+and+synapse+deterioration+in+the+aging+Caenorhabditis+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).</li>
<li>Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA Interference in Caenorhabditis elegans.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, (2015).</li>
<li>Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+neuronal+RNAi+in+C.+elegans+using+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1.</a> Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).</li>
<li>Maher, K. N., Catanese, M., Chase, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+gene+knockdown+in+C.+elegans+using+dsRNA+feeding+libraries+to+generate+robust+loss-of-function+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Large-scale gene knockdown in C. elegans using dsRNA feeding libraries to generate robust loss-of-function phenotypes.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50693(2013).</li>
</ol>

האפיון של המנגנונים המולקולריים vivo של חיסול צבירה אורגנל בצורה של exophers גדול הוא בחיתוליו. שאלות לגבי ייעוד המטענים לגירוש, האיסוף המקוטב של מטענים אלה בתוך התא, הרגולציה של ההחלטה לייצר exophers, המכונות המתווכות שבלטים, ואת האינטראקציה של exophers עם מכונות משפילות בתא השכן כל להישאר לטפל. יתר על כן, הדמיית vivo של קשרים צינוריים שיכולים להעביר חומרים ביולוגיים הכוללים סידן, אגרגטים, ומיטוכונדריה היא ביולוגיה מעניינת ולא מבוקרת בזכות עצמה. שאלות מדוע תאים מסוימים נוטים יותר exopher ייצור מאשר אחרים גם אינם פתורים, אבל יכול להתחיל להיות גנטית לנתח עם הגישות המתוארות בפרוטוקול זה.
מתואר בפירוט בפרוטוקול זה הם הגישות להשגת ניקוד לשחזור של ייצור exopher, עם תשומת לב להבחנה exophers מסומס תא סמוך, תזמון של ניתוחים כדי ללכוד שיא של ייצור exopher, ושליטה קפדנית של תנאי צמיחה כדי לחסל לחצים לא מכוונים שיכולים לווסת את רמות exopher. שתי ההבחנה של exopher מוקדם גדול, או "לילה כוכב" פיזור ב hypodermis שמסביב יכול להיות כמותי כעדות של ייצור exopher. עם זאת, נוירונים המביעים mCherry בתנאים בסיסיים קשורים בדרך כלל עם 5-25% של נוירונים מסוג מסוים לייצר exopher. מבוא מבוקר של תנאי מתח יכול להיות מיושם כדי להגדיל את ייצור exopher לזיהוי גבוה ככל 90% של נוירונים לייצר שחוליות, שימושי במיוחד עבור מסכים גנטיים או תרופתיים עבור משנה.
במחלה ניוונית אנושית, אגרגטים גדולים יכולים לעבור מנויונים מונתיים ים לתאים סמוכים כדי לקדם התפשטות פתולוגיה. מנגנון האקסופר עשוי לעבור באמצעות מנגנון שומר המשמש להבלטה מצטברת על פני פילה. הגדרת מולקולות vivo כי גם לשפר את היעילות של תהליך זה (נחשב שליטה פרוטאוסטזיס יעיל יותר) או לחסום אותו עשוי להיות רתום כדי להשפיע על עיצוב אסטרטגיות חדשניות למאבק במחלות ניווניות מרובות. ככזה, הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש עבור מסכי מוטגנזה גנטית קלאסית, מסכי RNAi הגנום כולו כי באופן שיטתי להפיל גנים כדי לזהות משפרי ומדכאים, או עבור מחקרים התערבות סמים המזהים משנה פרמקולוגי מועמד של תהליך זה. הגישה היא פשוטה, אם כי קצת מייגעת. Exophers הם כל כך גדולים שהם יכולים לצפות עם מיקרוסקופ ניתוח הגדלה גבוהה. ובכל זאת, C. elegans נוירונים הם קטנים יחסית ומסתכלים organelles שלהם או קרום שלהם דורשים תמונות קונפוקליות כוח גבוה יותר והוא תהליך איטי. אפשרויות לתפוקה גבוהה יותר עשויות לכלול גישות הדמיית תוכן גבוהות בתבנית צלחת מרובת בארות.
היישום של גישה מתוקננת לניקוד exopher צריך בבסיס ניתוח גנטי מתואמות של התהליך שבו נוירונים יכולים לארגן ולחסל פסולת תאית.

האתגרים neurotoxic של אגרגטים ומיטוכונדריה תפקודית כבר זמן רב נחשבו תאים פנימיים, אבל לאחרונה זה הפך ברור כי חלבונים מחלה אנושית misfolded שמקורם נוירון אחד יכול גם להתפשט לתאים שכנים, קידוםפתולוגיה 1. כמו כן, ניתן לשלוח מיטוכונדריה יונקים מתוך התא של הייצור המקורישלהם עבור השפלה טרנס-תאית 2 או להצלת אוכלוסיות מיטוכונדריאלי בתאים שכנים מאותגרים3. שלוקים בגדלים שונים נצפו בדרך כלל כדי להעביר חומרים סלולריים לתאים סמוכים או לסביבה נוזלית4. כמה שללות בולטות להתקרב לגודל של סומה עצבית ממוצעת (מגע ממוצע נוירון סומה ~ 6 μm) והוא יכול להכיל אגרגטים גדולים organelles.
דוגמה בולטת של הבלטה שלפוחית גדולה שיכולה לשאת אגרגטים חלבון organelles מתרחשת C. elegans מגע קולטן נוירונים המבטאים מספר עותק גבוה כתב לבנות קידוד mCherry נוטה צבירה מזיקה,השפלה עמידיםmCherry 5 . הבלטות מן הנוירונים מגע, הנקרא exophers, הם ~ 4 μm קוטר ממוצע, באופן סלקטיבי כוללים mCherry או אגרגטים אחרים, והם מועברים ישירות לתוך hypodermis השכן, אשר בדרך כלל מקיף את נוירוני קולטן מגע. ההיפודרמיס מנסה לפגוע ביסוסום, אבל כמה תכנים שאינם ניתנים לעיכול כגון אגרגטים mCherry ניתן להבלט מחדש על ידי hypodermis לתוך פסאודוקואלום מלא נוזלים של החיה, שממנו mCherry יכול להיות נלקח על ידי תאי אוכל נבלות מרוחקים הנקראים coelomocytes לאחסון לטווח ארוך (איור 1, איור 2)5.
שלולי exopher exopher גדולים בולטים לעזוב את התא מוקף קרום פלזמה קולטן מגע והוא יכול להכיל חלבוני מחלה אנושית מצטברת, מיטוכונדריה, ליזוזומים. התהליך של ייצור exopher נראה כרוך מיון של מינים רעילים פוטנציאליים (למשל mCherry נוטה צבירה הוא מופרד מסיס, חלבונים לא מופרך כמו GFP שנשאר בעיקר בסומה העצבית). בדרך זו, גירוש מכוון של הישויות המאיימות מושגת על ידי נוירון5. אתגר פרוטאוסטזיס, כגון מתח המושרה על ידי נוק-דאון autophagy, MG132-בתיווך פרוטאואזום, או ביטוי טרנסגני של חלבוני מחלה אנושית כגון מחלת הנטינגטון הקשורים פוליגלוטמין Q128 או אלצהיימר של מחלת מעורב שבר Aβ1-42, יכול להגדיל את מספר הנוירונים המייצרים exophers5.
כפי שרק לאחרונה תועדו אקסופרים, מה שידוע בתיאור הביולוגיה שלהם ראוי לתיאור. Exophers התגלו ב, והם הנחקרים היטב ב, C. elegans מגע קולטן נוירונים. ישנם שישה נוירונים מגע c. elegans mechanosensory כי יש גופים תא מופץ ברחבי הגוף(איור 3A)ונקראו תאי microtubule כי ultrastructure שלהם תכונות ייחודי 15 microtubules protofilament. תאי העצב קולטן המגע הם ה-AVM הקדמי (נוירון מיקרוטובולה גחוני קדמי), ALMR ו-ALML (תאי עצב מיקרוטובולה קדמיים ימינה ושמאל), הנוירונים המרכזיים יותר (נוירון מיקרוטובולה אחוריים), וה-PLMR האחורי ו-PLML (המיקרוטובולה הרוחבית השנייה של הנוירונים מימין ושמאל) בזנב. מעניין, ששת הנוירונים קולטן מגע לייצר exophers בשיעורים שונים, למרות הבעת אותו transgene התקפי(איור 3C). מתוך שישה נוירונים קולטן מגע mechanosensory, נוירון ALMR עובר exophergenesis לעתים קרובות יותר מאשר נוירונים מגע אחרים. כמות של מספרי exopher מנויר מגע הוא בדרך כלל נקבע על ידי התמקדות ALMR.
Exophergenesis הוא תהליך דינמי שמתחיל בדרך כלל עם נפיחות של ציות עצבית (איור 1A-B). תכולת תאית, אורגנלים או אגרגטים חלבון נאספים לצד אחד של סומה עצבית, בדרך כלל לכיוון הקצה האחורי של נוירון ALMR (הרחק מן neurite הקרנה), ויוצרים תחום pre-exopher (PED) (איור 1B). הבלטה המוקדמת נצפתה כאשר PED מתחיל להקרין כלפי חוץ, ויוצר ניצן בולט מוכר. ניצן מאוחר מוגדר כאשר הקוטר הרחב ביותר של תחום pre-exopher הוא כ 1/3 גדול יותר מאשר הקוטר של כוומת הצוואר סומה-exopher (איור 1C). Exophers ניתן לפלוט כמעט בכל כיוון מן soma, אבל רוב exophers לצאת האחוריים מגוף התא ולהישאר בערך באותו מישור מוקד כמו סומה המקור.
האקסופר יכול להתרחק מהסומה המקורית כאשר צוואר הניצן מצטמצם לבינוי דק. Exophers יכול להישאר מחובר לסומה באמצעות נימה זו (איור 1D, חץ) ומאוחר יותר יכול להיות מנותק. ניתן להעביר תכנים תאיים כגון סידן, אגרגטים ומיטוכונדריה באמצעות נימהזו אל האקסופר המצורף 5, אם כי רוב החומר ההבלטה מוכנס לתא האקסופר על ידי אירוע הניצנים המסיבי. Exophers נחשבים בוגרים כאשר אין צינור חיבור גלוי או נימה דקה exopher מופרד באופן מלא מן השולח soma(איור 1E).
Exophers המיוצר על ידי C. elegans לגעת נוירונים מיד להיתקל hypodermis, הרקמה המקיפה את הנוירון מגע. בדרך כלל, vesicle exopher נראה לנסוע בתוך האחורי hypodermis לכיוון הזנב, והוא יכול להיות רחוק למדי מן סומה לפני תוכן exopher נראה ממוקד להשפלה (לדוגמה, המרחק יכול להיות ~ 100 μm מן סומה(איור 1F)). שלפוחית האקסופר הפלואורסצנטית מתפרקת לשלפוחיות קטנות יותר בתוך ההיפודרמיס, ולוקחת על פעולה המכונה "לילהכוכב" (איור 1G ואיור 2). בשלב "לילה כוכבים", חומר פלואורסצנטי דייקן ניתן לצפות מפוזר על פני סינכרון hypodermal לתוך נקודות קטנות רבות יותר של פלואורסצנטי בהשוואה exopher הבודד המקורי. לילה כוכב יכול להיראות דייקן תחת הגדלה נמוכה עם הגדלה גבוהה יותר, יכול להיראות דייקן ו / או ברשת בתוך hypodermis. אות הפלורסנט של הלילה המנצנץ הוא בדרך כלל עמעם מאשר exopher ואת הפלואורסצנטיות הביע הנוירונלית(איור 2B-C). הפיזור של mCherry לתוך שלפוחיות דייקן רבים נחשב לערב התבגרות phagosome היתוך עם הרשת אנדוזומלית / lysomal של התא hypodermal. חלק מחומרי האקסופר כנראה מושפלים ברשת הליזומלית ההיפודרמלית, אך מינים שיורית העמידים בפני השפלה (כגון אגרגטים של mCherry) נזרקים מהתודרמיס אל הפסאודוקואלום, תא נוזלים שיכול להכיל פסולת תאית. חומר הפלורסנט נלקח מאוחר יותר על ידי תאי אוכל נבלות מרוחקים הנקראים coelomocytes (איור 2C), אשר יכול להתרכז, לאחסן, ושוב לנסות השפלה של mCherry.
התופעה של הבלטה מצטברת והעברה נראית שנוצלת על פני פילה, לאחר שדווח במודלים גנטיים כגון C. elegans5,6,7 ו D. מלנוגסטר8,9, כמו גם במודלים יונקים מרובים., שבלטים דמויי Exopher דווחו עבור תאיםיונקים 10, תצפית המצביעה על כך שמנגנונים שנצמרים עשויים להיות בבסיס צבירה וגירוש organelle. ייצור Exopher עשוי אפוא להיות מנגנון שנשמר של ניהול פסולת תאית המהווה בסיסי, אבל בעבר לא מוכר, ענף של פרוטאוסטזיס עצבי ובקרת איכות מיטוכונדריאלי, אשר, כאשר לא מאוזן, עשוי לתרום באופן פעיל למחלה ניוונית. זיהוי המולקולות המעורבות באפליה ומיון פסולת, הובלה לאזור תת-תאי מובהק, שבלט, היווצרות/מספריים של החיבור צינורי המקשר בין הסומה לבין ההתלהמות המאוחרת, והכרה בשלפוחית הגדולה של ההבלטה להשפלה מרחוק על ידי תא סמוך נותרים לעבודה עתידית. מחקרים במודלים נמטודה וזבוב יהיה חשוב באופן קריטי להגדרת מנגנונים של איסוף והעברה של אורגנל, תוך שימוש בגישות גנטיות לא משוחדות וכלים ביולוגיים רבי עוצמה של תאים המוצעים על ידי מודלים אלה כדי לזהות מולקולות משתתפות בהקשר פיזיולוגי.
צעדים ראשונים קריטיים במנגנוני פענוח אופרטיביים בביולוגיה exopher כרוכים בהגדרת פרוטוקולים לשחזור ב כימות vivo exopher. מודל C. elegans מציע יתרון מסוים למאמצים כאלה מאז הגוף הוא שקוף exophers ניתן לצפות בקלות כאשר הם מכילים חלבונים מתויגים פלורסנטים או organelles. Exophers דווחו להיות שנוצר על ידי C. elegans דופאמין נוירונים PDE ו CEP, ASE ו ASER נוירונים חושיים, ונוירונים אמפיאדמילוי צבע 5. בגלל exophers המיוצר על ידי נוירונים קולטן מגע מאופיינים בצורה הטובה ביותר, ההתמקדות כאן היא על השימוש בנוירונים מגע לניתוח exopher. עם זאת הגישה הבסיסית ניתן להחיל כדי למדוד ייצור exopher מכל תא. פרוטוקולים כדי לזהות וכמות exophers המיוצר על ידי C. elegans מגע נוירונים קולטן כי transgengen להביע חלבון mCherry מתוארים, עם דגש על cargoes שניתן לפקח על אילוצים זמניים בניקוד. מאמר זה מגדיר גישות לקראת זיהוי vivo exopher, ואת הכמות של תנאים סביבתיים וגנטיים לווסת את ייצור exopher. הפרוטוקולים מדגישים תשומת לב קריטית לתנאים קבועים ללא מתח לקביעת ייצור אקסופר בסיסי ולהשוואות בין גנוטיפים.

<table><tbody><tr><td>מצלמת CMOS מדעית 95B</td><td>פוטומטריה Prime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &mu; L קצות שמירה נמוכים</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל פיפטה סרולוגית</td><td>אפלטון וודס</td><td>CC214</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L קצות שמירה נמוכות</td><td>Sarstedt</td><td>70.1130.105</td><td></td></tr><tr><td>13% נתרן היפוכלוריט</td><td>Acros Organics</td><td>AC219255000</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>2 ליטר צלוחיות ארלנמאייר</td><td>ציוד מעבדה מדעי FLA4036</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 מ"ל פיפטה סרולוגית</td><td>אפלטון וודס</td><td>CC216</td><td></td></tr><tr><td>300 &mu; L טיפים לשמירה נמוכה</td><td>Sarstedt</td><td>70.765.105</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל פיפטה סרולוגית</td><td>אפלטון וודס</td><td>CC117</td><td></td></tr><tr><td>5-פלואורו-2'-דאוקסיורידין 98%</td> <td>אלפא אסאר</td><td>L16497.ME</td><td></td></tr><tr><td>9 ס"מ צלחות פטרי סטריליות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>11309283</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>Vwr</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans זן פראי מסופק</td><td>על ידי CGC</td><td>N2</td><td>C. elegans זן</td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>אקרוס</td><td>110190250</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>E. coli זן OP50</td><td>מסופק על ידי CGC</td><td>Op50</td><td>E coli</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטנדרטי FBS10</td><td>מכשירי מאייר</td><td>KSC 410-1-100-1</td><td>FBS10 סטנדרטי עם בסיס צלחת, 100/100 ראש משולש ופיפטת זכוכית זום היפוך</td></tr><tr><td>270 מ"מ</td><td>פישרברנד</td><td>FB50255</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Thermofisher 75004515</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדעי מפזרי חיסון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>11821741</td><td></td></tr><tr><td>LB בינוני כמוסות</td><td>MP ביו-רפואי</td><td>3002-031</td><td></td></tr><tr><td>LDI &ndash; תאורת דיודות לייזר</td><td>89 צפון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>levamisole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16595-80-5</td><td></td></tr><tr><td>M4 multipette</td><td>Eppendorf</td><td>4982000012</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>מונו-בסיסי אשלגן פוספט</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Multitron Standard טלטול אינקובטור</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td>INFO28573</tr><tr><td>סירי צנטריפוגה Nalgene 1 ליטר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>3120-1000</td><td></td></tr><tr><td>P10 פיפטה</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>P1000 פיפטה</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 פיפטה</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>pipeteboy 2</td><td>VWR</td><td>612-0927</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-חרוזי פוליסטירן</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD00131491</td><td></td></tr><tr><td>RC5C בתוספת צנטריפוגה רכובה על הרצפה</td><td>Sorvall</td><td>9900884</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות ציטולוגיה טבעתיות לשימוש חוזר</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22037242</td><td></td></tr><tr><td>SK4005 zdIs5 [Pmec-4GFP]</td> <td>חוזה מעבדת</td><td></td> דריסקול <td>GFP מבוטא בנוירונים במגע</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>13422</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>פישר כימי</td><td>S/4880/53</td><td></td></tr><tr><td>טקטרול 2 אוטוקלאב</td><td>Priorclave</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>28313</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>X-Light V2 מסתובב דיסק קונפוקלי</td><td>יחידה CrestOptics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]</td><td>חוזה מעבדת</td><td></td> דריסקול <td>mCherry מבוטא בנוירוני מגע</td></tr><tr><td>ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+]</td><td>חוזה מעבדת</td><td></td> דריסקול <td>Q128 מבוטא בנוירוני מגע</td></tr><tr><td>ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP]</td><td>חוזה מעבדת</td><td></td> דריסקול <td>mitoROGFP מבוטא בנוירוני</td></tr> <tr><td>מגעZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP]</td>סמן אוטופגיה <td>של מעבדת</td><td></td> דריסקול <td>המתבטא בנוירוני מגע</td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

גישות כמותיות לניקוד ב-vivo neuronal aggregate ו-organelle הבלטה בוויקות exopher גדולות ב c. elegans

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

רעילות של חלבונים מרופקים ותפקוד מיטוכונדריאלי הם גורמים מרכזיים המקדמים ירידה עצבית תפקודית הקשורה לגיל ומחלות ניווניות על פני מינים. למרות אתגרים neurotoxic אלה נחשבו זמן רב להיות תאים פנימיים, ראיות ניכרות כעת תומך כי חלבונים מחלה אנושית misfolded שמקורו נוירון אחד יכול להופיע בתאים שכנים, תופעה המוצעת כדי לקדם פתולוגיה התפשטות במחלה ניוונית אנושית.
ג. elegans נוירונים בוגרים המבטאים חלבונים צבירת יכולים להבלטה גדולה (~ 4 μm) קרום מוקף של שלוקים שיכולים לכלול את החלבון המצטבר, המיטוכונדריה, וlysosomes. שלוקים גדולים אלה נקראים "exophers" והם שונים exosomes (שהם על 100x קטן יותר ויש להם biogenesis שונה). זריקת פסולת תאית באקסופרס עלולה להתרחש על ידי מנגנון שנשמר המהווה בסיסי, אבל בעבר לא מוכר, ענף של פרוטאוסטזיס עצבי ובקרת איכות מיטוכונדריאלי, רלוונטי לתהליכים שבאמצעותם אגרגטים להתפשט במחלות ניווניות אנושיות.
בעוד exophers נחקרו בעיקר בבעלי חיים המבטאים עותק גבוה mCherry transgenic בתוך נוירונים מגע, פרוטוקולים אלה שימושיים באותה מידה במחקר של exophergenesis באמצעות organelles מתויג פלורסנט או חלבונים אחרים של עניין מסוגים שונים של נוירונים.
מתואר להלן התכונות הפיזיות של C. elegans exophers, אסטרטגיות לזיהוי שלהם, קריטריוני זיהוי, תזמון אופטימלי עבור כמות, פרוטוקולי צמיחה של בעלי חיים לשלוט על לחצים שיכולים לווסת את רמות ייצור exopher. יחד, פרטי הפרוטוקולים המתוארים כאן אמורים לשמש כדי לקבוע תקן לניתוח כמותי של exophers על פני מעבדות. מסמך זה מבקש לשמש משאב בתחום עבור מעבדות המבקשות לפרט מנגנונים מולקולריים שבאמצעותם מיוצרים exophers ועל ידי exophers מגיבים על ידי תאים שכנים ורחוקים.

פרוטוקול זה מתאר גישות לזיהוי וכמות של הבלטות גדולות של צבירה ו/או אורגנל (~4 μm) המיוצרות על ידי תאי C. elegans בצורה של exophers המאוגדים קרום. אנו מתארים זנים, תנאי גדילה, קריטריונים ניקוד, תזמון, ושיקולי מיקרוסקופ הדרושים כדי להקל על ניתוח של מנגנון גירוש פסולת זה.

גישות כמותיות לניקוד ב-vivo Neuronal Aggregate ו-Organelle הבלטה בוויקות Exopher גדולות ב C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and ...

אנו מאפיינים את מנגנוני in vivo של שבלט מצרפי ואברבל מתאי עצב באמצעות תהליך הנקרא אקסופרגנזה, ביולוגיה מובנת היטב שסביר להניח שרלוונטית להתפשטות פתולוגית של מחלות נוירודגנרטיביות. גישות אלה נחוצות להשגת ניקוד לשחזור של exophers עצבי מובלט ולהדגים פלטפורמה עבור ניתוח מכני של חיסול אשפה הסלולר באמצעות העברה עצבית לתאים שכנים. הגדרת מנגנוני in vivo של איך נוירונים להוציא אגרגטים עשוי למעשה להשפיע על העיצוב של אסטרטגיות חדשניות כדי לסייע בטיפול בתנאים ניווניים אנושיים.עבור מצבים בזלתיים, בית C.Elegans באותו גיל ביולוגי בטמפרטורה קבועה של 20 מעלות צלזיוס. להדמיה חיה של הדינמיקה תאית ומאפיינים של exophergenesis, למקם עד 20 בעלי חיים על כרית agaros על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית, ולשתק את בעלי החיים. מניחים בזהירות כיסוי להחליק על התולעים משותקים למקם את השקופית על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal.השתמש במטרה 10 עד 40x כדי לזהות את מישור Z הרצוי בברייטפילד, לרשום הערות של מיקום התולעת, כיוון זנב הראש, ואת מיקום הפות, המהווים ציוני דרך לזיהוי עצבי מאוחר יותר exopher. להישאר באותו מישור Z, לעבור לצפייה פלואורסצנטיות שדה רחב ב 10 עד 40x עבור הכתב הציטוסולי שנבחר, ולגלול בתוך ציר Z כדי לבחון את עומק החיה ואת ביטוי הפלואורסצנטיות במישור המוקד. לראש תהיה טבעת עצב פלואורסצנטי, והזנב המחודד יותר יכיל 1-2 נוירונים גלויים למגע הצדדי.הגדלה גבוהה יותר עם עדשה 63x יכולה לעזור לזהות את טבעת העצבים, תהליכים עצביים וגופי סומא. תחילה מומלץ לזהות את טבעת העצבים הממוקמת בראש החיה ותהליכים עצביים אופטיביים. כדי לעשות זאת, להתחיל בראש התולעת לאט לגלול דרך ציר Z כדי לזהות את המישור של טבעת העצב שבו התהליכים העצביים מחוברים.לאחר טבעת העצב זוהה, בתצוגת פלואורסצנטיות בצע את התהליך העצבי המצורף באופן מאוחר בכיוון האחורי לכיוון הפות, שם סומא יהיה ברור. לאחר הגוף או הגוף soma עגול נמצאים בפוקוס, חשוב לזהות את כל הנוירונים הסמוכים. לזיהוי נוירון מגע, מצא תחילה את ALML, ALMR ו- AVM soma, שאמורים להיות האותות הבהירים ביותר המסומנים על ידי גוף תא עגול בסוף התהליך.לאחר סומא העצבי ביותר בפוקוס כבר ממוקם, להשתמש בתא AVM, תא גחוני, כדי לעזור להקצות את הכיוון. אם הנוירון AVM נמצא באותו מישור כמו ALM, אז החיה נחה על צידה ואת הנוירון הצדדי הוא ALMR. אם נוירון AVM אינו באותו מישור כמו ALM המדובר, נוירון המגע הקרוב ביותר למישור המוקד הוא נוירון ALML.מועיל גם הוא לזהות את נוירון PVM, שהוא נוירון מגע גחוני הממוקם ליד הזנב. מישור המיקוד של PVM יציין אם נוירון המגע המוקדם הוא ALML או ALMR. אם ALM המדובר הוא באותו מישור כמו PVM, אז נוירון מגע שנצפה הוא נוירון ALML.לאחר ש-ALM המוקדת ביותר זוהתה והוקצתה, חשוב לקבוע את מיקומם של גופי ה-soma האחרים בקרבת אזור העניין ובכל מטוסי ה-Z, כדי לא לטעות ולחשוב שהם אקסופרים. לאחר נוירון מגע של עניין כבר ממוקם, ALMR או ALML, לבדוק את הנוירון עבור תחומים גדולים בולטים exopher, גדול מספיק כדי להיחשב exopher ניצן, שהוא לפחות חמישית הגודל של סומא שמקורו. אם לא נצפתה שום תחום ניצן או exopher, לבדוק עוד יותר את סומא עצבי עבור סיסם דק מצורף הנבוא מגוף סומא.אקסופרים מחוברים נוטים להיות ממוקמים קרוב יותר לסומה המקורית ובמישור Z דומה. כדי לזהות אקסופר לא מחובר, חפשו חלבונים פלואורסצנטיים מרוכזים, שלעתים קרובות בהירים יותר מהסומה. למרות שתואר כאן, יש exopher אחד גדול.ייתכן שיש יותר מישות פלואורסצנטית אחת שמקורה ב soma יחיד. חפשו אקסופרים לא מחוברים במישורי מוקד שונים ובאזור ההדרגתי המרוחק שממנו נמצאה הומה המקורית. האקסופרים בדרך כלל בולטים הרחק מהסומה בכיוון אחורי מהתהליך העצבי.בדוק אם קיימים עצמים כדוריים גדולים שלא ממוקמים ומזוהים כמוסות עצביות. למרות exophers הם בדרך כלל מבנים ספריריים, הם יכולים להיות מושפלים לאורך זמן, רכישת צורה לא סדירה יותר. חפש את נוכחותם של אירועי לילה כוכבים ומופעים של אירועי אקסופר מרובים.כדי למנוע טעות וסומה מחוץ למטוס עבור exopher, זה קריטי כדי לזהות את כל גופות סומא הסמוכות, אפילו somas מחוץ לפוקוס בתחילת התצפית. ניתן לצפות ב-soma מורחב או מחודד, אך אין להבקיע הרחבה ללא אתר התכווצות ברור כאקסופר. דחה ניצנים קטנים שנפתרו כי לא להשיג חמישית מגודלה של soma לכמת אירוע exopher.למרות נוריטים בוגרים יכולים להאריך באופן דרמטי עם הגיל, וחלבונים פלואורסצנטיים יכולים לנדוד לתוך הקצה הדיסטלי של מבנים כאלה, לא לספור נויריטים גדלים כמו exophers. כדי לזהות ישויות פלואורסצנטיות שאינן אקסופרים, הקפד לא לכלול כל שפעת אוטומטית, אשר עשוי להיות טועה עבור פסולת כלי רכב לילה כוכבים תחת פלואורסצנטיות שדה רחב. כדי לא לכלול אותות פלואורסצנטיים עובריים, לעבור בין פלואורסצנטיות ותאורת שדה בהיר, ולבדוק אם יש קשר של האות עם ביצים בתוך הרחם.טבלה זו מספקת סיכום של נוירון מגע שונה הביע כתבים פלואורסצנטיים ששימשו לניטור ייצור exopher. מטענים הידועים להיות extruded exophers כוללים אגרגטים כגון Q128, היתוך של הנטינגטון האנושי מורחב פוליגלוטמין חוזר, lysosomes GFP מתויג עם חלבון קרום הקשורים lysosomal, ו מיטוכונדריה מתויג עם מטריצה מקומית GFP. GFP ציטופלסמי אינו מגורש בחוזקה, והוא נשמר רצוי בסומה, אם כי GFP יכול לשמש כדי לדמיין באופן חלש exophers.באופן כללי, ייצור exopher על ידי ALMR נוירון הבעת mCherry בתנאים הבסיסיים מתחיל ביום הראשון של הבגרות נע בין חמישה ל 25% של ALMRs נבדק במסגרת הזמן העיקרית לייצור exopher של יום אחד עד שלוש מבוגרים. לחצים מסוימים והתגרויות גנטיות יכולים להגדיל מאוד את ייצור האקסופר בתוך נוירונים ALMR. זה חיוני כדי לאתר את כל הנוירונים הסמוכים לפני בדיקת הנוירון של עניין והסביבה עבור תחומי exopher, exophers שלם, או אירועי לילה כוכבים.כאשר אתה מרגיש בנוח עם זיהוי ידני exophers, שיטות תפוקה משופרת עבור הקרנה בקנה מידה גדול באמצעות הדמיה תוכן גבוה ניתן להשתמש, המאפשר ניתוח גנום שלם וניתוח exophergenesis מכוניסט.

quantitative-approaches-for-scoring-vivo-neuronal-aggregate-organelle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

שפע של קולטני הנוירוטרנסמיטר אשכולות על סינפסות מאוד משפיע כוח סינפטי. שיטה זו מכמת קולטני הנוירוטרנסמיטר fluorescently שכותרתו בשלושה ממדים עם רזולוציה אחת סינפסה...

כימות אוטומטי של הקרינה סינפטית<em&gt; ג elegans</em

מיקרוסקופ אלקטרונים דו-ממדי בקנה מידה גדול (EM), או ננוטומיה, הוא יישום כלל-רקמתי של EM ברזולוציה ננומטרית. כאן אנו מתארים שיטה אוניברסלית לננו-טומיה המיושמת כדי לחקור את מוח זחל דג הזברה בבריאות ובפגיעה מוחית לא פולשנית.

סריקה הילוכים בקנה מידה גדול מיקרוסקופית אלקטרונים (Nanotomy) של בריאה ונפצעו דג הזברה המוח

שלפוחית סינפטית אנדוציטוזה מזוהה על ידי מיקרוסקופ אור של pHluorin התמזגו עם שלפוחית סינפטית חלבונים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים של ספיגת שלפוחית.

מדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית

שקופים C. elegans המעי יכול לשמש"ויוו הרקמה תא" ללמוד apicobasal להן קרום ו לומן ברמה תא בודד, subcellular במהלך multicellular tubulogenesis. פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב תיוג סטנדרטי, אובדן-של-פונקציה גנטית/RNAi וגישות מיקרוסקופיים לנתח תהליכים אלה ברמה המולקולרית.

C. elegans המעי כמו המודל עבור המערכת לומן מורפוגנזה ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן ברמה תא בודד: תיוג על ידי נוגדנים מכתים, ניתוח אובדן RNAi-של-פונקציה והדמיה

מחקר זה מתאר את המידות הכמותיות של גודל ולוקליזציה, מורפולוגיה שרירים וצורה מיטוכונדרילית ב -C. אלגיה באמצעות כלים זמינים לעיבוד תמונות באופן חופשי. גישה זו מאפשרת לימודים עתידיים ב -C. אלגיה להשוות בין היקף רקמות ושינויים מבניים כתוצאה מוטציות גנטיות.

גישות כמותיים ללימוד מבנים סלולאריים ומורפולוגיה ארגונית בקנבאבדיוטיס

מוצרי העברה שאינם תלויי ATG הקשורים לחזרה מתגלים כתכונות פתוגניים של מחלות מבוססות הרחבה חוזרות. מטרת הפרוטוקול המתואר היא להעריך רעילות הנגרמת על ידי פפטידים אלה באמצעות בחני התנהגות הסלולר מערכת המודל C. אלגיה.

מדידת רעילות ב -C. אלגיה

ירידה פרוטאוסטלית היא סימן היכר של הזדקנות, להקל על תחילת מחלות ניווניות. אנו מתארים פרוטוקול כדי למדוד באופן כנותב פרוטאוסטזיס בשתי רקמות אלגנים שונים Caenorhabditis באמצעות ביטוי הטרולוגי של פוליגלוטמין חוזר התמזג לכתב פלואורסצנטי. מודל זה מאפשר ניתוח גנטי מהיר של פרוטאוסטזיס.

כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמות ב elegans Caenorhabditis

במאמר זה, אנו מציגים כיצד להשתמש במערכת ניקוד של שבע נקודות כדי לכמת באופן עקבי שינויים במורפולוגיה של נוירון דנדריט דופאמין ב- C. elegans. מערכת זו מיועדת לנתחים של בדיקות ניוון עצבי דופאמין באמצעות מודלים גנטיים, כימיים ומבוססי גיל של הפרעות ניווניות.

כימות רמות של נוירון דופאמין שינוי מורפולוגי ניוון ב elegans Caenorhabditis

הפרוטוקול הבא מתאר את הפיתוח והאופטימיזציה של זרימת עבודה בתפוקה גבוהה עבור גידול תולעים, הדמיה פלואורסצנטית ועיבוד תמונה אוטומטי כדי לכמת אגרגטים של פוליגלוטמין כהערכה של שינויים בפרוטאוסטזיס.

אוטומציה של כימות מצטבר ב - Caenorhabditis elegans

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת הפעילויות הנוירו-הגנתיות של תרכובות בדיקה ב - Caenorhabditis elegans, כולל צבירה של פוליגלוטמין, מוות עצבי והתנהגות כימואבואידית, כמו גם שילוב מופתי של פנוטיפים מרובים.

Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לגילוי תרכובות ביו-אקטיביות נגד רעילות עצבית בתיווך פוליגלוטמין

למד שיטות כמותיות לניקוד אקסופרים נוירונליים ב-C. elegans באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצניה חיה. חקור את מנגנוני הדחייה של אגרגטים ואברונים ואת השלכותיהם למחלות נוירודגנרטיביות.

גישות כמותיות לניקוד ב-vivo Neuronal Aggregate ו-Organelle הבלטה בוויקות Exopher גדולות ב C. elegans

גלה סרטונים נוספים