יישום של מיקרו-דיסקציה בלייזר לחשיפת תעתיקים אזוריים ברקמת הכליה האנושית
9 ביוני 2020
אנו מתארים פרוטוקול למיקרו-דיסקציה בלייזר של תת-מקטעים של הכליה האנושית, כולל הגלומרולוס, צינורית פרוקסימלית, איבר עולה עבה, צינור איסוף ואינטרסטיציום. לאחר מכן, ה- RNA מבודד מהתאים המתקבלים ורצף ה- RNA מתבצע כדי לקבוע שינויים בחתימה התמלולומית בתוך כל מקטע משנה.
מיקרו-דיסקציה בלייזר מאפשרת ניתוח טרנסקריפטומי של אזורים מוגדרים מרחבית בתוך דגימות רקמת הכליה. זה מאפשר לנו הזדמנות ייחודית לזהות מבנים מעניינים גם לאחר שהתרחשו שינויים שנגרמו על ידי מחלה. היתרונות העיקריים של מתודולוגיה זו הם השלמתה לטכנולוגיות אומיקס אחרות, כגון ריצוף RNA של תא בודד.
זה מאפשר כלכלת רקמות יוצאת דופן ואפילו מאפשר זיהוי של תעתיקים בעלי ביטוי נמוך. לאחר רכישת דגימת הרקמה, השתמש בקריוסטט המוגדר למינוס 20 מעלות צלזיוס כדי לחתוך את הדגימה לעובי של 12 מיקרומטר והשתמש במתאם השקופיות כדי לקבע את הדגימה לשקופית מיקרו-דיסקציה לייזר מיוחדת. תוך 10 ימים מרגע ההקפאה, ערבבו 89.2 מיקרוליטר של 10% BSA נטול RNase ב-PBS עם ארבעה מיקרוליטרים של פלואידין FITC, 1.5 מיקרוליטר של DAPI, שני מיקרוליטרים של הנוגדן המעניין מצומד ישירות ל-Alexa Fluor 546, ו-3.3 מיקרוליטר של מעכב RNase.
שטפו את המגלשה במינוס 20 מעלות צלזיוס 100% אצטון למשך דקה אחת והניחו את המגלשה בתא לחות. שטפו את החלק העליון של המגלשה פעמיים עם PBS טרי ללא RNase למשך 30 שניות לכל כביסה, ולאחר מכן שתי שטיפות של 30 שניות עם 10% BSA ב-PBS ללא RNase. לאחר הכביסה האחרונה, יש לטפל בדגימה בתמיסת הנוגדנים המוכנה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לפני שטיפה פעמיים נוספות עם 10% BSA ב-PBS נטול RNase.
לאחר הכביסה השנייה, יבש את השקופית באוויר למשך חמש דקות במכסה מנוע לתרבית רקמות לפני העמסת השקופית על פלטפורמת החיתוך של מיקרו-דיסקציה בלייזר. התקן על המכשיר צינורות איסוף מיקרו-צנטריפוגות בנפח 500 מיקרוליטר, המתאימים לעבודת PCR, המכילים 50 מיקרוליטר של מאגר מיצוי מערכת בידוד RNA. לאחר הטעינה, זהה אזורי עניין בתוך הדגימה על ידי צביעה, מורפולוגיה ומיקום.
השתמש באימונופלואורסצנציה כדי לשרטט לפחות 500,000 מיקרומטר מקטעים רבועים מעניינים. לאחר מכן התחל את המיקרו-דיסקציה של הלייזר כדי לכרות את האזור באמצעות עוצמת לייזר של יותר מ-40. עם השלמת תהליך המיקרו-דיסקציה בלייזר, כסו את צינורות איסוף המיקרו-צנטריפוגות והזיזו את הצינורות במרץ כדי להבטיח שהתוכן יעבור מהכובעים לתחתית הצינורות.
לאחר הצנטריפוגה, דגרו את הצינורות באמבט מים של 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני שצנטריפוגה שוב את הצינורות. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנטים לצינורות חדשים של 500 מיקרוליטר מאחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס. זיהוי תת-מקטעים צינוריים בכליה מתבצע באמצעות צביעת נוגדנים של סמנים צינוריים ייחודיים בנוסף למורפולוגיה של התא ונקודות ציון מבניות.
תיוג פלואורסצנטי בשילוב עם מאפייני רקמה מורפולוגית והמיקום המרחבי של מבני התמונה מקל על הדמיה של תת-מקטעי כליה ברמת ביטחון גבוהה. בניתוח ריצוף מייצג זה במורד הזרם, שיעור ההצלחה של עמידה בקלט שטח הדיסקציה המינימלי היה גדול מ-90% וכתוצאה מכך כמות mRNA כוללת גבוהה זמינה לזיהוי גנים. בניתוח זה, 100% מהדגימות עמדו בסף הזיהוי המינימלי של לפחות 10,000 גנים.
לאחר מיקרו-דיסקציה בלייזר, ניתן להשוות ניתוח העשרה של ביטוי הגנים של סמנים ידועים לאלו מתאים אחרים. בניתוח זה, זוהה סמן אחד לכל תת-מקטע באמצעות טרנסקריפטומיקה אזורית של מיקרו-דיסקציה בלייזר שהניבה גם צביעה אימונוהיסטוכימית ספציפית של תת-מקטע הנפרון המתאים. חשוב לציין שמיקרו-דיסקציה בלייזר מסתמכת במידה רבה על המומחיות של המשתמש כדי לזהות במדויק את המבנים המעניינים שיש לנתח.
טכניקה זו מאפשרת לחקור חתימות ביטוי גנים אזוריות ספציפיות שניתן להשתמש בהן כדי להעריך מסלולים פוטנציאליים המעורבים בהתקדמות המחלה, כמו גם את הביולוגיה של רקמה בריאה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול למיקרודיסקציה בלייזר של תתי-מקטעים ספציפיים ברקמת כליה אנושית, כולל הגלומרולוס והשפופרת הפרוקסימלית. ה-RNA המבודד ממדורים אלו מאפשר ניתוח טרנסקריפטומי כדי לחשוף שינויים בדפוסי ביטוי גנים הקשורים למבני כליה שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- ניתוח טרנסקריפטומי
- ביולוגיה של הכליה
- חקירת התקדמות מחלה
רקע
- חשיבות חקר תתי-מקטעי הכליה
- אתגרים בניתוח מבנים מוגדרים מרחבית לאחר מחלה
- משלימות עם טכנולוגיות אומיקס אחרות
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיקרודיסקציה בלייזר (Laser microdissection)
- דגימות רקמת כליה אנושית
- בידוד וריצוף RNA
תוצאות עיקריות
- שיעור הצלחה גבוה בדיסקציה ובשחזור RNA
- זיהוי סמני ביטוי גנים לתתי-מקטעים של הכליה
- הדגמה של מסלולים פוטנציאליים הקשורים להתקדמות המחלה
מסקנות
- פרוטוקול זה מדגים שיטה יעילה לחקר ביטוי גנים אזורי בכליה.
- הממצאים תורמים להבנת הביולוגיה של הכליה ומנגנוני מחלה פוטנציאליים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרו-דיסקציה בלייזר מאפשרת פרופיל טרנסקריפטומי ברזולוציה מרחבית של רקמת כליה אנושית, ובכך נותנת מענה לפער קריטי בביולוגיה של גילוי, שבו שיטות המבוססות על דיסוציאציה מאבדות את ההקשר האנטומי. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות על ידי קישור חתימות של ביטוי גנים לסגמנטים תת-מרכיבים מוגדרים של הנפרון, ובכך משפרת את הפחתת הסיכונים המכניסטיים במודלים של מחלות כליה. השיטה מספקת ביטחון חיזוי לבחינת מסלולים ותיעדוף פורטפוליו בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מיפוי ביטוי גנים למדורות אנטומיות מוגדרות של הכליה.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות חתימות טרנסקריפטומיות מעוגנות מרחבית השומרות על ההקשר הרקמתי.
- ערך ניבוי: מסייע בביסוס רמת הביטחון ביעד על ידי מתאם בין ביטוי סמנים אזוריים לבין זהות תתי-סגמנטים פונקציונלית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור תהליכי עבודה של אומיקה (omics) בשלבים הבאים, באמצעות בידוד של RNA בעל שלמות גבוהה מאזורים שעברו מיקרו-דיסקציה.
- ערך תפעולי: הבטחת סטנדרטיזציה ושחזור של הבדיקה באמצעות פרמטרי בקרת איכות (QC) המעריכים את הלימות הדגימה ואת שיעורי ההצלחה של הדיסקציה.
- יכולת הרחבה (Scalability): מאפשרת הערכה מהימנה של תרכובות על ידי אספקת תוצאות טרנסקריפטומיות כמותיות בעלות רזולוציה מרחבית עבור קמפיינים של סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת between ממצאי תגליות ובין תיקוף פרה-קליני באמצעות מידול מערכות רלוונטיות למחלה תוך שימוש בתת-מקטעים של כליה אנושית.
- סנכרון ביומרקרים: תומכת בפיתוח ביומרקרים תרגומיים על ידי זיהוי פרופילים של ביטוי גנים ספציפיים למדורים הניתנים לזיהוי ברקמה.
- קידום מותאם סיכונים: מספקת בסיס לקבלת החלטות פרה-קליניות על ידי חשיפת פעילות של מסלולים באזורים מדויקים מבחינה אנטומית המושפעים מהמחלה.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow Integration)
מיקרו-דיסקציה בלייזר משתלבת ברצף הגילוי, מבדיקת השערות ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ומאפשרת פרופיל מולקולרי ברזולוציה מרחבית המגשר בין דימות לאומיקה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבחינת השערות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי קישור ביטוי גנים לנקודות ציון מבניות ברקמת הכליה.
- סריקה: מספק מוכנות לבדיקה באמצעות שיעור הצלחה גבוה בנתיחה (>90%) ותפוקת RNA מספקת ליישומי ריצוף.
- אנליטיקה: מספק מדידות כמותיות של משתנים תלויים (ספי סביליות לגילוי גנים ≥10,000 גנים) המאפשרים השוואה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקדם רציפות פרה-קלינית על ידי שימור ההקשר המרחבי שאובד בשיטות המבוססות על דיסוציאציה.
- שימוש חוזר בארגון: משמש כיכולת ניתנת לשימוש חוזר על פני סוגי רקמות שונים באמצעות החלפת סממני נוגדנים, ובכך תומך באימוץ רחב של הפלטפורמה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות כלייתיות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות פרמטרי זרימת עבודה מוגדרים ונקודות בקרה של QC.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי מתן אפשרות לתעדוף מותאם סיכונים המבוסס על ביולוגיה ספציפית לסגמנט-משנה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך ביעילות הון באמצעות הפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות כלייתיות באמצעות ראיות עם רזולוציה מרחבית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בצביעה אימונופלורסצנטית ובזיהוי מורפולוגי של תתי-מקטעים כלייתיים.
- תלוי בפלטפורמות של מיקרודיסקציה בלייזר ובערכות לבידוד RNA התואמות דגימות עם כמות חומר נמוכה (low-input).
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור פרוטוקולי צביעה, ספי סריקה לדיסקציה ומדדי בקרת איכות (QC).
- התאמה בין מודלים שונים מחייבת תיקוף של סממני נוגדנים ונקודות ציון מבניות ברקמות היעד.
- מגבלות מעשיות כוללות דיוק תלוי-משתמש בזיהוי האזורים ושמירה על שלמות ה-RNA במהלך העיבוד.
