יישום של מיקרו-דיסקציה בלייזר לחשיפת תעתיקים אזוריים ברקמת הכליה האנושית
June 9th, 2020
אנו מתארים פרוטוקול למיקרו-דיסקציה בלייזר של תת-מקטעים של הכליה האנושית, כולל הגלומרולוס, צינורית פרוקסימלית, איבר עולה עבה, צינור איסוף ואינטרסטיציום. לאחר מכן, ה- RNA מבודד מהתאים המתקבלים ורצף ה- RNA מתבצע כדי לקבוע שינויים בחתימה התמלולומית בתוך כל מקטע משנה.
מיקרו-דיסקציה בלייזר מאפשרת ניתוח טרנסקריפטומי של אזורים מוגדרים מרחבית בתוך דגימות רקמת הכליה. זה מאפשר לנו הזדמנות ייחודית לזהות מבנים מעניינים גם לאחר שהתרחשו שינויים שנגרמו על ידי מחלה. היתרונות העיקריים של מתודולוגיה זו הם השלמתה לטכנולוגיות אומיקס אחרות, כגון ריצוף RNA של תא בודד.
זה מאפשר כלכלת רקמות יוצאת דופן ואפילו מאפשר זיהוי של תעתיקים בעלי ביטוי נמוך. לאחר רכישת דגימת הרקמה, השתמש בקריוסטט המוגדר למינוס 20 מעלות צלזיוס כדי לחתוך את הדגימה לעובי של 12 מיקרומטר והשתמש במתאם השקופיות כדי לקבע את הדגימה לשקופית מיקרו-דיסקציה לייזר מיוחדת. תוך 10 ימים מרגע ההקפאה, ערבבו 89.2 מיקרוליטר של 10% BSA נטול RNase ב-PBS עם ארבעה מיקרוליטרים של פלואידין FITC, 1.5 מיקרוליטר של DAPI, שני מיקרוליטרים של הנוגדן המעניין מצומד ישירות ל-Alexa Fluor 546, ו-3.3 מיקרוליטר של מעכב RNase.
שטפו את המגלשה במינוס 20 מעלות צלזיוס 100% אצטון למשך דקה אחת והניחו את המגלשה בתא לחות. שטפו את החלק העליון של המגלשה פעמיים עם PBS טרי ללא RNase למשך 30 שניות לכל כביסה, ולאחר מכן שתי שטיפות של 30 שניות עם 10% BSA ב-PBS ללא RNase. לאחר הכביסה האחרונה, יש לטפל בדגימה בתמיסת הנוגדנים המוכנה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לפני שטיפה פעמיים נוספות עם 10% BSA ב-PBS נטול RNase.
לאחר הכביסה השנייה, יבש את השקופית באוויר למשך חמש דקות במכסה מנוע לתרבית רקמות לפני העמסת השקופית על פלטפורמת החיתוך של מיקרו-דיסקציה בלייזר. התקן על המכשיר צינורות איסוף מיקרו-צנטריפוגות בנפח 500 מיקרוליטר, המתאימים לעבודת PCR, המכילים 50 מיקרוליטר של מאגר מיצוי מערכת בידוד RNA. לאחר הטעינה, זהה אזורי עניין בתוך הדגימה על ידי צביעה, מורפולוגיה ומיקום.
השתמש באימונופלואורסצנציה כדי לשרטט לפחות 500,000 מיקרומטר מקטעים רבועים מעניינים. לאחר מכן התחל את המיקרו-דיסקציה של הלייזר כדי לכרות את האזור באמצעות עוצמת לייזר של יותר מ-40. עם השלמת תהליך המיקרו-דיסקציה בלייזר, כסו את צינורות איסוף המיקרו-צנטריפוגות והזיזו את הצינורות במרץ כדי להבטיח שהתוכן יעבור מהכובעים לתחתית הצינורות.
לאחר הצנטריפוגה, דגרו את הצינורות באמבט מים של 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני שצנטריפוגה שוב את הצינורות. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנטים לצינורות חדשים של 500 מיקרוליטר מאחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס. זיהוי תת-מקטעים צינוריים בכליה מתבצע באמצעות צביעת נוגדנים של סמנים צינוריים ייחודיים בנוסף למורפולוגיה של התא ונקודות ציון מבניות.
תיוג פלואורסצנטי בשילוב עם מאפייני רקמה מורפולוגית והמיקום המרחבי של מבני התמונה מקל על הדמיה של תת-מקטעי כליה ברמת ביטחון גבוהה. בניתוח ריצוף מייצג זה במורד הזרם, שיעור ההצלחה של עמידה בקלט שטח הדיסקציה המינימלי היה גדול מ-90% וכתוצאה מכך כמות mRNA כוללת גבוהה זמינה לזיהוי גנים. בניתוח זה, 100% מהדגימות עמדו בסף הזיהוי המינימלי של לפחות 10,000 גנים.
לאחר מיקרו-דיסקציה בלייזר, ניתן להשוות ניתוח העשרה של ביטוי הגנים של סמנים ידועים לאלו מתאים אחרים. בניתוח זה, זוהה סמן אחד לכל תת-מקטע באמצעות טרנסקריפטומיקה אזורית של מיקרו-דיסקציה בלייזר שהניבה גם צביעה אימונוהיסטוכימית ספציפית של תת-מקטע הנפרון המתאים. חשוב לציין שמיקרו-דיסקציה בלייזר מסתמכת במידה רבה על המומחיות של המשתמש כדי לזהות במדויק את המבנים המעניינים שיש לנתח.
טכניקה זו מאפשרת לחקור חתימות ביטוי גנים אזוריות ספציפיות שניתן להשתמש בהן כדי להעריך מסלולים פוטנציאליים המעורבים בהתקדמות המחלה, כמו גם את הביולוגיה של רקמה בריאה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול למיקרו-גזירה בלייזר של תת-מקטעים ספציפיים בתוך רקמת כליה אנושית, כולל הגלומרולוס והצינורית הפרוקסימלית. ה-RNA המבודד מהתאים הללו מאפשר ניתוח טרנסקריפטומי כדי לחשוף שינויים בדפוסי ביטוי הגנים הקשורים למבני כליה שונים.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום מחקר
- ניתוח טרנסקריפטומי
- ביולוגיה של הכליה
- חקירת התקדמות המחלה
רקע
- חשיבות חקר תת-מקטעי הכליה
- אתגרים בניתוח מבנים מוגדרים מרחבית לאחר מחלה
- שילוביות עם טכנולוגיות אומיקס אחרות
שיטות בשימוש
- מיקרו-גזירה בלייזר
- דגימות רקמת כליה אנושית
- בידוד וריצוף RNA
תוצאות עיקריות
- שיעור הצלחה גבוה בגזירה ושחזור RNA
- זיהוי מרכיבי ביטוי גנים עבור תת-מקטעי הכליה
- מסלולי פוטנציאל הקשורים להתקדמות המחלה שהוכחו
מסקנות
- פרוטוקול זה מדגים שיטה יעילה לחקר ביטוי גנים אזוריים בכליה.
- הממצאים תורמים להבנת ביולוגיה של הכליה ומנגנוני מחלה פוטנציאליים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Laser microdissection enables spatially resolved transcriptomic profiling of human kidney tissue, addressing a critical gap in discovery biology where dissociation-based methods lose anatomical context. This approach supports target validation by linking gene expression signatures to defined nephron sub-segments, enhancing mechanistic de-risking in renal disease models. The method provides predictive confidence for pathway interrogation and portfolio prioritization in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping gene expression to anatomically defined kidney compartments.
- Operational Value: Supports biological de-risking through spatially anchored transcriptomic signatures that maintain tissue context.
- Predictive Value: Facilitates target confidence by correlating regional marker expression with functional sub-segment identity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream omics workflows by isolating high-integrity RNA from microdissected regions.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through QC parameters assessing specimen adequacy and dissection success rates.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation by providing quantitative, spatially resolved transcriptomic outputs for screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery findings to preclinical validation through disease-relevant system modeling using human kidney sub-segments.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development by identifying compartment-specific gene expression profiles detectable in tissue.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs preclinical decision-making by revealing pathway activity in anatomically precise disease-affected regions.
Pipeline & Workflow Integration
Laser microdissection fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, enabling spatially resolved molecular profiling that bridges imaging and omics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking gene expression to structural landmarks in kidney tissue.
- Screening: Delivers assay readiness through high-success-rate dissection (>90%) and sufficient RNA yield for sequencing applications.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (gene detection thresholds ≥10,000 genes) enabling cross-condition comparison.
- Translational Research: Advances preclinical continuity by preserving spatial context lost in dissociation-based methods.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across tissue types via antibody marker substitution, supporting platform-wide adoption.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in renal target validation.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through defined workflow parameters and QC checkpoints.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling risk-adjusted prioritization based on sub-segment-specific biology.
- Portfolio Impact: Supports capital efficiency through early de-risking of renal targets using spatially resolved evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence staining and morphological identification of renal sub-segments.
- Dependent on laser microdissection platforms and RNA isolation kits compatible with low-input samples.
- Necessitates cross-team standardization for staining protocols, dissection thresholds, and QC metrics.
- Adaptation across models requires validation of antibody markers and structural landmarks in target tissues.
- Practical limitations include user-dependent precision in region identification and RNA integrity maintenance during processing.
