מודל תרבות תא לחקר התפקיד של אינטראקציות נוירון-גליה באיסכמיה
14 בנובמבר 2020
כאן, אנו מציגים גישה פשוטה באמצעות מדיה תרבותית ספציפית המאפשרת הקמת תרבויות מועשרות בנוירון ואסטרוקייט, או תרבויות נוירון-גליה מקליפת המוח העוברית, עם תשואה גבוהה ושחזור.
שבץ איסכמי הוא מצב קליני המאופיין hypoperfusion של רקמת המוח ותוצאות אובדן עצבי. עדויות רבות מצביעות על כך שהאינטראקציה בין גליה לתאי המשתנה מפעילה את השפעות הלחץ לאחר אירוע איסכמי. על מנת לחקור מנגנוני הגנה פוטנציאליים, חשוב לפתח מודלים המאפשרים ללמוד אינטראקציות נוירון-גליה בסביבה איסכמית.
כאן אנו מציגים גישה פשוטה לבודד אסטרוציטים ותאי עצב מקליפת המוח העוברית של חולדה, ועל ידי שימוש במדיום תרבותי ספציפי מאפשר הקמת תרבויות נוירון או אסטרוציטים מועשרים או תרבויות ניאו גליה עם תשואה גבוהה ושחזור. כדי לחקור את ההצלבה בין אסטרוציטים לנוירונים, אנו מציעים גישה, המבוססת על מערכת תרבת שותף, שבה נוירונים המתרבים בתגיות כיסוי נשמרים במגע עם מונוליאר של אסטרוציטים מצופים בצלחות מרובות בארות. שתי התרבויות נשמרות בחלקן על ידי ספירות פרפין קטנות.
גישה זו מאפשרת מניפולציה עצמאית ויישום של טיפול ספציפי לכל סוג תא, המהווה יתרון במחקרים רבים. כדי לדמות את מה שקורה במהלך שבץ איסכמי, התרבויות כפופות לפרוטוקול מניעת חמצן וגלוקוז. פרוטוקול זה מייצג כלי שימושי לחקר התפקיד של אינטראקציות נוירון גליה בשבץ איסכמי.
התחל עם בידוד קליפת המוח העוברית של חולדה. העוברים הושגו ממשפחה של חולדות ב 15 ימים של הריון והם ממוקמים בצינור פלקון סטרילי המכיל PBS. עדיין בתוך עוברי שקית החלמון ממוקמים בתוך צלחת פטרי המכילה PBS קר.
בעזרת מספריים ופינצטה, שאק החלמון שבור, העובר מוסר ומונח בצלחת פטרי אחרת המכילה PBS קר מעל חבילת קרח. יש צורך להיות זהיר מאוד בעת שבירת שם החלמון לא לפגוע בעובר. מקם את העובר תחת מיקרוסקופ ניתוח, בעדינות לתקן את העובר באמצעות טוויזר.
החתך הראשוני צריך להיות מקביל לקליפת המוח. תיזהר לא לערוף את ראשו של החיה. הקרקפת מוסרים בזהירות לא לפגוע ברקמת המוח קליפת המוח.
החתך הבא מפריד בין קליפת המוח. הסר את כלי הדם הקיימים ברקמה. לבסוף, באמצעות פיפטה, להעביר את הרקמה קליפת המוח לצינור פלקון עם PBS.
ההשעיה של תא יחיד מתקבלת באמצעות עיכול מכני של רקמת המוח קליפת המוח באמצעות טיפים עם קוטר יורד. ודא כי הרקמה היא הומוגנית היטב לאחר העיכול, צנטריפוגה החומר ב 400 Gs במשך שלוש דקות. השליכו את העל-טבעי, והתינו מחדש את המעים במדיום התרבותי, שהתחמם בעבר ל-37 מעלות.
לחשב את המספר הכולל של תאים נוכח ההשעיה באמצעות תא Neubauer ולה מכין את הדילול עבור צפיפות התא נאותה. לבסוף, לזרוע את התאים רב היטב דגירה ב 37 מעלות. על מנת להכין את החומר למערכת התרבות המשותף, מחממים את הפרפין בבלוק חימום עד שהוא הופך לנוזל.
לאחר מכן, בעזרת פיפטה פסטור זכוכית סטריאו להכין כדורים קטנים מעל תלושי הכיסוי שהוצבו בעבר רב באר, מצופה פולי D-לינזין. 24 שעות לפני שתי התרבויות מובאים במגע, לשנות את מדיום התרבות של נוירונים ואסטרוציטים כדי להשלים אותו NBM עם או בלי חום מושבת FBS. כאשר שתי התרבויות מוכנות לשימוש, להעביר את הנוירון, יושב בכיסוי מחליק עם כדורי פרפין ל בארות המכילות אסטרוציטים באמצעות פינצטה בעבר שקוע 70% אתנול.
לאחר הצבת שני סוגי התאים במגע, המתן 8 עד 12 שעות ולאחר מכן התחל את הגירויים וההליכים השונים. מחסור בחמצן וגלוקוז מבוצע בתרבות עם שבעה ימים של צמיחה. הסר את מדיום התרבות, ולשטוף את התאים פעמיים עם מדיום HBSS ללא תוספת גלוקוז.
ודא כי כל המדיום המכיל גלוקוז נשטף. לאטום את תא היפוקסיה ולהוסיף את תערובת הגז המכיל 95% חנקן ו 5% פחמן דו חמצני במשך ארבע דקות עם זרימה של 20 ליטר במשך דקות כדי להחליף את החמצן הנוכחי בתוך התא. לאחר מכן, לעצור את הזרימה ולמקום את תא היפוקסיה באינקובטור ב 37 מעלות.
לאחר תקופת מחסור בחמצן וגלוקוז, החלף את המדיום, HBSS ללא תוספת גלוקוז עם מדיום התרבות המתאים להליכים הנותרים ותמהר את התאים ב -37 מעלות. על מנת לאפיין את סוג התרבות הקורטית, ביצענו אימונוהיסטוכימיה בשלושת הסוגים של תרבות קליפת המוח כדי להעריך את מספר התאים שהביעו GFPA או MAP2, שהם סמנים בשימוש נרחב עבור תאים אסטרוציטים ונוירונים בהתאמה. ניתוחים אלה גילו כי כאשר פרוטוקול זה, הצלחנו להשיג תרבות מועשרת טהורה של אסטרוציטים עם כ 97% מהתאים המבטאים GFAP.
לגבי התרבות המועשרת בנוירונים, אימתנו כ-78% מהתאים המבטאים MAP2. עם זאת אנו מזהים כ -18% של תאים שליליים GFAP ו- MAP2. עבור תרבות קליפת המוח נוירון גליה, זה נצפתה כי כ 49% מהתאים הם MAP2 חיובי.
31%הם חיוביים GFAP. ו-20%הם לא אחראים ל-GFAP ולא ל-MAP2. שבעה ימים לאחר הקמת התרבות הקורטית, תרבות הנוירונים-גליה והתרבות המועשרת בנוירונים היו נתונים להליך OGD במשך 4 ו -6 שעות.
לאחר הליך זה, התאים תויגו עם MAP2 ולאחר מכן מספר התאים החיוביים MAP2 כומתו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטי. בתרבות נוירון-גליה, זה נצפתה ירידה של כ 30% במספר הנוירונים, כאשר התרבות הוגשה לתקופה OGD של 4 שעות. לאחר תקופת OGD של 6 שעות, הארכת ההנעה עולה, להגיע על 60% של אובדן עצבי.
לגבי התרבות המועשרת של נוירונים שנחשפו OGD, זה נצפתה על 41%ו 64% ירידה במספר תאי MAP2. יתר על כן, נצפתה כי בתרבות המועשרת בנוירונים, חלה עלייה קלה בהרחבת הפציעה בהשוואה לתרבות הנוירונים-גליה שנחשפה גם ל- OGD במהלך 4 שעות. לסיכום, כאן מייצגים מודל במבחנה ללמוד שבץ איסכמי שהוקם בצורה פשוטה, מהירה ויקרה וניתנית לשחזור.
בנוסף, השיטה המתוארת מאפשרת גם ליישם נוירונים ותרבויות ראשוניות מועשרות אסטרוציטים, אך גם תרבות נוירונים-גליה. לכן, מתן מודל in-vitro גדול עבור מודל מספר מחלות מוח עם רמה גבוהה יותר של מורכבות, מאשר קווי תאים מונצחים תרבויות עצביות או גליה טהור.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לבידוד אסטרוציטים ונוירונים מקליפת המוח העוברית של חולדה באמצעות מצעי תרבית ספציפיים, המאפשרים הקמה של תרביות מועשרות של נוירונים ואסטרוציטים, כמו גם תרביות משולבות (co-cultures) של נוירונים וגליה. המחקר בוחן את האינטראקציות בין נוירונים לגליה בהקשר של שבץ איסכמי, תוך שימוש בפרוטוקול של מחסור בחמצן ובגלוקוז כדי לדמות תנאים איסכמיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- תרבית תאים
- מחקר על שבץ מוחי איסכמי
רקע
- שבץ מוחי איסכמי מוביל לאובדן נוירונים עקב היפופרפוזיה.
- תאים גליאליים ממלאים תפקיד משמעותי בתגובה הנוירונלית לאחר שבץ.
- הבנת האינטראקציות בין נוירונים לגליות היא קריטית לחקר מנגנונים נוירופרוטקטיביים.
- פיתוח מודלים in vitro יכול לסייע בחקר אינטראקציות אלו תחת תנאי איסכמיה.
מטרת המחקר
- בידוד וגידול של אוכלוסיות ספציפיות של נוירונים ותאי גליה מקורטקס של חולדה עוברית.
- יצירת מערכת של תרבית משותפת (co-culture) המאפשרת מניפולציה עצמאית של נוירונים ואסטרוציטים.
- סימולציה של תנאים איסכמיים וחקר אינטראקציות בין נוירונים לגליה בסביבה זו.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הפלטפורמה העיקרית המשמשת היא מערכת לתרבית תאים.
- המודלים הביולוגיים המרכזיים כוללים תרביות של נוירונים-גליה המופקות מקורטקס עוברי של חולדה.
- התרביות עוברות פרוטוקול של מחסור בחמצן ובגלוקוז כדי לדמות שבץ איסכמי.
- שלבים קריטיים כוללים בידוד של הקורטקס, הכנת סספנסיה של תאים בודדים ויצירת תרבית משולבת (co-culture) עם כדורי פאראפין.
- אימונוהיסטוכימיה משמשת להערכת סוגי התאים והטוהר לאחר הקמת התרבית.
תוצאות עיקריות
- התרבית המשולבת אפשרה לבחון ביעילות אינטראקציות בין נוירונים לגליות תחת תנאי איסכמיה.
- בתרביות של נוירונים וגליות, נצפה אובדן משמעותי של נוירונים לאחר חשיפה למחסור בחמצן ובגלוקוז.
- צביעה אימונוהיסטוכימית העלתה טוהר גבוה בתרביות של אסטרוציטים ונוכחות ניורונית משמעותית בתרביות מעשירות נוירונים.
- ניכר הבדל בולט באובדן הנוירונים בין תרביות מעשירות נוירונים לבין תרביות של נוירונים וגליות לאחר תנאי איסכמיה.
מסקנות
- מחקר זה מספק שיטה מהימנה להקמת תרביות של נוירונים וגליות, ובכך משפר את ההבנה של השפעות שבץ איסכמי.
- מערכת תרבית-המשותפת יכולה להקל על מחקרים ממוקדים של אסטרטגיות טיפוליות למצבים איסכמיים.
- לממצאים אלו השלכות על פיתוח טיפולים והבנת התגובות התאיות בפגיעות הקשורות לשבץ.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל זה מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות נוירו-פרוטקטיביות על ידי אספקת מערכת in vitro הניתנת לשחזור לחקר האינטראקציה (crosstalk) בין נוירונים לגליות בתנאי איסכמיה. הוא תומך בתיקוף מטרות ובפיתוח בדיקות עבור טיפולים בשבץ מוחי, על ידי מתן אפשרות למניפולציה עצמאית של אוכלוסיות נוירונליות וגליאליות. גישה זו מגבירה את הביטחון בניבוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי סימולציה של מחסור בחמצן ובגלוקוז, תוך שימור תגובות ספציפיות לסוג התא.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות בנוגע להגנה עצבית המתווכת על ידי תאי גליאה בפגיעה איסכמית.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף של מטרות פונקציונליות באמצעות יישום טיפול ספציפי לסוגי תאים.
- ערך ניבוי: תומך במיון פורטפוליו על ידי כימות הבדלי אובדן נוירונים בין תרביות מועשרות לתרביות משולבות (co-cultures).
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנה של מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקת תרכובות עם תפוקה גבוהה והדירות.
- פלט כמותי: הפקה של קריאות מדידות של חיוניות נוירונלית באמצעות כימות תאים חיוביים ל-MAP2.
- סקילביליות: מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה להערכות של תרכובות נוירופרוטקטיביות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מידול של הפתופיזיולוגיה של שבץ איסכמי באמצעות הפרשת חמצן וגלוקוז בתרבית משותפת של נוירונים וגליות.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי שימור אינטראקציות בין סוגי תאים הקריטיות לתגובת הפגיעה.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מידע לקבלת החלטות על קידום המחקר בהתבסס על הגנה עצבית דיפרנציאלית בתרבית משותפת לעומת מערכות עשירות בנוירונים.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות על מטרות ועד לזיהוי מובילים (leads), ובכך מספקת מערכת רלוונטית למחלה לצורך סריקה מכניסטית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבירור מסלולים ביולוגיים על ידי בידוד אינטראקציות בין נוירונים וגליה תחת עקה איסכמית מבוקרת.
- סריקה: מספקת סטנדרטיזציה של הבדיקה ומדדי הישרדות נוירונלית כמותיים להערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של מוות תאי בין סוגי תרביות שונים באמצעות כימות מבוסס פלואורסצנציה.
- מחקר תרגומי: שומרת על תקשורת הדדית (crosstalk) בין גליה לנוירונים, החיונית למידול התקדמות פגיעות הקשורות לשבץ מוחי.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת תרבית משותפת (co-culture) ניתנת להרחבה, הישמימה למספר מודלים של מחלות נוירודגנרטיביות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכנית בנוגע לתרומת התאי הדבקים (glia) לפגיעה איסכמית.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור וסטנדרטיזציה במחקרי אינטראקציה בין נוירונים לתאי דבק.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של "המשך/עצור" (go/no-go) על ידי חשיפת נוירופרוטקציה תלוית-הקשר.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות בהתאם לסיכון, בהתבסס על נתוני יעילות של תרביות משולבות (co-culture).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד תאי קליפה ראשוניים ובטכניקות של תרביות משולבות (co-culture).
- תלוי בגישה לתא היפוקסיה ובתזמון מדויק של הפרדת חמצן וגלוקוז.
- מחייב סטנדרטיזציה של הכנת כדורי פראפין להשגת הפרדה עקבית של תאים.
- כולל שיקולי התאמה בעת מעבר למקורות תאים אנושיים או מכחוליות של מכרסמים מבוגרים.
- מוגבל בשל חוסר יכולתו של המודל לשחזר באופן מלא רכיבים וסקולריים או חיסוניים של שבץ in vivo.
