שיטות ששונו לטעינת לוחות מיצוי DNA בתפוקה גבוהה להפחית את הפוטנציאל לזיהום

פרוטוקול זה מספק טכניקה להגברת היעילות של טעינת צלחת מיצוי DNA 96 באר בעת ובעונה אחת להקטין את הסיכון של זיהום לחצות מדגם. טכניקה זו מפחיתה את הסיכויים לזיהום במהלך השלב הראשון הקריטי של מיצוי DNA באמצעות תוספת אישית של דגימות לכל באר בצלחת 96-well. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על כל אחד מהתחומים המגוונים של מחקר המיקרוביום.

לפני תחילת ניסוי, ערפל העליון הספסל עם 70% אתנול. לאחר הניגוב, תנו לספסל להתייבש באוויר לפני שריססו את הספסל ב-10% אקונומיקה. לאחר הניגוב וייבוש האוויר, טובלים את המספריים המיקרוסקופיים, המרוחיים והמסובבים לתוך 95% אתנול וחושפים את הכלים ללהבה.

לאחר מכן טובלים כל כלי ב-10% אקונומיקה ומאפשרים לכלים להתייבש באוויר. לפני תת דגימה, אתנול לעקר כפפות ביסודיות הומוגניזציה דגימות הקרקע. לאחר מכן הקצה מזהה לדוגמה עם מיקום טוב לכל צינור.

למלא 95 שכותרתו שני צינורות צנטריפוגה מיליליטר עם מדגם אחד לכל צינור, עד כל צינור הוא כחצי מלא. הצינור ה-96 צריך לשמש כחילוץ ריק. מניחים את צינורות תת מדגם על קרח, ולתייג 96 סטרילי 200 צינורות PCR שטוח כובע מיקרוליטר על פי תוויות באר עבור צלחת 96 היטב, ולאחר מכן למקם את התווית 200 צינורות microliter לפי הסדר בארון מתלה 96 באר.

כדי להכין צלחת 96 באר לניסוי, להסיר את הכיסוי מהצלחת ולה מניחים את המכסה לתוך שקית ניילון סטרילית. לאטום את השקית כדי למנוע זיהום ולכסות את הצלחת עם חתיכה לחתוך מראש של סרט איטום פירסינג. לאחר מכן השתמש רולר גומי כדי לדבוק בחוזקה את החותם לצלחת ולאחסן את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס.

כדי להעביר את דגימות המשנה לצלחת, מקם 24 מתוך שני צינורות תת הדגימה המיליליטר לתוך גוש קרח לאחסון קר, ולהשתמש שם המדגם ואת גיליון מיקום היטב כדי לבחור את המתאים המתאים 200 צינורות שטוחים שטוחים microliter. Vortex תת דגימות אחד בכל פעם, במשך חמש שניות לכל מדגם כדי להבטיח הומוגניזציה לטעון כ 200 microliters של כל מדגם לתוך צינור PCR המתאים המתאים. כאשר כל 24 הדגימות נטענו, השתמש במגבון נייר ספוג מולבן כדי לנקות את החלק החיצוני של צינור PCR אחד, ולהפוך ולהקש על הצינור על הספסל כדי להעביר את המדגם לראש הצינור.

באמצעות הלהבה מעקרת ומספריים מולבן לקצץ את החלק התחתון של צינור PCR כדי ליצור פתח עבור המדגם, ולהעביר את הצינור מעל הצלחת עם הקצה לחתוך פונה עד הבאר המתאימה הושגה. להטות את הצלחת מעט, כדי להקל על ניקוב של סרט איטום פירסינג לחתוך מראש, ועם הצינור ישירות מעל הבאר הנכונה, במהירות אך בזהירות להפוך את הצלחת, כך קצה לחתוך מתאים לתוך הבאר. השתמש בכלי מעוקר כדי להקיש על החלק העליון של הצינור עד שכל האדמה נפלה מהצינור לתוך באר.

ולהשאיר את הצינור באר עם העופרת סגורה. כאשר כל הדגימות נטענו באותו אופן, להסיר צינור PCR שטוח אחד 200 microliter ולהוסיף 750 microliters של פתרון חרוזים לדגימה היטב. מניחים את צינור PCR 200 microliter שטוח כתרים בחזרה לתוך באר דוחף אותו כל הדרך למטה לתוך באר.

ולהשתמש שארפי כדי לסמן את החלק העליון של הצינור כדי לציין את באר נטען. כאשר כל הבארות כבר טעון עם חרוזים להחזיר את 24 צינורות מדגם ל 20 מעלות צלזיוס אחסון ולהוסיף 24 צינורות תת מדגם חדש לגוש הקרח, כדי לאפשר את הסט הבא של דגימות להיות טעון לתוך צלחת 96 היטב כפי שהודגם רק. כאשר כל 95 בארות כבר טעון עם מדגם פתרון חרוזים, להוסיף פתרון חרוזים רק לבא 96.

הסר את כל הצינורות, מעביר אותם מעל בארות מכוסות בלבד ומסיר בזהירות את הסרט הניתן לנקב מהצלחת. לאחר מכן מעבירים בזהירות את כיסוי הצלחת משקית הניילון לצלחת ומ מניחים את הצלחת על 20 מעלות צלזיוס עד החילוץ המתוכנן. השוואה של שיטות טעינת לוח מראה כי השיטה המודגמת גורמת לריכוז הדנ"א הנמוך ביותר בתוך הבאר הריקה.

בשיטה זו, ריכוז ה-DNA היה נמוך משמעותית אז בעת שימוש בשיטה המוצעת על ידי McPherson ואח '. למרות שריכוז הדנ"א בשיטה זו לא היה שונה סטטיסטית משיטת ברירת המחדל של qiagen. כל שלוש השיטות, לייצר ריכוזי DNA ממוצעים תחת שני ננוגרם למיקרוליטר.

למרות שרק שיטה חדשה זו מייצרת בארות ללא ריכוז דנ"א מדיד. כדי למזער את הפוטנציאל לשפוך, לשמור על צינור 200 microliter זקוף בעת הזזת אותו מעל הצלחת, להטות את הצלחת ולהכניס את הצינור לתוך הטוב הנכון.