Name: שימוש בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס כדי לחקור את ההרכבה של מקטעים ראשוניים של אקסון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: חקור הרכבה של מקטעים ראשוניים של אקסון בנוירונים היפוקמפליים באמצעות תרבית תאים וטרנספקציה. שיטה זו מאפשרת הערכה כמותית של מבנה AIS ותפקוד נוירונלי במחקרי פיתוח עצבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר גארי בנקר על ההצעה לפרוטוקול התרבות העצבית. עבודה זו נתמכת על ידי המכון הרפואי הווארד יוז, מענק מ- NIH, וג'ורג ' בארת גלר העניק פרופסור (V.B.).

הערה: שיטת תרבות זו של נוירונים בהיפוקמפוס מעכברי ANK3-E22/23f/f שלאחר הלידה מותאמת ממערכת התרבות המשותפת של גארי בנקר/ נוירון. לכן, זה קריטי לבצע את כל השלבים לאחר ניתוח במכסה המנוע נקי באמצעות כלים מעוקרים. פרוטוקול זה אורך עד חודש. זרימת העבודה מוצגת באיור 3. הפרוטוקול פועל בהתאם להנחיות בעלי החיים של אוניברסיטת דיוק.
1. הכנת כיסויים ומנות ציפוי עצביות
<ol><li>לפחות שבוע לפני יום התרבות, לטעון coverslips על מתלה coverslip ולהשרות אותו חומצה חנקתית (70% W / W) לילה (ניתן להאריך במשך ימים).</li>
	<li>לשטוף חומצה חנקתית מטפל coverslips עם מים מזוקקים על שייקר במהירות נמוכה בצנצנת זכוכית 2 פעמים, 1 שעה כל אחד.</li>
	<li>מכסה דגירה ב KOH רווי מומס 100% אתנול לילה. מוסיפים KOH לאתנול עד שהוא כבר לא מומס.</li>
	<li>חזור על שלב הכביסה עם מים מזוקקים. לשטוף coverslips עם 100% אתנול פעם אחת במשך 10 דקות.</li>
	<li>מעבירים כיסויים מהמתלה לזכוכית. מכסים את הכף בנייר אלומיניום. אופים כיסויים בתנור של 225 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לעקר את הכיסויים. (Coverslips יכול להיות מאוחסן ב כיס במשך שבועות).</li>
	<li>מניחים כיסויים בצלחת פטרי ולאחר מכן להחיל 3-4 נקודות שעווה על כריכה לשמש כפות רגליים. השתמש פיפטה פסטר לטבול לתוך שעווה מבושלת בבקבוק זכוכית. לאחר מכן גע במהירות ב- coverslip כדי ליצור נקודה. צלחת פטרי 60 מ"מ יכולה להכיל 4 כריכות. צלחת פטרי 10 מ"מ יכול להכיל ~ 10 coverslips.</li>
	<li>2 ימים לפני יום התרבות, מעיל coverslips (הצד עם נקודות שעווה) עם מסנן מעוקר 1 מ"ג / מ"ל פולי-L-ליצין ב 0.1 M חומצה בורית (pH 8.5) במשך מינימום של 6 שעות ולשטוף עם מים 2 פעמים, 1 שעה בכל פעם. כיסויים נשארים באותה צלחת פטרי.</li>
	<li>מוסיפים מדיום ציפוי (MEM בתוספת גלוקוז 0.6% (wt/vol) ו 10% (vol / vol) סרום סוס) לצלחות לאט מבלי להפריע coverslips. שים צלחות באינקובטור עד יום התרבות כדי לזרוע נוירונים.</li>
</ol>2. הכנת מנות מאכילות תאי גליה (שבועיים לפני יום התרבות)
<ol><li>לנתח את קליפת המוח ממוח עכברים בן יום אחד לאחר הלידה ולקלף את קרום המוח.</li>
	<li>קוצצים את רקמת קליפת המוח דק ככל האפשר עם מספריים נקיים בצלחת פטרי נקייה בספסל נקי.</li>
	<li>מעבירים את הרקמה הקצוצה ל-12 מ"ל של HBSS ומוסיפים 1.5 מ"ל של 2.5% טריפסין ו-1% (wt/vol) DNase. דגירה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, נדנדה כל 5 דקות. רקמה מתעכלת היטב הופכת לדביקה ויוצרת אשכול גדול. Triturate 10-15 פעמים עם פיפטה 10 מ"ל לשבור את הרקמה למטה ולקבל עיכול טוב יותר.</li>
	<li>Triturate הרקמה מתעכל היטב 10-15 פעמים עם פיפטה 5 מ"ל עד רוב הגושים נעלמים המדיום הופך מעונן. עוברים דרך מסננת תאים כדי להסיר נתחים שנותרו ומוסיפים 15 מ"ל של גליה בינונית (מדיום חיוני מינימלי (MEM) בתוספת גלוקוז (0.6% wt /vol), 10% (vol / vol) סרום סוס פניצילין-סטרפטומיצין (1x) כדי לעצור את העיכול.</li>
	<li>צנטריפוגה התאים ב 120 x g במשך 5 דקות לשאוף את supernatant. מוציאים מחדש את גלולת התא עם מדיום גליה טרי וזרעים במנות תרבות התא (כ -105 תאים / ס"מ2).</li>
	<li>החלף מדיום במדיום גליה טרי למחרת כדי להסיר תאים לא מחוברים.</li>
	<li>להאכיל את מנות גליה כל 3-4 ימים עם מדיום גליה טרי. סטירה הבקבוק 5-10 פעמים עם יד כדי לעקור תאים מחוברים באופן רופף לפני שינוי בינוני.</li>
	<li>לאחר 10 ימים של תרבות, תאי גליה צריכים להיות כמעט משולבים. נתק תאי גליה עם 0.25% טריפסין-EDTA וזרע כ 105 תאים בצלחת חדשה 60 מ"מ תרבית התא. תאים שנותרו יכולים להיות קפואים לשימוש עתידי.</li>
	<li>3 ימים לפני יום התרבות, לשנות את המדיום גליה למדיום תרבות עצבית (Neurobasal-A בינוני עם 1x GlutaMAX-I ו 1x B27 תוספת).</li>
</ol>3. נוירונים היפוקמפוס תרבות
הערה: כל השלבים מבוצעים בטמפרטורת החדר.
<ol><li>לנתח 6-8 היפוקמפי מן הגורים לאחר הלידה 1 יום אחד מ ANK3-E22/f עכברים עם מדיום HBSS בצלחת פטרי בחדר ממוזג. קוצצים את ההיפוקמפי במספריים מנותבים לחתיכות קטנות יותר. מעבירים את ההיפוקמפי מתבשיל הפטרי לצינור של 15 מ"ל.</li>
	<li>לשטוף היפוקמפי 2x עם 5 מ"ל של HBSS בצינור. השאירו את ההיפוקמפי ב 4.5 מ"ל של 1x HBSS לאחר הכביסה.</li>
	<li>יש להוסיף 0.5 מ"ל של 2.5% טריפסין ל-4.5 מ"ל של HBSS ולהדגיר באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. הפוך את הצינור כל 5 דקות. היפוקמפי מתעכל היטב צריך להיות דביק וליצור אשכול. במידת הצורך, להאריך את העיכול במשך 5 דקות נוספות.</li>
	<li>לשטוף היפוקמפי עם HBSS 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד. אל תשתמש בוואקום כדי להסיר את HBSS. קל מאוד להסיר את ההיפוקמפי.</li>
	<li>הוסף 2 מ"ל של HBSS לאחר לשטוף פיפט ההיפוקמפי למעלה ולמטה עם פיפטה פסטר 15 פעמים.</li>
	<li>טריטורים את הרקמה עם פיפטה פסטר מלוטש אש (קוטר של פתוח מצטמצם בחצי) 10 פעמים. אל תלך מעבר 10 פעמים גם אם יש עדיין גושים שנותרו. השתלטות יתר הורגת נוירונים.</li>
	<li>מניחים את הצינור במשך 5 דקות עד שכל הגושים נקבעים לתחתית. השתמש בעדינות טיפ פיפטה 1 מ"ל להעביר את supernatant המכיל את הנוירונים מנותקים מנות ציפוי (105 תאים / 60 מ"מ צלחת). מוסיפים אותו ישירות למדיום הציפוי המדגר מראש ומנערים את הצלחת בעדינות.</li>
	<li>חזור על שלב 3.6-3.7 עם הנתחים הנותרים עד שרוב הגושים נעלמו.</li>
	<li>2-4 שעות לאחר הזריעה, בדוק את מנות הציפוי במיקרוסקופ קל. רוב הנוירונים היו צריכים להיצמד לכיסוי. התאים המחוברים עגולים ובהירים. פליפ מכסה באמצעות מלקחיים קצה דק מנות מאכיל תא גליה עם מדיום תרבות עצבית מותנה מראש עם הצד נקודות שעווה פונה כלפי מטה.</li>
	<li>נוירונים יכולים לגדול במנות מאכיל תאי גליה עד חודש. להאכיל נוירונים כל 7 ימים עם 1 מ"ל של מדיום תרבות עצבית טרי.</li>
	<li>צעד אופציונלי: שבוע לאחר הזריעה, להוסיף ציטוסין arabinoside (1-β-D-arabinofuranosylcytosine) לריכוז הסופי של 5 מיקרומטר כדי לרסן את התפשטות גליה.</li>
</ol>4. שיבוש של AIS על ידי נוקאאוט של Ankyrin-G בשלב מוקדם יותר של התפתחות נוירון
<ol><li>ב 3 div (יום במבחנה),להפוך את coverslips עם נקודות שעווה בצד פונה עד צלחת מאכיל תא גליה עם מדיום תרבות עצבית מותנית.</li>
	<li>מערבבים 0.25 מיקרוגרם של דנ"א Cre-BFP עם 0.5 מיקרוגרם של DNA ankyrin-G-GFP (WT/מוטציה) בצינור 1.7 מ"ל כדי transfect 4 coverslips (~ 2:1 יחס של מספר עותק DNA). הוסף 100 μL של מדיום תרבות (למשל, Opti-MEM), לערבב ולנוח על ארון תקשורת. אם רק Cre-BFP הוא חצץ, עמוד השדרה פלסמיד GFP משמש כדי להתאים את הכמות הכוללת של ה-DNA.</li>
	<li>מערבבים 3 μL של מגיב transfection (למשל, Lipofectamine 2000) (~ 3 פעמים של DNA) עם 100 μL תרבות מדיום בצינור חדש 1.7 מ"ל. דגירה במשך 5 דקות ב RT.</li>
	<li>מערבבים 100 μL של פתרון DNA משלב 4.2 עם 100 μL של מגיב transfection משלב 4.3. לנוח במשך 5-10 דקות על מתלה.</li>
	<li>הוסף 50 μL של תערובת DNA משלב 4.4 ממש על גבי כל כיסוי על ידי החדרת הקצה ממש מתחת למדיום מבלי לגעת coverslips. פיפטה לאט כדי למנוע התפשטות של תערובת DNA.</li>
	<li>לאט לאט מחזירים את המנה לאינקובטור והדגירה למשך 30-45 דקות.</li>
	<li>הופכים את הכיסויים בחזרה לצלחת מאכילת גליה הביתית עם נקודות שעווה בצד הפונה כלפי מטה ומחזירים את הצלחת לאינקובטור.</li>
</ol>5. כימות של קטע ראשוני אקסון
<ol><li>לתקן נוירונים על 7-10 div וכתם עם סמן AIS בעקבות פרוטוקול immunocytochemistry סטנדרטי עבור החלבון של מעניין.</li>
	<li>לאסוף תמונות פלואורסצנטיות עם מיקרוסקופיה הרצויה.<ol>
<li>קח מקטעים מסדרת Z כדי לאסוף את האות של ה- AIS כולו. שמור את אותו עומק Z עבור כל התמונות.</li>
		<li>כוונן את עוצמת הלייזר כדי להגיע לטווח הדינמי הטוב ביותר בעוצמת הפיקסלים.</li>
		<li>ודא שכל תמונות AIS צולמו באותה הגדרת מיקרוסקופ.</li>
		<li>תמיד לבדוק את האות של Cre-BFP.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כימות AIS<ol>
<li>פתח תמונה עם פיג'י (https://fiji.sc).</li>
		<li>צור הקרנה מרבית של תמונות מסדרת Z.</li>
		<li>הפחת את אות הרקע הריק של כריכת הכיסוי מהתמונה.</li>
		<li>צייר קו לאורך ה- AIS. רוחב הקו אמור לכסות באופן מלא את ה- AIS. הפעל את הקו לפני שאות ה- AIS מופעל מעל הרקע והפסק לאחר שהוא יורד לרקע.</li>
		<li>מדוד את עוצמת הפיקסל הממוצעת לבדה את הקו וייצא לגיליון אלקטרוני (יש צורך ב- AISs ~ 10-15).</li>
		<li>צור את עקומת העוצמה הממוצעת של AIS באמצעות סקריפט MATLAB מותאם ברגר ואח'15.</li>
		<li>עבור כל ניסוי, כוללים Cre בלבד ו Cre בתוספת wildtype 480 kDa ankyrin-G נוירונים transfected כמו פקדים שליליים וחיוביים כדי לוודא כי הנוקאאוט של AIS הוא יעילות ההצלה היא מוצלחת.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Nelson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction%3A+Ankyrin-G+regulates+forebrain+connectivity+and+network+synchronization+via+interaction+with+GABARAP%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP.</a> Molecular Psychiatry. , (2019).</li>
<li>Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+ankyrin-G+stabilizes+somatodendritic+GABAergic+synapses+through+opposing+endocytosis+of+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).</li>
<li>Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axo-axonic+Innervation+of+Neocortical+Pyramidal+Neurons+by+GABAergic+Chandelier+Cells+Requires+AnkyrinG-Associated+L1CAM%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM.</a> Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).</li>
<li>Hofflin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+the+Axon+Initial+Segment+in+Interneurons+and+Pyramidal+Cells+of+Rodent+Visual+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332(2017).</li>
<li>Schluter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Plasticity+of+Synaptopodin+in+the+Axon+Initial+Segment+during+Visual+Cortex+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development.</a> Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).</li>
<li>Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+activity+regulates+Na%28%2B%29+channel+distribution+at+the+axon+initial+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment.</a> Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).</li>
<li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+relocation+of+the+axon+initial+segment+fine-tunes+neuronal+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability.</a> Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).</li>
<li>Pan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+ankyrin-G-based+mechanism+retains+KCNQ+and+NaV+channels+at+electrically+active+domains+of+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon.</a> Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).</li>
<li>Cooper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Made+for+%22anchorin%22%3A+Kv7.2%2F7.3+%28KCNQ2%2FKCNQ3%29+channels+and+the+modulation+of+neuronal+excitability+in+vertebrate+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnkyrinG+is+required+for+clustering+of+voltage-gated+Na+channels+at+axon+initial+segments+and+for+normal+action+potential+firing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing.</a> The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).</li>
<li>Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnkyrinG.+A+new+ankyrin+gene+with+neural-specific+isoforms+localized+at+the+axonal+initial+segment+and+node+of+Ranvier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).</li>
<li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+ankyrin-G%3A+a+critical+innovation+in+vertebrate+evolution+of+fast+and+integrated+neuronal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).</li>
<li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+polarity+is+determined+by+a+multifunction+motif+mediating+lateral+membrane+retention+through+ankyrin-G+and+apical-lateral+transcytosis+through+clathrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
<li>Berger, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Myosin+II+Activity+Regulates+Assembly+and+Plasticity+of+the+Axon+Initial+Segment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment.</a> Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+mutation+of+giant+ankyrin-G+disrupts+a+core+mechanism+for+axon+initial+segment+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ההרכבה של AIS מאורגנת על ידי 480 kDa ankyrin-G. עם זאת, ankyrin-G יש איזופורמים קצרים יותר שיכולים למקד את AIS של נוירונים wildtype, אשר עלול להוביל לקושי בפרשנות של ניתוחים מבנה פונקציה של הרכבת AIS. כאן אנו מציגים שיטה באמצעות נוירונים מעכברי ANK3-E22/23-flox המאפשרת מחקר של הרכבה דה נובו של AIS. על ידי הצטלבת עם Cre-BFP ב 3 div, אנו לחסל את כל isoforms אנדוגני של ankyrin-G. אנחנו יכולים גם שיתוף transfect 480 kDa ankyrin-G כדי להציל את היווצרותו של AIS. זה מאפשר מחקר של היווצרות AIS במערכת נקייה. על ...

הקטע הראשוני של האקסון ממוקם באקסון הפרוקסימלי ברוב הנוירונים החולייתנים. מבחינה פונקציונלית, AIS הוא המקום שבו פוטנציאל הפעולה הם יזמו בשל צפיפות גבוהה של ערוצי נתרן מגודר מתח באזור זה. AIS של כמה נוירונים סינאפסות הם גם ממוקדים על ידי interneurons מעכבות באמצעות יצירת סינפסות GABAergic1,2,3. לכן, AIS הוא אתר קריטי כדי לשלב איתות התא לווסת את ההתרגשות של נוירונים. AIS הוא בדרך כלל 20-60 מיקרומטר אורך וממוקם בתוך 20 מיקרומטר של גוף התא. האורך והמיקום של AIS משתנה בנוירונים על פני אזורי המוח, כמו גם בשלבים התפתחותיים שונים של אותו נוירון4,5. ראיות מצטברות הראו כי הרכב ומיקום של AIS הם דינמיים בתגובה לשינוי של פעילות עצבית4,5,6,7.
480 kDa אנקירין-G הוא המארגן הראשי של AIS. 480 kDa ankyrin-G הוא חלבון מתאם הקשור לקרום שנקשר ישירות לערוצי נתרן מגודרים במתח, כמו גם לחלבוני AIS מרכזיים אחרים כולל בטא4-ספקטרין, KCNQ2/3 ערוצים לווסת פעילות ערוץ נתרן8,9, ו 186 kDa נוירופצין, L1CAM שמכוון סינפסות GABAergic ל AIS2,10. 480 kDa ankyrin-G מניות ankyrin קנונית תחומים שנמצאו קצר 190 kDa ankyrin-G isoform (ANK חוזר, תחום מחייב spectrin, תחום רגולטורי), אבל הם נבדלים על ידי אקסון ענק שנמצא רק בעלי חוליות ומתבטא במיוחד נוירונים (איור 1A)11,12. 480 kDa ankyrin-G נוירון ספציפי תחום (NSD) נדרש עבור היווצרות AIS12. 190 kDa ankyrin-G אינו מקדם הרכבה AIS או יעד AIS בנוירונים ankyrin-G-null12. עם זאת, 190 kDa ankyrin-G מרוכז ב- AIS המכיל 480 kDa אנקירין-G12. יכולת זו של 190 kDa ankyrin-G למקד AIS מורכב מראש של נוירונים wildtype כבר מקור לבלבול בספרות האטה את ההערכה של פונקציות מיוחדות קריטיות של 480 kDa ankyrin-G בהרכבה AIS. לכן, זה קריטי ללמוד הרכבה AIS בנוירונים ankyrin-G-null כי חסר AIS מורכב מראש.
כאן, אנו מציגים שיטה לחקר ההרכבה והמבנה של ה- AIS באמצעות נוירונים היפוקמפוסים מתורבתים מעכברי ANK3-E22/23-flox המבטלת את כל האיזופורמות של ankyrin-G13 (איור 1B). על ידי חציית נוירונים עם מבנה Cre-BFP לפני הרכבת AIS, יצרנו נוירונים נטולי אנקירין-G שחסרים לחלוטין AIS(איור 1B, איור 2). ההרכבה של AIS הוא הציל באופן מלא לאחר שיתוף transfection של 480 kDa ankyrin-G-GFP פלסמיד עם פלסמיד Cre-BFP. שיטה זו מספקת דרך ללמוד את הרכבת AIS בסביבת AIS שאינה מורכבת מראש. כמו כן, שינינו את מערכת התרבות המשותפת גליה-נוירון מגארי בנקר מבלי להשתמש באנטיביוטיקה, שתוכננה בעבר עבור נוירונים של יום עוברי 18, ליישום לנוירונים של עכבר לאחר הלידה והתאמנו שיטת כמויות AIS למדידות AIS ממוצעות מתאי עצב מרובים כדי לנרמל את הווריאציה של AIS14,15.

<table><tbody><tr><td>10xHBSS</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>18 מ"מ כיסוי זכוכית (1.5D)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-545-84-1D</td><td></td></tr><tr><td>190kDa אנקירין-G-GFP</td><td>Addgene</td><td>#31059</td><td></td></tr><tr><td>2.5% טריפסין ללא פנול אדום</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>480kDa מעבדת אנקירין-G-GFP</td><td>תוצרת</td><td>לספק על פי בקשה</td><td></td></tr><tr><td>ANK3-E22/23f/f עכברי</td><td>JAX</td><td>מס' מלאי: 029797</td><td>B6.129-ANK3TM2.1Bnt/J;</td></tr><tr><td>תוסף תזונה ללא סרום B27</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים עם רשת 70 מ"מ</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי קרמי מתלה להכתמת החלקה</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Cre-BFP</td><td>Addgene</td><td>#128174</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>תרמו פישר</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>תוסף GlutaMAX-I תרמו</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A1286001</td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000</td><td>תרמו פישר 11668030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM עם ארל' מלחים ו-L-גלוטמין</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>11095-080</td><td></td></tr><tr><td>נוירו-בזאלי בינוני</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>חומצה חנקתית 70%</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>225711</td><td></td></tr><tr><td>אופטי-MEM I סרום מופחת בינוני</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>תרמו פישר 15140122</td><td></td><td></td>מדעי</tr><tr><td>פולי-L-ליזין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>26124-78-7</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס כדי לחקור את ההרכבה של מקטעים ראשוניים של אקסון

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

מקטעים ראשוניים של אקסון עצבי (AIS) הם אתרים של ייזום פוטנציאל פעולה ונחקרו בהרחבה עבור המבנה המולקולרי שלהם, הרכבה פלסטיות תלוית פעילות. ענק ankyrin-G, המארגן הראשי של AIS, ישירות מקשר עם מתח פורש ממברנה מגודר נתרן (VSVG) וערוצי אשלגן (KCNQ2/3), כמו גם 186 kDa נוירופסין, מולקולת הידבקות בתא L1CAM. ענק ankyrin-G גם נקשר ומגייס מולקולות AIS ציטופלזמי כולל בטא-4-spectrin, ואת החלבונים מחייב microtubule, EB1/EB3 ו Ndel1. Ankyrin-G ענק מספיק כדי להציל היווצרות AIS בנוירונים לקויים ankyrin-G. Ankyrin-G כולל גם איזופורם קטן יותר של 190 kDa הממוקם בקוצים דנדריטיים במקום AIS, אשר אינו מסוגל למקד את AIS או להציל את AIS בנוירונים ankyrin-G לקוי. כאן, תיארנו פרוטוקול באמצעות נוירונים היפוקמפוס מתורבתים מעכברי ANK3-E22/23-flox, אשר, כאשר מודבק עם Cre-BFP להפגין אובדן של כל איזופורם של ankyrin-G ולפגוע בהיווצרות של AIS. בשילוב מערכת תרבות משותפת של בנקר גליה/נוירון שונה, פיתחנו שיטה להחדיר נוירונים ריקים ankyrin-G עם 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, וזה מספיק כדי להציל את היווצרות של AIS. בנוסף, אנו משתמשים בשיטת כימות, שפותחה על ידי סלצר ועמיתיו כדי להתמודד עם שונות במרחק AIS מגופי התאים העצביים המתרחשת בתרבויות נוירונים בהיפוקמפוס. פרוטוקול זה מאפשר מחקרים כמותיים של הרכבת דה נובו והתנהגות דינמית של AIS.

סט שלם של ניסוי צריך לכלול Cre-BFP רק transfection כשליטה שלילית, Cre-BFP בתוספת 480 kDa ankyrin-G שיתוף transfection כמו שליטה חיובית ומצב שאינו transfected כמו בקרת טכניקה. בשליטה של Cre-BFP בלבד, נוירונים מוחצנים חסרים הצטברות של סמני AIS, כולל ankyrin-G (ankG), בטא4-ספקטרין (β4), נוירופסין (Nf) וערוצי נתרן מגודר מתח (VSVG) (איור 4A)16. לעומת זאת, Cre ו-480 kDa ankyrin-G התאספו במלואם על ידי AIS שהתגלה על ידי ההווה של סמני AIS (איור 4B).</stron...

כאן, תיארנו פרוטוקול כדי לחקור כמותית את ההרכבה והמבנה של קטעים ראשוניים אקסון (AIS) של נוירונים היפוקמפוס חסר AIS מורכב מראש בשל היעדר ankyrin-G ענק.

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

פרוטוקול זה משמש כדי לחקור כמותית את ההרכבה והמבנה של קטעים ראשוניים אקסון של נוירונים היפוקמפוס חסר AIS מורכב מראש בשל היעדר ankyrin-G ענק. כדי להתחיל, לנתח שישה עד שמונה היפוקמפי לאחר הלידה, גורים בני יום אחד עם מדיום HBSS בצלחת פטרי. קוצצים את ההיפוקמפי במספריים מנותבים לחתיכות קטנות יותר, ומעבירים אותם מהצלחת לצינור של 15 מיליליטר.לשטוף את ההיפוקמפי פעמיים עם חמישה מיליליטר של HBSS, ולהשאיר אותם 4.5 מיליליטר של HBSS לאחר הכביסה. מוסיפים 0.5 מיליליטר של 2.5% טריפסין ל-4.5 מיליליטר של HBSS, ומדגרים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, הופכים את הצינור כל חמש דקות. היפוקמפי מתעכל היטב צריך להיות דביק וליצור אשכול.במידת הצורך, להאריך את העיכול במשך חמש דקות נוספות. לשטוף היפוקמפי עם HBSS שלוש פעמים במשך חמש דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה, מוסיפים שני מיליליטר של HBSS ופיפט ההיפוקמפי למעלה ולמטה עם פיפטה פסטר 15 פעמים.לתמחר את הרקמה עם פיפט פסטר מלוטש 10 פעמים, ולהניח את הצינור במשך חמש דקות עד שכל הגושים להגדיר לתחתית. חזור על הטריטורציה עם הנתחים הנותרים עד שרובם ייעלמו. לאחר מכן, השתמש טיפ פיפטה מיליליטר אחד בעדינות להעביר את supernatant המכיל את הנוירונים מנותקים מנות ציפוי.מוסיפים אותו ישירות למדיום הציפוי המדגר מראש ומנערים את הצלחת בעדינות. שעתיים עד ארבע שעות לאחר הזריעה, בדקו את מנות הציפוי במיקרוסקופ קל. רוב הנוירונים היו צריכים להיצמד לתעודת הכיסוי.בעזרת מלקחיים עדינים, הופכים את החלקות הכיסוי למנות מאכילות תאי הגלייה המכילות מדיום תרבות עצבית מותנה מראש כאשר צד נקודות השעווה פונה כלפי מטה. נוירונים יכולים לגדול במנות מאכיל תאי גליה עד חודש. להאכיל נוירונים כל שבעה ימים עם מיליליטר אחד של מדיום תרבות עצבית טרי.ביום השלישי במבחנה, להפוך את הכיסוי מחליק עם צד נקודה שעווה פונה כלפי מעלה לתוך צלחת הזנת תאים גליה עם מדיום תרבות עצבית מותנית. יש לערבב 0.25 מיקרוגרם של דנ"א CRE BFP עם 0.5 מיקרוגרם של דנ"א של Ankyrin-GFP בצינור של 1.7 מיליליטר כדי להחדיר ארבע תלושי כיסוי. הוסף 100 מיקרוליטר אופטימלי.ואז לערבב את הצינור ונחו על מתלה. אם רק CRE BFP מודבק, עמוד השדרה הפלסמי של GFP משמש להתאמת הכמות הכוללת של ה- DNA. מערבבים שלושה מיקרוליטרים של מגיב transfection עם 100 microliters של אופטימלי בצינור חדש 1.7 מיליליטר ולהדגיר את הצינור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, מערבבים 100 מיקרוליטרים של הדנ"א המעורב הקודם עם 100 מיקרוליטרים של תערובת מגיבה טרנס-פקציטית, ומשאירים אותו למשך חמש עד 10 דקות על מתלה. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של תערובת הדנ"א מעל כל תלוש כיסוי על ידי החדרת הקצה ממש מתחת למדיום מבלי לגעת בכיסוי. פיפטה לאט כדי למנוע הפצת תערובת ה-DNA.לאט לאט מחזירים את המנה לאינקובטור ומשאירים אותה שם למשך 30 עד 45 דקות. הופכים את המכסה בחזרה לצלחת מאכיל הגלישה הביתית כשצד נקודה שעווה פונה כלפי מטה ומחזירים את המנה לאינקובטור. לכימות AIS, פתח את תמונות סדרת Z בפיג'י וצור הקרנה מרבית של תמונות.לאחר חיסור אות הרקע הריק של החלקת הכיסוי מהתמונה, צייר קו לאורך ה- AIS וודא שרוחב הקו מכסה באופן מלא את ה- AIS. הפעל את הקו לפני שאות ה- AIS מופעל מעל הרקע והפסק לאחר שהוא יורד לרקע. מדוד את עוצמת הפיקסל הממוצע לאורך הקו וייצא אותו לגיליון אלקטרוני.לאחר מכן, הפעל סקריפט MATLAB כדי ליצור את הדמות הסופית. הניסוי צריך לכלול Cre-BFP רק transfection כמו שליטה שלילית, Cre-BFP בתוספת 480 קידוד ankyrin-G cotransfection כמו שליטה חיובית, ומצב שאינו transfected כמו בקרת טכניקה. בשליטה Cre-BFP רק, נוירונים transfected חסר הצטברות של סמני AIS, כולל ankyrin-G, בטא 4 spectrin, נוירופסין, מתח מגודר ערוצי נתרן.לעומת זאת, Cre ו 480 קילודאלטון ankyrin-G שיתוף transfected נוירונים יש מורכבים באופן מלא AIS, אשר מודגם על ידי נוכחות של סמני AIS. חשוב לאשר את איכות התרבות בהשוואה למנות שאינן מודבקות. נוירונים לא בריאים נוטים להראות מבנה AIS חריג, כמו AIS הופסק או חוץ רחמי.כדי להעריך כיצד מוטציה בהפרעה נוירו-התפתחותית אנושית ankyrin-G משפיעה על הרכבת AIS, עוצמת AIS הממוצעת הותוותה מהסומה לאקסון הדיסטלי. חלבונים מועשרים AIS בדרך כלל מראים עלייה מהירה של אות מן האקסון proximal וירידה איטית של אות אקסון דיסטלי. כאשר הוא מיושר עם ה- AIS שאינו מודבק, עקומת המוטנטים רחבה יותר ושיא העקומה נמוך יותר, דבר המצביע על שינוי מבנה של AIS.סוג הפרא ankyrin-G אסף AIS מיושר באופן הדוק עם אחד שאינו מודבק.

use-primary-cultured-hippocampal-neurons-to-study-assembly-axon

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

דיסקציה וצמיחה של תאים מאזור המוח הפרט מאפשר חקירה של פרמטרים פיזיולוגיים הסלולר. אנו מתארים שיטה culturing התא הראשוני שמייצר נוירון מועשר תרבויות בסביבה בסרום חופשי.

תרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס של חולדות P0 יילוד

פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הנדרשים כדי לנתח, transfect דרך electroporation ועכבר תרבות נוירונים בהיפוקמפוס ואת קליפת המוח. לטווח קצר תרבויות ניתן להשתמש ללימודי תולדה של האקסון והדרכה, ואילו לטווח ארוך תרבויות יכול לשמש מחקרים synaptogenesis ניתוח בעמוד השדרה הדנדריטים.

Nucleofection ותרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס עכבר עובריים קליפתיים

הסרטון מדגים שיטה לגידול תאי עצב מהיפוקמפי. בתחילה, ההיפוקמפוס עובר עיכול אנזימטי כדי לפרק את מטריצת הרקמה החוץ תאית. לאחר מכן, הרקמה המעוכלת משובשת מכנית כדי לבודד נוירונים בודדים. לבסוף, תאי עצב אלה מגודלים בתרבית על תאי הזנת גלייה.

טכניקה לתרבית תאי עצב בהיפוקמפוס עכבר

סרטון זה מדגים שיטה לביסוס תרבית משותפת עקיפה של נוירון-אסטרוציטים באמצעות גישה ממודרת. במערך זה, נוירונים ואסטרוציטים מופרדים מרחבית אך חולקים תווך מותנה. גורמים נוירוטרופיים המשוחררים על ידי אסטרוציטים מקדמים התמיינות נוירונים ויצירת קשרים סינפטיים, דבר המצביע על אינטראקציות נוירון-גליה.

טכניקה עקיפה של תרבית נוירון-אסטרוציטים לחקר אינטראקציות נוירון-גליה

אנו מתארים נהלים לתיוג וgenotyping עכברי יילוד ויצירת תרבויות עצביות עיקריות מהם. Genotyping הוא מהיר, יעיל ואמין, ומאפשר למיצוי גרעין חומצה אוטומטי. זה שימושי במיוחד עבור עכברי neonatally קטלניים והתרבויות שלהם שדורשות השלמה מוקדמת של genotyping.

המהיר Genotyping של בעלי חיים ואחרי הקמת תרבויות עיקריות של נוירונים במוח

תרביות בצפיפות נמוכה של נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס דורשות בדרך כלל שכבת הזנה גליה כדי לספק גורמים נוירוטרופיים ולשמור על אריכות ימים. אנו מתארים כאן שיטה פשוטה לתרבית נוירונים בצפיפות נמוכה במיוחד על כיסויי זכוכית בנוכחות שכבת הזנה עצבית בצפיפות גבוהה, המאפשרת חקירה של מנגנונים עצביים-אוטונומיים ספציפיים.

שיטה פשוטה עבור צפיפות Ultra-Low, לטווח ארוך ראשית בהיפוקמפוס Neuron תרבות

מאמר זה מתאר את הפרוטוקול עבור culturing נוירונים בהיפוקמפוס העיקריים בצפיפות נמוכה גדלו על coverslips הזכוכית הפוך מעל בשכבת גליה. שכבות הנוירון גליה מופרדות חרוזי פראפין. הנוירונים גדלו על ידי שיטה זו מתאימים הדמיה אופטית מבחנים תפקודיים ברזולוציה גבוהה.

בהיפוקמפוס ראשי בצפיפות נמוכה תרבות Neuron

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור הספונטני של נוירוספירות מועשר בתאי מחולל קדמון בצפיפות גבוהה מצופה נוירונים. במהלך אותו ניסוי, כאשר הנוירונים מצופים בצפיפות נמוכה יותר, הפרוטוקול גם גורם לתרבויות ממושכות של עצב החולדות הראשי.

הדור של נוירוספירות מ מעורב היפוקמאל ראשוני ונוירונים בקליפת המוח מבודדים מ E14-E16 ספראג העובר עכברוש

פרוטוקול זה מראה כיצד להשתמש במיקרוסקופ סופר-רזולוציה כדי ללמוד חלבון שיתוף מקומי בתרבויות עצביות עיקריות.

הדמיה סופר-רזולוציה ללמוד התאמה ית-מקומית של חלבונים וסמנים סינפטיים בנוירונים ראשוניים

מלאי קפוא מוכן לשימוש של נוירונים הוא כלי רב עוצמה להערכת תפקודים סינפטיים. כאן, אנו מציגים תרבית ראשונית קלה בצפיפות נמוכה ממלאי קפוא באמצעות צלחת של 96 בארות.

תרבית ראשונית קלה וניתנת לשחזור בצפיפות נמוכה באמצעות מלאי קפוא של נוירונים עובריים בהיפוקמפוס

חקור הרכבה של מקטעים ראשוניים של אקסון בנוירונים היפוקמפליים באמצעות תרבית תאים וטרנספקציה. שיטה זו מאפשרת הערכה כמותית של מבנה AIS ותפקוד נוירונלי במחקרי פיתוח עצבי.

שימוש בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס כדי לחקור את ההרכבה של מקטעים ראשוניים של אקסון

גלה סרטונים נוספים