Name: הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: למדו איך לזהות חלבוני תיקון DNA בתאי HeLa באמצעות אימונופלואורסציה עקיפה. השיטה מאפשרת לחקור אינטראקציות חלבוניות ולכמת קולוקליזציה בנזקי DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מקרן סן אנטוניו. מרכז הסרטן מינס נתמך על ידי מרכז הסרטן NCI תמיכה מענק הליבה P30 CA054174. ברצוננו להודות לסטיבן הולווי על עזרתו במיקור הריאגנטים, ועל מעבדת סונג על מתן מרחב וקיבולת מיקרוסקופיה.

1. תרבות תאי HeLa
<ol><li>כיסויי זכוכית עגולים לפני טיפול עם 1 M HCl ב 50 מעלות צלזיוס במשך 16-18 שעות. לשטוף עם ddH2O ולאחסן ב 100% ETOH.</li>
	<li>הכן את תרבות התאים בינונית: הוסף 10% (v/v) FBS למדיום DMEM.</li>
	<li>לגדול 4.0 x 104 תאים / גם בצלחת סטרילית 12-גם עם כיסוי זכוכית עגולה 18 מ"מ ב 37 ° C ו 5% CO2 באינקובטור לח. לגדל תאים 80% confluency (כ 24 שעות).</li>
</ol>2. טיפול בתא עם קרינה (IR)
<ol><li>כדי לגרום להיווצרות של הפסקות דו-גדיליות, לחשוף תאים 4 Gy ơ-eradiation (שליטה: אין הקרן, t = 0). בתא גמא -40, זה מתאים 4.54 דקות, ב 0.815 Gy לשעה.</li>
	<li>דגירה תאים ב 37 °C ו 5% CO2 באינקובטור לח עבור אורך הזמן המתאים (נקודות זמן שנבחרו כאן t = 1, 2, 4, 16 שעות).</li>
</ol>3. חילוץ גרעיני קיבעון תאים
<ol><li>הכן פתרונות מלאי: 0.2 M צינורות (pH 6.8), 5 M NaCl, 2 M סוכרוז, 1 M MgCl2, 0.1 M EGTA (pH 8.0).</li>
	<li>להכין מאגר חילוץ גרעיני (NEB): להתמוסס 10 mM צינורות (pH 6.8), 100 mM NaCl, 300 m m סוכרוז, 3 mM MgCl2,1 mM EGTA (pH 8.0) ו 0.5% (v/v) טריטון X-100 ב ddH2O לערבב עד מומס לחלוטין.</li>
	<li>הכן 4% (v/v) paraformaldehyde (PFA): להמיס 10 מ"ל של 16% פתרון מים PFA ב 30 mL PBS. מערבבים עד להמסה מוחלטת.</li>
	<li>בנקודת הזמן המתאימה (t=0, 1, 2, 4, 16 שעות), לשטוף תאים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS. הסר את PBS לחלוטין.</li>
	<li>להוסיף 200 μL של NEB לכל באר עבור חילוץ גרעין התא (ציקטופלסמה מושפלת, רק גרעין נשאר)(איור 2). דגירה במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר לחלוטין. הערה: אין לחרוג מ- 2 דקות.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61447/61447fig02.jpg"> איור 2: חילוץ גרעיני. תמונות מייצגות של תאים לפני (משמאל) ופוסט (מימין) חילוץ גרעיני. ציטופלסמה צריכה להיות מעוכלת אבל המבנה הגרעיני צריך להישאר ללא פגע לאחר החילוץ (זכות). (א) הגדלה של פי 20; סרגל קנה מידה = 20 μm ו -(B) הגדלה 40x; סרגל קנה מידה = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61447/61447fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<ol start="6"><li>לשטוף תאים עם 1 מ"ל של PBS. הסר את PBS לחלוטין. להוסיף PBS בזהירות, תאים הם שבריריים מאוד בשלב זה.</li>
	<li>להוסיף 200 μL של 4% (v/v) PFA לכל באר עבור קיבעון תאים. דגירה במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את PFA לחלוטין.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של PBS. הערה: ניתן לאחסן תאים ב- PBS ב- 4 °C.</li>
</ol>4. כתמי חיסון
<ol><li>הכן פתרון חסימה: המיס 5% BSA (w/v) ב- PBS והוסף 0.3% (v/v) Triton X-100. מערבבים עד להמסה מוחלטת.</li>
	<li>הכן מאגר דילול: המיס 1% BSA (w/v) ב- PBS והוסף 0.3% (v/v) Triton X-100. מערבבים עד להמסה מוחלטת.</li>
	<li>לחסימה, להוסיף 200 μL של חסימת פתרון לכל באר. דגירה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר או 16-18 שעות ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: אם ייווה שימוש בנוגדן עזים, הוסף סרום עזים 5% לפתרון חסימה.</li>
	<li>תדלל את הנוגדן הראשי במאגר דילול (1:500; ראה טבלה 2 לרשימת נוגדנים) ומערבולת עד לקבלת תערובת מעורבת היטב. הערה: אם משתמשים בינוגדן עזים, הוסף סרום עזים 1% למאגר דילול.</li>
	<li>בתיבת לחות/דגירה, דבקו בפיסת פרפילם. להוסיף 10 μL של נוגדן ראשי (בטיפה אחת). יישר קצה אחד של מכסה עם הטיפה ולהוריד לאט על parafilm, עבור הנוזל להתפשט לכל רחבי (להימנע בועות במידת האפשר). דגירה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>כיסויי רחצה שלוש פעמים בPBS במשך דקה אחת.</li>
	<li>לדלל נוגדן משני במאגר דילול (ריכוז סופי: 2 μg / מ"ל) ומערבולת עד מעורבב היטב.</li>
	<li>החל 10 μL של נוגדן משני כמתואר עבור הנוגדנים העיקריים. דגירה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. הערה: הגן מפני אור.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>נוגדן</td>
			<td>החברה</td>
			<td>הפניה</td>
			<td>מקור</td>
		</tr>
<tr>
<td>53BP1</td>
			<td>איתות תא</td>
			<td>4937</td>
			<td>ארנב</td>
		</tr>
<tr>
<td>נגד עכבר IgG H&amp;L (אלקסה פלור 647)</td>
			<td>אפרת בן-ן</td>
			<td>אפרת אלון</td>
			<td>חמור</td>
		</tr>
<tr>
<td>אנטי-פוספו-היסטון אייץ' 2-איי. X (Ser139), שיבוט JBW301</td>
			<td>מיליפור (מיליפור)</td>
			<td>05-636</td>
			<td>העכבר</td>
		</tr>
<tr>
<td>אנטי ארנב IgG H&amp;L (אלקסה פלור 488)</td>
			<td>אפרת בן-ן</td>
			<td>אפרת</td>
			<td>עז</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: נוגדנים בשימוש. רשימת נוגדנים המשמשים במחקר זה.
<ol start="9"><li>כיסויי רחצה שלוש פעמים בPBS במשך דקה אחת.</li>
	<li>לשטוף כיסויים עם H2O למשך דקה אחת.</li>
	<li>ד.נ.א נגדי עם DAPI: להחיל 10 μL של 300 nM DAPI (כמתואר עבור נוגדנים), דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן הר על מגלשת זכוכית עם גליקרול מבוסס מדיה הרכבה. לחלופין, הוסף טיפה אחת (10 μL) של מדיה מסחרית נגד גלישה המכילה DAPI על שקופית ולהחיל כיסוי. לחץ בעדינות על מכסה הכיסוי והסר סביבו עודף נוזלים בעזרת מגבת נייר.</li>
	<li>חותמים את הליפים עם לק שקוף ונותנים להם להתייבש במשך 20 דקות.</li>
	<li>אחסן שקופיות ב- 4 °C.</li>
</ol>5. רכישת תמונה
<ol><li>מניחים טיפה של שמן טבילה על עדשת האובייקט 60x. השתמש ב- DAPI כדי לאתר את הגרעין באמצעות חתיכת עין.<ol>
<li>לרכישת תמונות XYZ, פתח תוכנת רכישה ובחור פרמטרים: סוג סורק: Galvano; מצב סורק: הלוך ושוב; גודל תמונה: 512×512; מצב PMT: VBF; ממוצע PMT: מסגרת (4 פעמים); סריקה רצינית PMT: קו.</li>
		<li>בחר את הצבע ואת הגלאים: ערוץ (CH1), צבע (DAPI), גלאי (SD1) ערוץ (CH2), צבע (אלקסה פלור 488), גלאי (HSD3) ערוץ (CH3), צבע (אלקסה פלור 647), גלאי (HSD4)</li>
		<li>בחר ב- "Z".</li>
	</ol>
</li>
	<li>התאם את התמונה החיה. לחץ על לחצן Live בחלון Live.<ol>
<li>כוונן את המוקד והגדר את עוצמת הלייזר (%), רגישות (HV), רווח והיסט בחלון הכלי "PMT".<ol>
<li>כוונן את עוצמת הלייזר (%): לבהירות ולהלבנה. ככל שעוצמת הלייזר גבוהה יותר, כך האות חזק יותר, אבל הדגימה תפוטם.</li>
			<li>כוונן את הרגישות (HV): רמת רעש. ככל שה-HV גבוה יותר, כך האות חזק יותר, אבל התמונה תהיה רועשת אם גבוהה מדי. הערה: שמור תמיד על קבוע מתח.</li>
			<li>כוונן את ההיסט: רמת רקע.</li>
		</ol>
</li>
		<li>בחר התחלה/סיום (15 פרוסות) עבור ערימות Z.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תתחילו את הרכישה.<ol>
<li>בחר את התיקיה כדי לשמור תמונות. לחץ על לחצן התחל LSM כדי להתחיל לרכוש את התמונה. לחץ על לחצן סידרה הסתיימה כדי להשלים את רכישת התמונה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ניתוח נתונים
<ol><li>לניתוח תמונה, פתח את תוכנת הניתוח.<ol>
<li>הקש על חלון הכלי אצווה, בחר את התמונות כדי לנתח ולבחור תיקיית פלט.</li>
		<li>לחצו על חלון הכלי 'ניתוח' ובחרו 'הקרנה' (יציגו את הקרנת העוצמה המרבית מ-15 פרוסות).</li>
		<li>תחת הגדרת קלט/פלט, בחר את האצווה שנוצרה.</li>
		<li>הקש על תהליך כדי לעבד תמונות.</li>
		<li>יצא תמונות כקבצי .tiff</li>
	</ol>
</li>
	<li>לכמת את הפוקי הגרעיני, פתח את CellProfiler.<ol>
<li>פתח את צינור הכימות של 33BP1 ו- 53BP1 (ראה מידע משלים).</li>
		<li>גרף נתונים באמצעות תוכנת טבלה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לניתוח התאמה מחדש, פתח את CellProfiler.<ol>
<li>פתח את צינור Colocalization (ראה מידע משלים). קובץ גיליון אלקטרוני ייווצר וישמר במיקום המועדף. עם זאת, הגרפים עצמם לא יישמרו באופן אוטומטי. הוא הציע לקחת תמונה של החלונות כדי לשמור על תיעוד של התוצאות.</li>
		<li>גרף נתונים באמצעות תוכנת טבלה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+and+human+health%3A+the+roles+of+BRCA1%2C+BRCA2%2C+and+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), 016600(2015).</li>
<li>Jalan, M., Olsen, K. S., Powell, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Roles+of+RAD52+in+Genome+Maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Emerging Roles of RAD52 in Genome Maintenance.</a> Cancers (Basel). 11 (7), (2019).</li>
<li>Oh, J., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+Mre11+Complex+in+Preserving+Genome+Integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Role of the Mre11 Complex in Preserving Genome Integrity.</a> Genes (Basel). 9 (12), (2018).</li>
<li>Uziel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+the+MRN+complex+for+ATM+activation+by+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Requirement of the MRN complex for ATM activation by DNA damage.</a> The EMBO Journal. 22 (20), 5612-5621 (2003).</li>
<li>Lee, J. H., Paull, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATM+activation+by+DNA+double-strand+breaks+through+the+Mre11-Rad50-Nbs1+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ATM activation by DNA double-strand breaks through the Mre11-Rad50-Nbs1 complex.</a> Science. 308 (5721), 551-554 (2005).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> Journal of Biological Chemistry. 273, 5858-5868 (1998).</li>
<li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">γ-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Research. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li>
<li>Martin, O. A., Pilch, D. R., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H2AX+in+DNA+damage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Histone H2AX in DNA damage repair.</a> Cancer Biology & Therapy. 2 (3), 233-235 (2003).</li>
<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 146 (5), 905-916 (1999).</li>
<li>Stucki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDC1+directly+binds+phosphorylated+histone+H2AX+to+regulate+cellular+responses+to+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MDC1 directly binds phosphorylated histone H2AX to regulate cellular responses to DNA double-strand breaks.</a> Cell. 123 (7), 1213-1226 (2005).</li>
<li>Lou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDC1+maintains+genomic+stability+by+participating+in+the+amplification+of+ATM-dependent+DNA+damage+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">MDC1 maintains genomic stability by participating in the amplification of ATM-dependent DNA damage signals.</a> Molecular Cell. 21 (2), 187-200 (2006).</li>
<li>Chapman, J. R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-dependent+interaction+between+NBS1+and+MDC1+mediate+chromatin+retention+of+the+MRN+complex+at+sites+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Phospho-dependent interaction between NBS1 and MDC1 mediate chromatin retention of the MRN complex at sites of DNA damage.</a> EMBO Reports. 9 (8), 795-801 (2008).</li>
<li>Melander, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+SDT+repeats+in+the+MDC1+N+terminus+triggers+retention+of+NBS1+at+the+DNA+damage-modified+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of SDT repeats in the MDC1 N terminus triggers retention of NBS1 at the DNA damage-modified chromatin.</a> Journal of Cell Biology. 181 (2), 213-226 (2008).</li>
<li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+DNA+repair+throughout+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of DNA repair throughout the cell cycle.</a> Nature Review. Molecular Cell Biology. 9 (4), 297-308 (2008).</li>
<li>Chiruvella, K. K., Liang, Z., Wilson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+double-strand+breaks+by+end+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Repair of double-strand breaks by end joining.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (5), 012757(2013).</li>
<li>Mehta, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sources+of+DNA+double-strand+breaks+and+models+of+recombinational+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Sources of DNA double-strand breaks and models of recombinational DNA repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (9), 016428(2014).</li>
<li>Symington, L. S., Gautier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+break+end+resection+and+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Double-strand break end resection and repair pathway choice.</a> Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).</li>
<li>Huertas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+resection+in+eukaryotes%3A+deciding+how+to+fix+the+break%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA resection in eukaryotes: deciding how to fix the break.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 17 (1), 11-16 (2010).</li>
<li>Nimonkar, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLM-DNA2-RPA-MRN+and+EXO1-BLM-RPA-MRN+constitute+two+DNA+end+resection+machineries+for+human+DNA+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">BLM-DNA2-RPA-MRN and EXO1-BLM-RPA-MRN constitute two DNA end resection machineries for human DNA break repair.</a> Genes & Development. 25 (4), 350-362 (2011).</li>
<li>Garcia, V., Phelps, S. E. L., Gray, S., Neale, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+resection+of+DNA+double-strand+breaks+by+Mre11+and+Exo1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bidirectional resection of DNA double-strand breaks by Mre11 and Exo1.</a> Nature. 479 (7372), 241-244 (2011).</li>
<li>Sturzenegger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA2+cooperates+with+the+WRN+and+BLM+RecQ+helicases+to+mediate+long-range+DNA+end+resection+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA2 cooperates with the WRN and BLM RecQ helicases to mediate long-range DNA end resection in human cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 27314-27326 (2014).</li>
<li>Daley, J. M., Niu, H., Miller, A. S., Sung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+mechanism+of+DSB+end+resection+and+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Biochemical mechanism of DSB end resection and its regulation.</a> DNA Repair. 32, 66-74 (2015).</li>
<li>Sartori, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CtIP+promotes+DNA+end+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human CtIP promotes DNA end resection.</a> Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).</li>
<li>Chen, L., Nievera, C. J., Lee, A. Y. L., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-dependent+complex+formation+of+BRCA1-CtIP-MRN+is+important+for+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-dependent complex formation of BRCA1-CtIP-MRN is important for DNA double-strand break repair.</a> Journal of Biological Chemistry. 283, 7713-7720 (2008).</li>
<li>Yun, M. H., Hiom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CtIP-BRCA1+modulates+the+choice+of+DNA+double-strand+break+repair+pathway+throughout+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CtIP-BRCA1 modulates the choice of DNA double-strand break repair pathway throughout the cell cycle.</a> Nature. 459 (7245), 460-463 (2009).</li>
<li>Sung, P., Klein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+homologous+recombination%3A+mediators+and+helicases+take+on+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of homologous recombination: mediators and helicases take on regulatory functions.</a> Nature Review. Molecular Cell Biology. 7, 739-750 (2006).</li>
<li>San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+eukaryotic+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of eukaryotic homologous recombination.</a> Annual Review of Biochemistry. 77, 229-257 (2008).</li>
<li>Jasin, M., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+strand+breaks+by+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Repair of strand breaks by homologous recombination.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (11), 012740(2013).</li>
<li>Dynan, W. S., Yoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Ku+protein+and+DNA-dependent+protein+kinase+catalytic+subunit+with+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Interaction of Ku protein and DNA-dependent protein kinase catalytic subunit with nucleic acids.</a> Nucleic Acids Research. 26 (7), 1551-1559 (1998).</li>
<li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+double-strand+DNA+break+repair+by+the+nonhomologous+DNA+end-joining+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway.</a> Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).</li>
<li>Cejka, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+end+resection%3A+nucleases+team+up+with+the+right+partners+to+initiate+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA end resection: nucleases team up with the right partners to initiate homologous recombination.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 22931-22938 (2015).</li>
<li>Mirman, Z., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1%3A+a+DSB+escort%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">53BP1: a DSB escort.</a> Genes & Development. 34, 7-23 (2020).</li>
<li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+requirement+for+53BP1+in+the+biological+response+to+genomic+instability+induces+by+BRCA1+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A selective requirement for 53BP1 in the biological response to genomic instability induces by BRCA1 deficiency.</a> Molecular Cell. 35 (4), 534-541 (2009).</li>
<li>Zimmermann, M., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1%3A+Pro+choice+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">53BP1: Pro choice in DNA repair.</a> Trends in Cell Biology. 24 (2), 108-117 (2014).</li>
<li>Mavragani, I. V., Nikitaki, Z., Kalospyros, S. A., Georgakilas, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+Radiation+and+Complex+DNA+Damage%3A+From+Prediction+to+Detection+Challenges+and+Biological+Significance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Ionizing Radiation and Complex DNA Damage: From Prediction to Detection Challenges and Biological Significance.</a> Cancers (Basel). 11 (11), (2019).</li>
<li>Nikitaki, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+complex+DNA+damage+induction+and+repair+in+human+cellular+systems+after+exposure+to+ionizing+radiations+of+varying+linear+energy+transfer+%28LET%29%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">Measurement of complex DNA damage induction and repair in human cellular systems after exposure to ionizing radiations of varying linear energy transfer (LET).</a> Free Radical Research. 50, sup1 64-78 (2016).</li>
<li>Redon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H2A+variants+H2AX+and+H2AZ%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Histone H2A variants H2AX and H2AZ.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 12 (2), 162-169 (2002).</li>
<li>Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+the+histone+guardian+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">H2AX: the histone guardian of the genome.</a> DNA Repair. 3 (8-9), 959-967 (2004).</li>
<li>Paull, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+histone+H2AX+in+recruitment+of+repair+factors+to+nuclear+foci+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage.</a> Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).</li>
<li>Sy, S. M. H., Huen, M. S. Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PALB2+is+an+integral+component+of+the+BRCA+complex+required+for+homologous+recombination+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">PALB2 is an integral component of the BRCA complex required for homologous recombination repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7155-7160 (2009).</li>
<li>Buisson, R., Masson, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PALB2+self-interaction+controls+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">PALB2 self-interaction controls homologous recombination.</a> Nucleic Acids Research. 40 (20), 10312-10323 (2012).</li>
<li>Belotserkovskaya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PALB2+chromatin+recruitment+restores+homologous+recombination+in+BRCA1-deficient+cells+depleted+of+53BP1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">PALB2 chromatin recruitment restores homologous recombination in BRCA1-deficient cells depleted of 53BP1.</a> Nature Communications. 11 (1), 819(2020).</li>
<li>Betts, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNAs+CUPID1+and+CUPID2+mediate+breast+cancer+risk+at+11q13+by+modulating+the+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNAs CUPID1 and CUPID2 mediate breast cancer risk at 11q13 by modulating the response to DNA damage.</a> American Journal of Human Genetics. 101 (2), 255-266 (2017).</li>
<li>Dray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+enhancement+of+the+meiotic+DMC1+recombinase+by+RAD51+associated+protein+1+%28RAD51AP1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for enhancement of the meiotic DMC1 recombinase by RAD51 associated protein 1 (RAD51AP1).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (9), 3560-3565 (2011).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

ניתוח התזמון והיעילות של תיקון נזקי DNA על ידי מיקרוסקופיה הוכיח חיוני כדי להבין איך מכונות תיקון DNA מתפקדות, בתאים נורמליים בפתולוגיות אנושיות כגון סרטן.
הפיתוח של נוגדנים ספציפיים המאפשרים זיהוי של חלבונים פעילים בגרסה הזרחן שלהם (כגון ơH2AX, pRPA, pRAD50ואחרים 10,23,39,43)שיחק תפקיד מרכזי בהשגת הבנה טובה יותר של תזמון תיקון DNA של אירועים וסנכרון שלה עם מחזור התא...

תאים אנושיים נחשפים כל הזמן למגוון של סוכני DNA מזיקים ממקורות שונים. מקורות אקסוגניים מורכבים בעיקר מחשיפה לקרינה, כימיקלים (כולל חומרים כימותרפיים וכמה אנטיביוטיקה), ווירוסים, בעוד המקורות האנדורניים העיקריים כוללים שגיאות בשכפול DNA ומתח חמצוני. ההשפעות הישירות של חשיפה גנוטוקסית יכול לנוע מבסיס שונה לשבור DNA קטלני פוטנציאלית דו גדיל (DSB), בהתאם ללחץ ואת מינון החשיפה. בסופו של דבר, נזק DNA לא מתוקן או שלא תוקן כהלכה יכול להוביל להצטברות של מוטציות, סידורים מחדש גנומיים, חוסר יציבות הגנום ובסופו של דבר להוביל קרסינוגנזה1. תאים יונקים פיתחו מסלולים מורכבים כדי לזהות סוגים ספציפיים של נזק DNA2,,3 ולתקן אותם בזמן, מסונכרן עם התקדמות מחזור התא.
קרינה מיננת (IR) פוגעת בסליל ה-DNA הכפול ויוצרת הפסקות דו-גדיליות (DSBs), אחת הצורות המבזות ביותר של נזק לדנ"א. MRN (MRE11, RAD50, NBS1) פונקציות מורכבות כמו חיישן של ה-DNA מסתיים ומפעיל את החלבון קינאז ataxia telangiectasia מוטציה (ATM)4,,5. לאחר ההפעלה הראשונית של ATM על ידי קצוות DNA, ATM מפעיל מפל של אירועי DDR באתר ההפסקה, ייזום עם אירוע מפתח, phosphorylation של משתנה histone H2AX6. H2AX phosphorylation על שאריות S139 מפעיל אותו לתוך ơH2AX, משתרע על פני אזורים עד megabases סביב נגע ה-DNA6,7,,8,9. אירוע זה מגביר את הנגישות DNA, המוביל גיוס והצטברות של חלבוני תיקון DNA אחרים7. מכיוון 8H2AX הוא בשפע ובמיוחד מושרה סביב DSBs, זה יכול להיות חזותי בקלות באמצעות נוגדנים ספציפיים, והוא משמש בדרך כלל כסמן פונדקאית עבור DSBs בשדה תיקון ה-DNA. ברגע שההפסקה מאותתת, תאים מפעילים את נתיבי תיקון הדנ"א שלהם ומעבדים את נזקי הדנ"א. החלבון MDC1 (מגשר של חלבון מחסום נזק DNA 1) ישירות נקשר ơH2AX10, אינטראקציה עם ATM11 וגם עם NBS112,13. זה תורם להגדלת הריכוז של מתחם MRN ב DSB וייזום לולאת משוב חיובית כספומט. ơH2AX מוסר במהירות לאחר תיקון השבר, כתוצאה מכך, המאפשר ניטור של סיווג DSB. ואחריו מיקרוסקופיה, הירידה ב 0H2AX לאורך זמן מספק מדידה עקיפה של הפסקות שיורית ויעילות תיקון DNA.
תאים אאוקריוטיים יכולים לתקן DSBs על ידי מספר מסלולים, שני העיקריים להיות לא הומולוגי סוף הצטרפות (NHEJ) ו שילוב הומולוגי (HR)(איור 1). NHEJ למעשה רצועות DNA כפול גדיל מסתיים ללא שימוש הומולוגיה מורחבת ופועללאורך כל מחזור התא 14,15. משאבי אנוש הופכים לדומיננטיים בשלבי S ו-G2, ומודחקים באופן אחר, שכן היא דורשת כרומטיד אחות כתבנית הומולוגיתלתיקון 14,16. בחירת מסלול בין NHEJ ו HR לא רק תלוי הקרבה הפיזית של כרומט אחותו, אלא גם על הרחבת ה-DNAסוף חותך 17, אשר מעכב NHEJ.
תיקון DSB תלוי הומולוגיה יוזם על ידי השפלה נוקליאוליטית של 5 ' גדיל מן קצוות ההפסקה כדי ליצור 3 ' זנבות DNA גדיל יחיד (ssDNA), תהליך המכונה 5'-3' ריתוק. תסביך MRN יוזם את החיתוך קצה DNA וכתור נוסף מעובד בשילוב עם BLM / EXO1 (תסמונת בלום חלבון / exonuclease 1) או BLM / DNA2 (שכפול DNA ATP תלוי הליקאז / nuclease)18, 19,,20,21,22.19 ניתוח קצה DNA משופרת על ידי CtIP (חלבון אינטראקציה CtBP) באמצעות האינטראקציה הישירה שלה עם MRNמורכב 23 וגיוס של BRCA1 (סרטן השד סוג 1 חלבון רגישות)24,25. חלבון שכפול A (RPA) נקשר מיד ssDNA חשוף ולאחר מכן נעקר על ידי חלבון רקומבינאז RAD51 כדי ליצור חוט נוקליאופרוטאין כי מזרז חיפוש הומולוגיופלישה גדיל 26,27,28.
החניכה של ניתוח הוא צעד קריטי לבחירה במסלול תיקון. לאחר ההתקנה, מסתיים ה-DNA להיות מצעים עניים עבור איגוד על ידי Ku70/Ku80 הטרודימר (רכיב של מסלול NHEJ) ותאים מחויבים HR17,29,30. Ku70/Ku80 הטרודימר נקשר לקצוות DSB, גיוס DNA-PKcs ו p53 מחייב חלבון 1 (53BP1)29,,30. 53BP1 משמש כמחסום לניתוק ב-G1, ובכך חוסם את משאבי האנוש תוך קידום NHEJ31,32, אך הוא מוסר באופן תלוי BRCA1 בשלב S, וכתוצאה מכך מאפשר לניתוחפעולה 33,,34. לכן, 53BP1 ו BRCA1 לשחק תפקידים מנוגדים בתיקון DSB, עם 53BP1 להיות מנחה NHEJ בעוד פעולות BRCA1 המאפשר הפסקות לתקן באמצעות משאבי אנוש.
במעבדה, היווצרות DSB יכול להיות מושרה על ידי קרינה מיונן (IR). בעוד דוגמה זו מנצלת מינון גבוה של 4 Gy, 1 Gy ו 2 Gy גם ליצור כמות משמעותית של DSBs, מתאים לניתוח של היווצרות foci על ידי חלבונים בשפע. חשוב לציין כי הסוג והמינון של קרינה בשימוש יכול להוביל נגעים שונים ב-DNA ובתא: בעוד IR גורם DSBs, זה יכול גם לגרום הפסקות גדיל יחיד או שינוי בסיס(ראה 35,36 לעיון על העברת אנרגיה ליניארית קרינה (LET) וסוג של נזק DNA). כדי לקבוע את הקינטיקה של היווצרות foci (IRIF) הנגרמת על-ידי קרינה מיוננת ואת הסיווג שלהם, אשר מצביעים על תיקון של הנזק והיפוך של DDRמופעל 8,9,37,38,היווצרותfoci ניתן לפקח בנקודות זמן שונות לאחר קרינה מיוננת. תזמון ההפעלה והאישור של כל החלבונים העיקריים לנזקי DNAידוע 39, ורבים נחקרים כסמן חלופי של אירועי מפתח. לדוגמה, pRPA, אשר בעל זיקה גבוהה עבור ssDNA משמש כתחליף של ניתוק לשבור, חלבוני MRN (MRE11, RAD50, NBS1) ו exonucleases יכול לשמש כדי להעריך יעילות השבירה מדי. בעוד RAD51, BRCA1, BRCA2 (סרטן השד סוג 2 חלבון רגישים), ו PALB2 (שותף ו localizer של BRCA2) ניתן לפקח כדי להעריך את יעילות משאבי אנוש, הנוכחות של חלבוני Ku או 53BP1, משמשים סמנים של NHEJ (איור 1).
כמו חלבונים של מכונות תיקון DNA לגייס אחד את השני לשבור ולהרכיב בסופר קומפלקסים, אינטראקציות DNA-חלבון וחלבון-חלבון ניתן להסיק על ידי ביצוע מקומיות הפרט שלהם לאורך זמן וניתוח התאמה חברתית של חלבונים, כפי שניתן לראות על ידי אותותחופפים בתא 40,41,42. בקווי תאים, המבוא של מוטציות נקודתיות או מחיקה בגנים ספציפיים לתיקון DNA או באמצעות עריכת הגנום, או על ידי דיכוי יתר של מוטציות מבוססות פלסמיד, מאפשר חקירה של שאריות ספציפיות ותפקידם האפשרי בהכרה בנזקי DNA (למשל, התאמה משותפת עם ΩH2AX) או הרכבה מורכבת (התאמה משותפת עם אחר, או מספר, חלבונים), כמו גם השפעתם על תיקון DNA. כאן, אנו משתמשים בחיסונים עקיף כדרך לחקור את היווצרות ורזולוציה של DSBs על ידי ביצוע 8H2AX foci לאורך זמן. אנו מציגים גם דוגמה אחת של היווצרות foci וניתוח התאמה למיקום אחר-תום-מקומי על-ידי שחקן מרכזי בתיקון DSB: p53 Binding Protein 1 (53BP1)32. כפי שהוזכר קודם לכן, 53BP1 נחשב מרכזי לבחירה מסלול תיקון DNA. לאחר הצטברות 53BP1 והתמצאות התקצוב ההפוך שלה עם ơH2AX מספק מידע יקר על שלב מחזור התא, הצטברות נזק DNA, מסלול המשמש לתיקון DSBs. המטרה של אימונוקולציה עקיפה היא להעריך את היעילות של תיקון נזק DNA בקווי תאים, בעקבות IR כמו במחקר זה, או לאחר חשיפה ללחצים שונים בתא, מן הצלבת DNA לחסימה של שקע שכפול (רשימה של סוכנים מזיקים DNA מסופק בטבלה 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61447/61447fig1v2.jpg"> איור 1: נתיבי תיקון של שוברי גדילים כפולים של דנ"א (DSB). תיקון DSB כולל שני מסלולים עיקריים: שילוב מחדש הומולוגי (HR, שמאל) והצטרפות לסוף לא הומולוגית (NHEJ, נכון). לאחר ההפסקה, חלבונים מופעלים כדי לסמן את ההפסקה (ơH2AX), להשתתף כריתה סוף (MRN), לכסות את ssDNA החתוכים (pRPA), לקדם שילוב מחדש (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) או להגביל את כריתת ולקדם NHEJ (53BP1). חלבונים אחרים להשתתף בתיקון נזק, אבל חלבונים המפורטים באופן שגרתי מלווה אימונו-לודיזם עקיף. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61447/61447fig1v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>סוכן מזיק DNA</td>
			<td>מנגנון פעולה</td>
			<td>מינון מומלץ</td>
		</tr>
<tr>
<td>ơ-קרני רנטגן/ קרני רנטגן</td>
			<td>קרינה היווצרות של הפסקות דו-גדיליות עם השפעות תאיות בלתי מבוקרות</td>
			<td>1-4 ג'י</td>
		</tr>
<tr>
<td>
36 00:00: יונים</td>
			<td>קרינה היווצרות של הפסקות דו-גדיליות</td>
			<td>270 קילוו/μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>α-חלקיקים</td>
			<td>קרינה היווצרות של הפסקות דו-גדיליות</td>
			<td>116 keV/μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>בלומיצין (Bleomycin)</td>
			<td>מעכב סינתזת דנ"א</td>
			<td>0.4-2 μg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>(קמפטוסין, שוויץ)</td>
			<td>מעכב של טופואיסומראז אני</td>
			<td>10-200 00 00 00 00:00:00,00</td>
		</tr>
<tr>
<td>צ'יספלטין (1999)</td>
			<td>סוכן אלקילטינג (גורם קישורים תוך סטריים והצלבה)</td>
			<td>0.25-2 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>דוקסורביצין (11</td>
			<td>סוכן התבות מעכב של טופואיסומראז II</td>
			<td>10-200 00 00 00 00:00:00,00</td>
		</tr>
<tr>
<td>אטופוסייד (אטופוסייד)</td>
			<td>מעכב של טופואיסומראז II</td>
			<td>10 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>הידרוקסיורה (הידרוקסיורה)</td>
			<td>מעכב סינתזת דנ"א (על ידי רדוקטסה ריבונוקלאוטיד)</td>
			<td>10-200 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>מתיל מתנסולפונט</td>
			<td>סוכן אלקילטינג</td>
			<td>0.25-2 מ"מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיטומיצין C</td>
			<td>סוכן אלקילטינג</td>
			<td>0.25-2 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>אור אולטרה סגול (UV)</td>
			<td>היווצרות דימי דימידין (יצירת עיוות של שרשרת ה-DNA)</td>
			<td>50-100 מ"ג/ס"מ2
</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 1: סוכנים גנוטוקסיים. דוגמאות של סוכני DNA מזיקים, מנגנון הפעולה שלהם ואת הנזק המושרה בהתבסס על ריכוז עבודה המוצע.

<table><tbody><tr><td>תמיסה מימית של 16% (v/v) paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>איכות המיקרוסקופיה של ה-PFA מבטיחה את התמונות הטובות ביותר. אם משתמשים ב"PFA תוצרת בית", יש לסנן לפני השימוש.</td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A3059</td><td>שבר הלם חום מומלץ, כדי למנוע משקעים/רקע.</td></tr><tr><td>Coverglass #1, עגול 18 מ"מ (כיסויים)</td><td>Neuvitro</td><td>NC0308920</td> יש <td>לנקות ולעקר את הכיסויים לפני השימוש, עם HCl או אתנול.</td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה [(+) 4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז, (+) L-גלוטמין, (-) נתרן פירובט]</td><td>Gibco</td><td>11965118</td><td>התאם את מצע הגידול לצרכי קו התאים המשמש.</td></tr><tr><td>DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>PBS לתרבית רקמות.</td></tr><tr><td>אתילן גליקול-ביס(&בטא;-אתר אמינואתיל)-N,N,N&פריים;,N&פריים;-חומצה טטראצטית (EGTA)</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>E57060</td><td>מאגר מיצוי גרעיני.</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>104370028</td><td>ניתן להעריך את איכות ה-FBS על ידי בדיקת היווצרות מוקדי gH2AX. אם קיימים עקבות של אנדוטוקסין גנוטוקסי באצווה, gH2AX יהיה חיובי בהיעדר לחץ.</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד (MgCl2)</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>M24000</td><td>מאגר מיצוי גרעיני.</td></tr><tr><td>Piperazine-N,N&prime;-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>P40150</td><td>מאגר מיצוי גרעיני.</td></tr>ניתן <tr>להשתמש <td>במקום זאת ב-SlowFade Diamond Antifade Mountant עם DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>S36973</td><td>300 nM DAPI עם VECTASHIELD Antifade Mounting Medium.</td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>S23020</td><td>מאגר מיצוי גרעיני.</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>S24060</td><td>מאגר מיצוי גרעיני.</td></tr><tr><td>Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישרברנד</td><td>1255015</td><td>פוליסין ניתן להשתמש במקום.</td></tr><tr><td>צלחות באר מרובות שטופלו ב- TC, גודל 12 בארות</td><td>Costar</td><td>3513</td><td>זריעה על כיסויים נעשית בצלחת 12 בארות.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AmericanBio</td><td>AB02025</td><td>מאגר מיצוי גרעיני.</td></tr><tr>ניתן להשתמש <td>במקום זאת באנזים TrypLE Express (1X), ללא פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td>טריפסין-EDTA.</td></tr><tr>ניתן להשתמש <td>בטריפסין-EDTA (0.5%), ללא פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td>TrypLE במקום.</td></tr></tbody></table>

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון dna על ידי אימונופלואורסץ

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

תאים יונקים נחשפים כל הזמן כימיקלים, קרינה, ומוצרי משנה מטבוליים המתרחשים באופן טבעי, אשר יוצרים סוגים ספציפיים של עלבונות DNA. סוכנים גנוטוקסיים יכולים לגרום נזק לעמוד השדרה של הדנ"א, לשבור אותו, או לשנות את האופי הכימי של בסיסים בודדים. בעקבות עלבון DNA, מסלולי תגובה נזק DNA (DDR) מופעלים חלבונים המעורבים בתיקון מגויסים. שפע של גורמים מעורבים בחישת סוג הנזק והפעלת תגובת התיקון המתאימה. כישלון בהפעלה נכונה וגיוס גורמי DDR יכול להוביל לחוסר יציבות גנומית, אשר בבסיס פתולוגיות אנושיות רבות כולל סרטן. מחקרים של חלבוני DDR יכולים לספק תובנות לתגובה לתרופות גנוטוקסיות ומנגנונים תאיים של עמידות לתרופות.
ישנן שתי דרכים עיקריות לדמיין חלבונים בvivio: תצפית ישירה, על ידי תיוג החלבון של עניין עם חלבון פלורסנט ואחריו על ידי הדמיה חיה, או חיסון עקיף על דגימות קבועות. בעוד הדמיה של חלבונים מתויגים פלורסנט מאפשר ניטור מדויק לאורך זמן, תיוג ישיר N- או C-terminus יכול להפריע למיקום מחדש של חלבון או פונקציה. התבוננות בחלבונים בגרסה אנדוגנית שלא שונה שלהם עדיפה. כאשר חלבוני תיקון DNA מגויסים עלבון ה-DNA, הריכוז שלהם גדל באופן מקומי והם יוצרים קבוצות, או "foci", שניתן לדמיין על ידי אימונו-לודיזם עקיף באמצעות נוגדנים ספציפיים.
למרות זיהוי של חלבון foci אינו מספק הוכחה מוחלטת של אינטראקציה ישירה, התאמה חברתית של חלבונים בתאים מצביעה על כך שהם להתארגן מחדש לאתר של נזק יכול להודיע על רצף האירועים הנדרשים להיווצרות מורכבת. ניתוח זהיר של חפיפה מרחבית foci בתאים המביעים סוג בר או גרסאות מוטנט של חלבון יכול לספק רמזים יקרים על תחומים פונקציונליים חשובים עבור פונקציית תיקון DNA. לבסוף, התאמה ישירה של חלבונים מצביעה על אינטראקציות ישירות אפשריות שניתן לאמת על ידי שיתוף ערך חיסוני בתאים, או משיכה ישירה באמצעות חלבונים מטוהרים.

ביום 2, או 24 שעות לאחר תאי זריעה על כיסויים, תאים עברו חלוקה אחת והם 80% confluent. דפיקות ספציפיות או מוטציות בחלבונים תיקון DNA יכול להגדיל את זמן ההכפלה, או לרגיש תאים לטיפול genotoxic, צפיפות זריעה, כמו גם מינונים טיפול צריך להיות מותאם בהתאם. כדי לקבוע את תנאי העבודה הטובים ביותר, ניתן לקבוע את התזמון של תגובת נזקי ה-DNA על ידי ההתנפחות המערבית של ωH2AX לאורך זמן, ורגישות להקרה ניתן לזהות על ידי מושבה ויוצרים assay.
תאים לא מטופלים עם תערוכת הקדמה מעט, אם בכלל, ơH2AX foci<strong class="x...

בעקבות נזק DNA, תאים אנושיים להפעיל מסלולי תיקון חיוניים כדי לשחזר את שלמות הגנום שלהם. כאן, אנו מתארים את השיטה של חיסון עקיף כאמצעי לזיהוי חלבוני תיקון DNA, לנתח את הגיוס המרחבי והזמני שלהם, ולעזור לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון באתרים של נזק DNA.

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

שפעת חיסונית עקיפה מאפשרת לזהות חלבונים לתיקון דנ"א, תמונות של גיוס מרחבי וזמן והיא מסייעת לחקור אינטראקציות פרוטאין-פרוטאין באתר של נזק לדנ"א. בעקבות נזק לדנ"א, חלבונים לתיקון דנ"א מגויסים לעלבון הדנ"א בזמן שהריכוז שלהם עולה באופן מקומי, והם יוצרים קבוצות הנקראות מוקדים שניתן לדמיין על ידי כשל חיסוני עקיף על דגימות קבועות. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לזהות מוקדי חלבון, כמו גם לכמת קולוקליזציה של ההווה בתאים.זה יכול לעזור להסביר את רצף האירועים הנדרשים להיווצרות מורכבת ולתיקון DNA. אינטראקציות חלבון פרוטאין מסוימות יכולות להיות כרוכות בניסויים כאלה. הדגמת ההליך תהיה ברברה דה לה פנה, תמונה פוסטדוק מוכשר מאוד מהמעבדה שלי בגין על ידי גידול 40, 000 תאי HeLa בכל גם מעל 12 צלחת גם עם כיסוי זכוכית עגול 18 מילימטר ל 80% confluency.לאחר חשיפת התאים לארבעה הקרנה גמא אפורה, לשטוף אותם פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן להסיר את PBS לחלוטין ולהוסיף 200 microliters של NDB לכל באר. דגירה התאים במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להסיר את NDB.זכור כי זמן הדגירה יכול להשתנות בהתאם לקו התא, אבל בדרך כלל לא יעלה על שתי דקות. לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן להסיר את PBS לחלוטין ולהוסיף 200 microliters של 4%PFA לכל באר עבור קיבוע התא.דגירה התאים במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן להסיר את PFA ולהוסיף מיליליטר אחד של PBS לכל באר. הסר PBS לחלוטין ולאחר מכן להוסיף 200 microliters של פתרון חסימה לכל באר דגירה התאים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר או 16 עד 18 שעות בארבע מעלות צלזיוס.מדללים את מאגר הנוגדנים והדילול העיקרי ומערבבים אותו עד שהוא מעורבב היטב בתיבת לחות וכאן חתיכת פרפילם ומוסיפים 10 מיקרוליטרים של נוגדן ראשוני בירידה אחת. ליישר קצה אחד של כיסוי מן באר עם טיפה לאט להוריד אותו על parafilm להפיץ את הנוזל. הדגירה את הכיסויים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.לאחר הדגירה לשטוף את הכיסוי מחליק שלוש פעמים PBS במשך דקה אחת לכל לשטוף. מדללים את מאגר הנוגדנים והדילול המשני ואת המערבולת עד לערבב היטב להחיל 10 microliters של נוגדן משני על כל coverslip כפי שתואר קודם לכן דגירה זה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. לשטוף את הכיסוי מחליק שלוש פעמים עם PBS ופעם אחת עם מים במשך דקה אחת לכל לשטוף.לאחר מכן הרם אותם על מגלשות זכוכית עם מדיית הרכבה מבוססת גליצרול המכילה מחליק כיסוי חותם DAPI עם לק שקוף ולתת להם להתייבש במשך 20 דקות. מניחים טיפה של שמן טבילה על עדשת המטרה 60 x ולהשתמש DAPI כדי לאתר את הגרעינים דרך העין עבור רכישת תמונה XYZ, לפתוח את תוכנת הרכישה ולהגדיר את סוג הסורק כמו galvano סוג הסורק כמו הלוך ו 512 על ידי 512 גודל התמונה. בחלונית PMT מוגדר מצב לממוצע VBM למסגרת וסריקה רציפה לקו.לאחר מכן, גלאי הצבע והחום קבעו את ערוץ 1 ל-DAPI ו-SD 1, ערוץ 2 לאלכספלור 488 ו-HSD 3, וערוץ 3 לאלכספלור ב-647 ו-HSD ארבעה בוחרים ב-Z.To מתאימים את התמונה החיה, לוחצים על הכפתור החי בחלון החי ומתאימים את המוקד. לאחר מכן השתמשו בחלון הכלי PMT להגדרה של רגישות לעוצמת לייזר, רווח והיסט לערימות z, בחרו 'התחלה-סיום' ו'15 פרוסות'. בחר את התיקיה לשמירת תמונות ולחץ על לחצן התחל של LSM כדי להתחיל ברכישה.לאחר שתסיים, לחץ על לחצן סיום הסדרה כדי להשלים את רכישת התמונה. פתח את תוכנת הניתוח ולאחר מכן לחץ על חלון כלי האצווה ובחר את התמונות לניתוח. עבור אל חלון כלי הניתוח ובחר הקרנה, שתוצג הקרנה בעוצמה מרבית מ- 15 פרוסות.תחת הגדרת פלט הקלט, בחר את תיקיית האצווה והפלט שנוצרה. לחץ על תהליך לעיבוד תמונות וייצוא התמונות כקבצי TIFF. בצע כימות גרעיני עם cellprofiler על פי הוראות כתב היד.תאים שלא טופלו עם הקרינה התערוכה מעט מאוד גמא H2AX סימן אקספו. בהיעדר חלבונים חיוניים לתיקון DNA, הצטברות גמא H2AX ניתן לראות בהפסקות DNA. הצטברות של הפסקות לא מפוספרות יכולה להוביל תאים להיות טרום היפוטוני מסומן על ידי גרעיני גמא H2AX מוצק.לאחר הקרנה, גרעינים מציגים מספר רב של הפסקות תקועות כפולות שאליהן גאמא H2AX לוקליזציה היא מהירה מאוד. בעוד שמעטים אם נצפו מוקדים בהיעדר קרינה, מספר המוקדים כומת באחת שתיים וארבע ו-16 שעות לאחר קרינה ולבקרת קרינת ה-NOA. בהתאם לשאלה הביולוגית שהועלתה ולסוג הנתונים הנדרשים, אפשרויות התוויה שונות צריכות להיחשב קולוקליזציה ניתן לחקור על ידי נוגדנים ראשוניים multiplexing גדל במין בעלי חיים שונים באמצעות נוגדנים משניים, מסומנים עם פלואורופורים ברורים.סופרפוזיציה של ירוק ואדום, מעוררת נקודות חמות צהובות, שני חלבונים מעניינים נמצאים באותם פיקסלים. ניתוח כמותי של קולוקליזציה יכול להיות מושגת על ידי גישה מבוססת אובייקט או על ידי גישה סטטיסטית המבצעת ניתוחים מבוססי מקדם מתאם אינטנסיביות. שילוב של נוגדנים ראשוניים שגדלו במין בעלי חיים שונים, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה.ודאו שהנוגדנים תואמים ולא יפריעו זה לזה. אתה צריך להגדיר כראוי את הנוגדן המשני לשמש נגד כל אחד הנוגדנים העיקריים ולשקול חפיפה ספקטרלית מסוימת בעת בחירת פחות כוח לשימוש. קולוקליזציה או חלבונים מצביעים על אינטראקציות ישירות אפשריות.זה יכול להיות מאומת על ידי משקעים פרטניים בתאים, או על ידי ירידה ישירה באמצעות חלבונים מטוהרים במבחנה.

visualization-of-dna-repair-proteins-interaction-by-immunofluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה, אנו מתארים את שיטת האימונופלואורסנציה כדי לדמיין את הלוקליזציה של חלבוני תיקון הדנ"א γH2AX ו- 53BP1 באתרים של הפסקות DNA דו-גדילי בגרעין התא המוקרנ.

הדמיה מבוססת אימונופלואורסנציה של אינטראקציות חלבון תיקון DNA

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת המיקרוסקופ האימונופלואורסצנטי כדי לזהות חלבונים ספציפיים של תגובת נזק לדנ"א הממוקמים באתרים של שברים דו-גדיליים בדנ"א בתאים חד-גרעיניים אנושיים. החלבונים מזוהים על ידי נוגדנים ראשוניים ספציפיים, אשר בתורם נקשרים לנוגדנים משניים המתויגים בפלואורופור הפולטים פלואורסצנט במהלך הדמיה מיקרוסקופית, ומאפשרים הדמיה של החלבונים כמוקדים פלואורסצנטיים נפרדים בתוך גרעיני התא.

מיקרוסקופ אימונופלואורסנציה לניתוח שברים דו-גדיליים של DNA

הדמיה ספקטרוסקופית אלקטרונית יכולה לדמות ולהבחין בין חומצת גרעין לחלבון ברזולוציה ננומטרית. ניתן לשלב אותו עם מערכת miniSOG, המסוגלת לתייג באופן ספציפי חלבונים מתויגים בדגימות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. אנו מדגימים את השימוש בטכנולוגיות אלה באמצעות מוקדי תיקון שברים כפולים כדוגמה.

הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)

הנה, הוא הוכיח כיצד באתרו Proximity Ligation Assay (PLA) ניתן להשתמש כדי לזהות ולחזות אינטראקציות חלבונים ישיר חלבון בין כספומט p53 בתרביות תאים ההשעיה חשופים ללחץ genotoxic.

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

Microirradiation לייזר הוא כלי שימושי עבור מחקרים של תיקון ה-DNA בתאים חיים. בגישה מתודולוגי לשימוש של לייזרים UVA לזירוז נגעים דנ א שונים מוצג. לנו יש אופטימיזציה שיטה microirradiation המקומי המתחזק מחזור תא נורמלי; לפיכך, תאים לקרינה להמשיך לעבור מיטוזה.

מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון וקינטיקה ב DNA נגעים מתקדמות

כתב יד זה מספק פרוטוקול לניתוח של מעברי כפול-גדיל ה-DNA על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ושל 53BP1.

מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ו 53BP1 לניתוח את היווצרות והתיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA

לומד DNA נזק תיקון קינטיקה דורש מערכת לזירוז נגעים ב גרעיני תת אזורים מוגדרים. אנו מתארים שיטה ליצור מעברי גדילי זוגיות המותאמות לשפות אחרות באמצעות סריקה בלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד 405 ננומטר לייזר ולספק שגרות אוטומטיות כדי לכמת את הדינמיקה של הגורמים תיקון הפצעים כאלה.

חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה

תיקון של זוגיות-גדיל DNA מעברי הוא תהליך דינמי, הדורשים לא רק היווצרות תיקון מכלולי השברים, אבל גם הרזולוציה שלהן לאחר הנגע הוא ממוען. כאן, אנו משתמשים מיקרוסקופ immunofluorescence עבור ארעי לטווח ארוך כפול גדילי ומעברי ככלי לנתח מנגנון תחזוקה זה הגנום.

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

המושרה קרינה נזק DNA תגובה המופעלת על ידי מעורב נייטרון קרן המשמש בטיפול בורון נייטרון לכידת (BNCT) לא הוקמה במלואה. פרוטוקול זה מספק הליך צעד אחר צעד כדי לזהות וקדי המושרה קרינה (רי ' ף) של תיקון חלבונים על ידי immunofluorescence כתמים של סרטן המעי הגס האנושי התאים לאחר הקרנה עם הקורה מעורב נייטרונים.

Immunofluorescence הדמיה של נזק לדנ א ותיקון Foci בתאי סרטן המעי הגס האנושי

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות להערכת חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופלות. להלן שיטות ציפוי וצביעה מקיפות, כמו גם הליכי כימות מפורטים ואובייקטיביים.

הדמיה של חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופל באמצעות בדיקות אימונופלואורסנציה

הפרוטוקול הבא מציג זיהוי של מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא תוך שימוש בסנכרון מחזור התא ואחריו צביעה אימונופלואורסצנטית RPA2.

הדמיה של מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא

למדו איך לזהות חלבוני תיקון DNA בתאי HeLa באמצעות אימונופלואורסציה עקיפה. השיטה מאפשרת לחקור אינטראקציות חלבוניות ולכמת קולוקליזציה בנזקי DNA.

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

גלה סרטונים נוספים