Name: מיפוי המוח מדויק לבצע חוזרות ונשנות של הדמיה Vivo של נוירודינמיקה החיסונית בעכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: למד טכניקת השתלת חלון גולגולתי לדימוי מוח לאורך זמן בעכברים CX3CR1 GFP באמצעות מיקרוסקופיית Two-Photon. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר דינמיקה תאית ואינטראקציות במערכת העצבים המרכזית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי מעבדת Eyo על הדיון ברעיונות המוצגים בכתב יד זה. אנו מודים לד ר ג'סטין רוסטנבן ממעבדת קיפניס באוניברסיטת וירג במתנה של עכברים NG2Sred 33. עבודה זו נתמכת על ידי מימון מן המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ של המכון הלאומי לבריאות כדי U. B. E (K22 NS104392).

כל השלבים מוגדרים בהתאם להנחיות שנקבעו ואושרו על-ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת וירג.
1. הכנת העכבר על השתלת חלון הגולגולת
הערה: קווי העכבר הטרנסגניים שונים עם תגי פלורלי מתאימים להדמיה.
<ol><li>השתמש CX3CR1gfp/+ עכברים26 כדי להמחיש מיקרוגלייה ב vivo. בדרך כלל, נוער למבוגר צעיר 4 עד 10 שבועות עכברים בן שוקל 17-25 g משמשים. הערה: למרות שגישה זו אפילו מתאימה לעכברים שטרם הוקעו, הצורך להחזיר את העכברים לכלוב שלהם עם אימם לאכילה, עלול לסבך את ההחלמה אם האם לא לטפל הולם בגורים לאחר הניתוח. לכן, השימוש בעכברים שלאחר הגמילה מומלץ.</li>
	<li>השתמש בעכבר באמצעות isofלבנה (5% זורם חמצן עבור אינדוקציה 1 דקות) בחדר הרדמה. בדוק כי העכבר אינו מראה שום תנועה או התגובות מתעוות על הבוהן ו/או pinches הזנב. להוציא את העכבר מהחדר ובאוויר הפתוח לגלח ביסודיות את השיער על הראש בין האוזניים מפני רמת העין לחלק העליון של אזור הצוואר באמצעות קוצץ שיער. הערה: הריכוז של isofלאנה היה תלוי בגודל של חדר האינדוקציה. לכן, עבור תאים קטנים יותר, 3-4% isofלהלנה יכול לשמש ביעילות לגרום להרדמה בעוד התאים הגדולים ידרוש עד 5%.</li>
	<li>הזיזו את העכבר לתוך מיכל הניתוח סטריאוטקטיקה להרדמה (1.5-2% עבור תחזוקה לניתוח), ייצוב ראשו באמצעות ברים האוזן, ולשמור על העכבר על משטח חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף חם.</li>
	<li>שימון שתי העיניים עם משחה העין. הכנס 100 μL של 0.25% bupivicaine (כדי לספק כאבים מקומיים לעכבר כי יהיה האחרון 8-12 h) ו100 μL של 4 מ"ג/mL dexamethone (כדי להפחית את הדלקת שעלולה לנבוע הליך הניתוח) תת-עורי באתר החתך. אפשר לעכבר לשבת לפחות 5 דקות לפני המעבר לשלב הבא.</li>
	<li>נקה את הראש המגולח עם שלושה מטליות לסירוגין של בטאדין ו 70% אלכוהול. הפוך את חתך הקרקפת באמצע קו באמצעות להב או מספריים כירורגיים המשתרעת מאחורי אזור הגולגולת בין האוזניים לאזור הקדמי בין העיניים. העור הנותר נחתך. כדי לחשוף את הגולגולת</li>
	<li>נקה את רקמת החיבור הממוקמת בין הקרקפת לבין הגולגולת הבסיסית עם 3% חמצן מימן (H2O2) ולהתאים את אזור המוח כדי להיות בתמונה עם קואורדינטות סטריאוטקטיקה. הערה: יש לעתים קרובות קצת דימום (שלב 1.5) מן החתך על פני הגולגולת. דימום זה בדרך כלל פותר על ידי עצמו בתוך 3-5 דקות.. ניקוי עם מי חמצן עוזר הטיפול הקודם bupi, (שלב 1.4) הוא ציין גם להגביל את כמות הדימום בזמן הזה.</li>
</ol>2. עכבר הגולגולת ניתוח השרשה
<ol><li>מקדחה פתיחה מעגלית ~ 4 מ"מ לתוך הגולגולת באמצעות סיבית מקדחה שיניים (0.7 מ"מ בקוטר טיפ) ובזהירות להסיר את החלק הזה של הגולגולת באמצעות מלקחיים מחודדים. לדימות הקליפה הסוחושית של העכברים בני 6-8 שבועות, לאתר את מרכז הפיום הגולגולת ב-2.5 האחורי ו ± 2.0 לרוחב לברגמה. במהלך קידוח, באופן קבוע להרטיב את הגולגולת עם תמיסת מלח סטרילי כותנה כדי לקרר את המוח, ניקוי פסולת העצם לרכך את עצם הגולגולת להסרת בסופו של דבר. הערה: הקואורדינטות לפתיחת הגולגולת ישתנו בהתאם לאזור העניין ולגיל העכברים.</li>
	<li>לאחר הסרת הגולגולת, בזהירות מקום coverglass קטן (גודל #0 ב 0.1 ± 0.02 מ"מ עובי) לחלח עם תמיסת מלח בפתיחת הגולגולת. יבש מלוחים עודפים באמצעות מחיקה סטרילית.</li>
	<li>שימוש במוליך מחודד (כגון טיפ פיפטה או הקצה המחודד של מקל שבור כותנה עץ), למרוח דבק ציאנואקרילי מסביב לחלון ולאפשר לו להצמיד למוח ולגולגולת. החל את הדבק פריימר על שאר הגולגולת ולרפא אותו עם אור ריפוי עבור 20-40 s. הכינו היטב מסביב לחלון עם הדבק הסופי ולרפא עם אור ריפוי עבור 20-40 s.</li>
	<li>הדבק צלחת ראש קטנה על הגולגולת על האונה הצלעות הימנית של פתיחת הגולגולת תחילה עם הדבק פריימר כמו פריימר ולאחר מכן עם הדבק הסופי. לרפא את שניהם עם אור ריפוי עבור 20-40 s כל אחד. הערה: אין צורך בתפרים אם הגולגולת מכוסה לחלוטין בדבק במהלך הליך זה.</li>
</ol>3. טיפול לאחר הניתוח
<ol><li>לאפשר לעכבר להתעורר בהעדר הרדמה (שחזור שנעשה על משטח חימום מתקצר את זמן ההחלמה) ולהחזיר אותו לכלוב הבית שלו פעם הערה לגמרי. הכנס מינון תת עורי אחד של בופרנורפין SR (0.5 מ"ג/ק"ג) כשככי כאבים שלאחר הניתוח מספיקה עבור 72 h.</li>
	<li>כדי להקל על התאוששות בריאה מהניתוח, לספק לעכבר מזון רך נוסף, אשר יכול להיות בצורה של אוכל אחיד רגיל במים כדי לרכך את האוכל או המזון בצורה של ג'ל. הערה: הוראה חד פעמי של המזון הרך מיד לאחר הניתוח מספיקה.</li>
	<li>לפקח על העכבר מדי יום לבריאות התאוששות נכונה עבור 72 הראשון של הליך הניתוח. לאחר מכן, לבצע הדמיה מוקדם יותר 2 שבועות מניתוח השרשה חלון. הערה: אם נעשה טוב, עכברים לשחזר היטב מראה התנהגויות אמבולטורי רגיל, מספיק חקר כלוב, לחות טובה, עלייה במשקל יציבה אינטראקציה נרחבת עם עכברים אחרים בכלוב ופריטים אחרים בכלוב. עכברים המראים עייפות, התייבשות ויותר מ 10% אובדן משקל לאחר הניתוח מורדמים והוסרו מן המחקר.</li>
</ol>4. שני-פוטון מיפוי המוח עבור הדמיה ראשונית
<ol><li>השתיל את העכבר (Isofלורה, 5% אינדוקציה ו 1.5% תחזוקה). ייצוב הראש באמצעות ברגים על מנת לטעון את הלוחית העליונה על מיקרוסקופ שני פוטון, להיות מתוחזק על צלחת חימום ב 35 ° c. הכנס intraperitoneally 100 μL של צבע כלי דם כגון Rhodamine B (2 מ"ג/mL). הערה: ניתן לעשות הדמיה גם בעכברים ערים ללא הרדמה. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה עולה כי הרדמה משפיע על הדינמיקה microglial מעקב27,28,29 וקיבוע ראש עבור שני הדמיה פוטון בעכברים ער מגביר את הלחץ גם במהלך הדמיה כרונית לפחות 25 ימים (ראה juצ'כיה ואח ', 2020)30.</li>
	<li>לנקות את פני השטח של חלון הגולגולת בעדינות באמצעות ספוגית כותנה המיטה ב 70% אתנול. לשים כמה טיפות מים או תמיסת מלח על החלון הגולגולת ולהקטין את העדשה האובייקטיבית לתוך הפתרון מאז המטרה היא עדשה טבילה.</li>
	<li>יד לצייר מפה גסה כדי לציין את מוקדי העניין של כלי הדם העיקריים במחברת מעבדה תוך הסתכלות דרך עינית על ידי אפיפלורנציה. השתמש בציור זה כדי לזהות את האזורים הספציפיים במהלך שני תמונות פוטון. לחילופין, צלם את כלי הדם באמצעות מצלמה הותאמה למיקרוסקופ או דרך מצלמה או טלפון מוחזקים ביד. הערה: תמונות ותמונות שצוירו ביד הן כדי להקל על ביקור משני האזורים הרחבים שמתחת למיקרוסקופ לפני שתי הדמיה של פוטון. . אלה לא מיפוי תמונה מדויק</li>
	<li>מתחת לשני הדמיה פוטון, לאסוף תמונות של תאי הפלוריום וכלים לפי הצורך. קח הערות זהירות עם קואורדינטות מתאימות כדי להבטיח כי האזורים המדויקים ניתן לעבור בעיון הדמיה הבאים. לאסוף מספר שדות של תצוגה הפעלה זו הדמיה ראשונית למשל לרכוש z-מחסנית תמונות כל 1-2 יקרומטר באמצעות נפח של רקמות. הערה: במהלך איסוף תמונות על-ידי שני פוטון, נקודות הציון של כלי הדם משמשות למיפוי גס. אם יש צורך במיפוי משובח, משתמשים בדנדריטים בעלי תווית YFP מ-Thy1-YFP31 עכברים.<ol>
<li>השתמש בפרמטרים המומלצים הבאים לדימות: אורך גל של 880-900 ננומטר הוא אופטימלי; עבור GFP ו/או dsRed/Rhodamine, a 565 nm דיקרואיק מראה עם 525/50 nm (ערוץ ירוק) ו 620/60 nm (ערוץ אדום) מסנני פליטה משמשים; עבור הפרדת GFP ו-YFP, 509 nm דיקרואיק מראה עם 500/15 ו 537/26 ננומטר מסנני פליטה משמשים; הכוח במוח מתוחזק ב -25 mW או למטה; רזולוציית התמונה היא 1024 x 1024 פיקסלים, השדה של תצוגה נלקח עם מטרה 25X 0.9 NA בפקטור 1.5 X זום 295.24 x 295.24 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בסוף ההדמיה, לקחת את העכבר מהבמה, לאפשר לו להתעורר מהרדמה ולחזור לכלוב הבית שלו עד למפגש הדמיה עתידית.</li>
</ol>5. שני-פוטון דימות והדמיה מחדש
<ol><li>להמשך הפעלות הדמיה בעתיד, אשר יכול להיות בכל מקום החל מספר שעות לחודשים לאחר הפעלת ההדמיה הראשונית, מורדם העכבר (Isofלאנה, 5% אינדוקציה ו 1.5% תחזוקה), הר על מיקרוסקופ שני פוטון, לשמור על צלחת חימום מחדש להזריק 100 μl צבע כלי הדם כגון Rhodamine B (</li>
	<li>פתחו את התמונות שהושגו קודם לכן ב-ImageJ, והשתמשו בתמונות אלה וכן בהערות מההפעלה הקודמת, מזהים את אזורי התמונה הקודמים ומשחזרים אותם בקפידה.</li>
	<li>חזור על פעולה זו כל עוד חלון ההדמיה ברור או חיוני למידת המחקר.</li>
</ol>

<ol><li>Engle, S. J., Blaha, L., Kleiman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+Practices+for+Translational+Disease+Modeling+Using+Human+iPSC-Derived+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Best Practices for Translational Disease Modeling Using Human iPSC-Derived Neurons.</a> Neuron. 100 (4), 783-797 (2018).</li>
<li>Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Microfluidic+Models+for+Neurodegenerative+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">In Vitro Microfluidic Models for Neurodegenerative Disorders.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).</li>
<li>Croushore, C. A., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+systems+for+studying+neurotransmitters+and+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic systems for studying neurotransmitters and neurotransmission.</a> Lab Chip. 13 (9), 1666-1676 (2013).</li>
<li>Wu, V. W., Schwartz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+models+for+reactive+gliosis%3A+new+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Cell culture models for reactive gliosis: new perspectives.</a> J Neuroscience Research. 51 (6), 675-681 (1998).</li>
<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-endothelial+interactions+and+blood-brain+barrier+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability.</a> Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Pena, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+as+tool+to+test+long-term+effects+of+chemicals+on+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures as tool to test long-term effects of chemicals on the nervous system.</a> Current Medicinal Chemistry. 17 (10), 987-1001 (2010).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+Brain+Slice+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Organotypic Brain Slice Cultures.</a> Current Protocols in Immunology. 123 (1), 59(2018).</li>
<li>Heine, C., Franke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+co-culture+systems+to+study+axon+regeneration+in+the+dopaminergic+system+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice co-culture systems to study axon regeneration in the dopaminergic system ex vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 1162, 97-111 (2014).</li>
<li>Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures+to+model+neurodegenerative+proteinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecualar+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies.</a> Molecualar Neurodegeneration. 14 (1), 45(2019).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Kerr, J. N., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+vivo%3A+watching+the+brain+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nature Review Neurosciences. 9 (3), 195-205 (2008).</li>
<li>Akassoglou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+of+CNS+Injury+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging of CNS Injury and Disease.</a> Journal of Neuroscience. 37 (45), 10808-10816 (2017).</li>
<li>Tran, C. H., Gordon, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+and+microvascular+imaging+in+awake+animals+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Astrocyte and microvascular imaging in awake animals using two-photon microscopy.</a> Microcirculation. 22 (3), 219-227 (2015).</li>
<li>Tvrdik, P., Kalani, M. Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+of+Microglial+Calcium+Signaling+in+Brain+Inflammation+and+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging of Microglial Calcium Signaling in Brain Inflammation and Injury.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2366(2017).</li>
<li>Bennett, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Combination+of+Ontogeny+and+CNS+Environment+Establishes+Microglial+Identity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Combination of Ontogeny and CNS Environment Establishes Microglial Identity.</a> Neuron. 98 (6), 1170-1183 (2018).</li>
<li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival%2C+Specification%2C+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li>
<li>Mueller, K. L., Hines, P. J., Travis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmunology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuroimmunology.</a> Science. 353 (6301), 760-761 (2016).</li>
<li>Kipnis, J., Filiano, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmunology+in+2017%3A+The+central+nervous+system%3A+privileged+by+immune+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuroimmunology in 2017: The central nervous system: privileged by immune connections.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 83-84 (2018).</li>
<li>Moloney, R. D., Desbonnet, L., Clarke, G., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiome%3A+stress%2C+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mammalian+Genome%22%5BJournal%5D)">The microbiome: stress, health and disease.</a> Mammalian Genome. 25 (1-2), 49-74 (2014).</li>
<li>Skonieczna-Zydecka, K., Marlicz, W., Misera, A., Koulaouzidis, A., Loniewski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiome-The+Missing+Link+in+the+Gut-Brain+Axis%3A+Focus+on+Its+Role+in+Gastrointestinal+and+Mental+Health%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microbiome-The Missing Link in the Gut-Brain Axis: Focus on Its Role in Gastrointestinal and Mental Health.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (12), 521(2018).</li>
<li>Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
<li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Developmental Neurobiology. 68 (6), 771-778 (2008).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Grutzendler, J., Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+two-photon+imaging+of+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcranial two-photon imaging of the living mouse brain.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptor+CX%283%29CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Molecular Cell Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li>
<li>Liu, Y. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+network+activity+controls+microglial+process+surveillance+in+awake+mice+via+norepinephrine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).</li>
<li>Stowell, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noradrenergic+signaling+in+the+wakeful+state+inhibits+microglial+surveillance+and+synaptic+plasticity+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Two-Photon+Imaging+of+Anesthesia-Specific+Alterations+in+Microglial+Surveillance+and+Photodamage-Directed+Motility+in+Mouse+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo Two-Photon Imaging of Anesthesia-Specific Alterations in Microglial Surveillance and Photodamage-Directed Motility in Mouse Cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 421(2019).</li>
<li>Juczewski, K., Koussa, J., Kesner, A., Lee, J., Lovinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+behavioral+correlates+in+the+head-fixed+method%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Stress and behavioral correlates in the head-fixed method.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2Y12R-Dependent+Translocation+Mechanisms+Gate+the+Changing+Microglial+Landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">P2Y12R-Dependent Translocation Mechanisms Gate the Changing Microglial Landscape.</a> Cell Reports. 23 (4), 959-966 (2018).</li>
<li>Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polydendrocytes+%28NG2+cells%29%3A+multifunctional+cells+with+lineage+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity.</a> Nature Review Neurosciences. 10 (1), 9-22 (2009).</li>
<li>Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+cells+generate+both+oligodendrocytes+and+gray+matter+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes.</a> Development. 135 (1), 145-157 (2008).</li>
<li>Hughes, E. G., Kang, S. H., Fukaya, M., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+progenitors+balance+growth+with+self-repulsion+to+achieve+homeostasis+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte progenitors balance growth with self-repulsion to achieve homeostasis in the adult brain.</a> Nature Neuroscience. 16 (6), 668-676 (2013).</li>
<li>Berthiaume, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Remodeling+of+Pericytes+In+Vivo+Maintains+Capillary+Coverage+in+the+Adult+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dynamic Remodeling of Pericytes In Vivo Maintains Capillary Coverage in the Adult Mouse Brain.</a> Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).</li>
<li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li>
<li>Holtmaat, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+persistent+dendritic+spines+in+the+neocortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo.</a> Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).</li>
<li>Wang, C., Mei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+electroporation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In utero electroporation in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1018, 151-163 (2013).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e3024(2011).</li>
<li>Chakrabarty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid+serotype+and+timing+of+injection+determines+AAV+transduction+in+the+neonatal+mice+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain.</a> PLoS One. 8 (6), 67680(2013).</li>
<li>Guenthner, C. J., Miyamichi, K., Yang, H. H., Heller, H. C., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+genetic+access+to+transiently+active+neurons+via+TRAP%3A+targeted+recombination+in+active+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Permanent genetic access to transiently active neurons via TRAP: targeted recombination in active populations.</a> Neuron. 78 (5), 773-784 (2013).</li>
<li>Pilz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neurogenesis+in+the+adult+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus.</a> Science. 359 (6376), 658-662 (2018).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kilohertz+two-photon+fluorescence+microscopy+imaging+of+neural+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo.</a> Nature Methods. 17 (3), 287-290 (2020).</li>
<li>Yang, W., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of neural activity.</a> Nature Methods. 14 (4), 349-359 (2017).</li>
<li>Hannan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+deep+neural+activity+from+the+cortical+surface+during+hippocampal+epileptiform+events+in+the+rat+brain+using+electrical+impedance+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of deep neural activity from the cortical surface during hippocampal epileptiform events in the rat brain using electrical impedance tomography.</a> Neuroimage. 209, 116525(2020).</li>
<li>Kulkarni, R. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Two-Photon+Voltage+Imaging+with+Sulfonated+Rhodamine+Dyes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">In Vivo Two-Photon Voltage Imaging with Sulfonated Rhodamine Dyes.</a> ACS Central Science. 4 (10), 1371-1378 (2018).</li>
<li>Chamberland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+two-photon+imaging+of+subcellular+voltage+dynamics+in+neuronal+tissue+with+genetically+encoded+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators.</a> Elife. 6, (2017).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הופעתו של vivo שני פוטון הדמיה פתחה הזדמנויות לחקור שפע של אינטראקציות סלולר ודינמיקה המתרחשים במוח בריא. המחקרים הראשוניים התמקדו בשימוש בגישת הגולגולת הפתוחה לגלונטיס של התמונה באמצעות דימות כרוני ואקוטי37,38. זה יכול לשמש גם כדי להבהיר אינטראקציות נוירוחיסוניות במוח. פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור הדמיה אמינה של תאים מתויגים פלואורוסקופים (במיוחד microglia, התא החיסונית התושב של המוח) לתקופות ממושכות של זמן בטווח קצר או ארוך. השימוש בצבעי כלי דם ו/או פלואור מתויג ...

מערכת העצבים המרכזית (CN) נשלטת על ידי הגומלין המורכבים של אינטראקציות בין סוגי תאים שונים הכוללים נוירונים, גליה ותאים המשויכים לספינה. באופן מסורתי, התאים העצביים נחקרו בבידוד, שיתוף תרבותי1,2,3,4,5 (בתוך מבחנה) או ברקמת מוח מחפירה (ex vivo)6,7,8,9, 10 ההקשרים10 . עם זאת, יש צורך להבין עוד התנהגות התא העצבי ואינטראקציות בסביבה הטבעית של המוח שלם בvivo. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה למפות באזורים vivo מעניינים ולשחזר בדיוק את האזורים האלה בהפעלות הדמיה עתידיות כדי לעקוב אחר האינטראקציות המורכבות בין סוגי תאי ה-CN השונים בפרקי זמן ארוכים.
התפתחות בגישות הדמיה vivo סיפקה רווחים משמעותיים עבור הבנה נכונה של תפקוד עצבי11,12,13,14,15. באופן ספציפי, גישות אלה מספקות מספר יתרונות על פני המסורתית בגישות מחוץ לvivo ולשעבר. ראשית, במערכות הדמיה vivo יש מבחינה פיזיולוגית רכיבים סלולריים ורקמות כגון ואצלב עם הרפרטואר המלא של אינטראקציות סלולריות כדי לספק הבנה מלאה של הפיזיולוגיה של הרשת העצבית. שנית, ממצאים אחרונים מראים כי כאשר הוסרו מן הסביבה הטבעית שלהם, תאים עצביים מסוימים (כגון microglia) לאבד תכונות חשובות של זהותם ולכן פיזיולוגיה16,17 אשר ניתן לשמור בvivo בהגדרה. שלישית, במערכות הדמיה vivo לספק את ההזדמנות לחקירות האורך יציבה של שבועות עד חודשים כדי ללמוד אינטראקציות הסלולר של ה-CN. לבסוף, בהינתן הראיות ההולכות וגדלות עבור תרומות ממערכת החיסון ההיקפית18,19 ו-microbiome20,21 ב הנוירופיזיולוגיה, ב vivo מערכות לספק פלטפורמה לחקור תרומות כאלה ואפקטים על תאי הבסיס. לפיכך, גישות העושות שימוש אורכי בהדמיה הvivo לחקר הפיזיולוגיה החיסונית והאינטראקציות של מדינות בריאות, פצועים ומצבים נגועים הם תוספת משלימה מאוד לגישות המסורתיות.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים גישה מהימנה לתמונה סוגי תאים שונים במוח כולל microglia, נוירונים ו NG2+ תאים כדוגמאות. שתי גישות להמחיש את תאי העצבים בvivo פותחו: גישת הגולגולת הדקה והגולגולת הפתוחה עם גישה לחלון הגולגולת. למרות הגישות הגולגולת דיללו נמצאים בשימוש והם העדיפו כי הם להתגבר על כמה חסרונות של גישה הגולגולת הפתוחה כגון הפעלת התא גליה, גבוה יותר מאשר הדינמיקה של עמוד השדרה והשימוש של סוכנים אנטי דלקתיות22,23,24,25, הגולגולת דיללו גישות גם להראות כמה חסרונות קריטיים. ראשון, ההליך דליל הוא הליך עדין מאוד, כי חוקרים רבים למצוא קשה למושלם במיוחד כאשר מחדש דליל הוא הכרחי. זה המקרה כי זה לעתים קרובות קשה לניסויים כדי לוודא כי יש להם לדבר את הגולגולת לעומק ~ 20 יקרומטר. שנית, עבור השוואות נאותה בין עכברים, דליל צריך להיות זהה מגוון של הצלחות דליל בין הפעלות הדמיה או עכברים יכול לסבך ויזואליזציה של מבנים עצביים. שלישית, כאשר מועסק עבור הדמיה האורך, בעלי חיים עם גולגולות דיללו ניתן להשתמש רק עבור מספר מוגבל של הפעלות כאשר מחדש דליל של הגולגולת מועסק. בנוסף, מאז חלק רקמת העצם עדיין נשאר, בהירות בעומק של הדמיה יכול להיות נפרץ מפני גישה הגולגולת דיללו המאפשר ויזואליזציה גדולה של שטחי יותר, אבל לא כמו עם אזורים עמוקים יותר. לאור זה, מבנים במוח עמוק יותר כגון ההיפוקמפוס, לא ניתן לבצע התמונה בהצלחה עם גישה הגולגולת דיללו. שיקולים אלה מעלים את הצורך בגישות חלופיות ומשלימות העלולות להתגבר על החששות הללו.
חלופה גישה הגולגולת דיללו, הגישה הפתוחה הגולגולת החלון משתמשת בהליך שבו הגולגולת מוחלף עם שמיכות זכוכית ברורה אופטית. הדבר מאפשר מספר קרוב-בלתי מוגבל של הפעלות דימות. יתר על כן, בהתחשב החלפת הגולגולת עם שמיכות זכוכית, שיטה זו מאפשרת חלון צפייה ברור של כדוריות המוח מתויג fluorescently לתקופות נרחבות של פעמים משעות עד חודשים, ולכן, יכול להיות מועסק כדי ללמוד פעילות תאים ואינטראקציות הרלוונטיות לפיזיולוגיה, הזדקנות פתולוגיה.
באופן כללי, אנו פירוט צעדים שניתן לעקוב אחר לעשות השתל חלונות גולגולת כרונית באמצעות פתיחת גולגולת סטריאוטקאית המאפשרת הדמיה vivo של אזורי המוח של עניין. כמו כן נתאר כיצד המוח היציב בצורה גסה ובעל הדנדריטים המסומנים בעזרת הדנדטים יכולים לשמש להפקת מפה מחוספס או משובח, בהתאמה לאזורי המוח של העניין. גישה זו יכולה לשמש להדמיה חוזרת על פני מספר מפגשים. החשיבות של טכניקה זו, לפיכך, טמונה ביכולתה לדמות את השינויים לטווח הארוך או הקיפאון במרכיבי המוח, כולל ההסדר, המבנה והאינטראקציות של סוגי הסלולר השונים.

<table><tbody><tr><td>Coverglass (3 מ"מ)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0726</td><td></td></tr><tr><td>דבק ציאנואקרילט (Krazy Glue)</td><td>Amazon</td><td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2</td><td></td></tr><tr><td>Demi Ultra LED Curing Light</td><td>System Dental Health Products, Inc</td><td>910860-1</td><td></td></tr><tr><td>מקדחה דנטלית</td><td>אוסאדה: www.osadausa.edu</td><td>EXL-M40</td><td></td></tr><tr><td>מקדח</td><td>כלים מדעיים עדינים</td> <td>#19008-07</td><td></td></tr><tr><td>משחת עיניים</td><td>הנרי שיין</td><td>1338333</td><td></td></tr><tr><td>iBond Total Etch (דבק פריימר)</td><td>Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)</td><td>66040094</td><td></td></tr><tr><td>רודמין B</td><td>Millipore Sigma</td><td>81-88-9 (R6626)</td><td></td></tr><tr><td>טטריס דבק Evoflow (דבק סופי)</td><td>שקע עליון (Ivoclar Vivadent)</td><td>#595956</td><td></td></tr><tr><td>Wahl Brav Mini+</td><td>Amazon</td><td></td><td></td>https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1</tr></tbody></table>

מיפוי המוח מדויק לבצע חוזרות ונשנות של הדמיה vivo של נוירודינמיקה החיסונית בעכברים

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

מערכת העצבים המרכזית (CN) מוסדר על ידי הגומלין מורכבים של הנוירואליות, glial, סטרומה, ובתאי כלי דם המאפשרים את תפקידה התקין. למרות שלומדים תאים אלה בבידוד בחוץ-גופית או ביחד לשעבר vivo מספק מידע פיזיולוגי שימושי; תכונות בולטות של פיזיולוגיה התא העצבי יהיה לפספס הקשרים כאלה. לכן, יש צורך ללמוד תאים עצביים הילידים שלהם בסביבה vivo. הפרוטוקול מפורט כאן מתאר חוזר ונשנה ב vivo שני פוטון הדמיה של תאים עצביים בקליפת מכרסם ככלי כדי להמחיש וללמוד תאים ספציפיים על פני תקופות ממושכות של זמן משעות לחודשים. אנו מתארים בפרוטרוט את השימוש במוח יציב בצורה גסה ובאופן מחוספס כמפה גס או מתויג הדנדריטים הדנדטים כמפה יפה של אזורי המוח הנבחרים של עניין. באמצעות מפות אלה כמפתח חזותי, אנו מראים כיצד התאים העצביים יכול להיות מועבר בדיוק עבור חוזרות ונשנות של vivo הדמיה. באמצעות דוגמאות של הדמיה vivo של מיקרוגליה מתויג, נוירונים, ו NG2+ תאים, פרוטוקול זה מדגים את היכולת של טכניקה זו כדי לאפשר הדמיה חוזרת של דינמיקה הסלולר באותו מיקום המוח על פני תקופות זמן ממושכות, כי יכול לסייע עוד יותר בהבנת התגובות מבניים ופונקציונלי של תאים אלה בפיזיולוגיה נורמלית או לאחר עלבונות פתולוגיים. במידת הצורך, גישה זו יכולה להיות משולב הדמיה תפקודית של תאים עצביים, למשל, עם הדמיה סידן. גישה זו היא במיוחד טכניקה רבת עוצמה כדי להמחיש את האינטראקציה הפיזית בין סוגי תאים שונים של ה-CN ב vivo כאשר מודלים של עכבר גנטי או צבעים ספציפיים עם תגי פלורסנט ברורים כדי לתייג את תאי העניין זמינים.

כדי להמחיש את הדינמיקה microglial ב vivo, כפול טרנסגניים CX3CR1gfp/+: עכברים Thy1yfp שימשו. הקו Thy1-YFP H משמש לעומת קו Thy1-GFP M כדי למנוע חפיפה של מיקרוגליה (GFP) ונוירונים (YFP). גישות חלופיות יכול להשתמש בשורה כתב שבו מיקרוגלייה מתויגים עם למשל, tdtomato ולאחר מכן את הקו Thy1-gfp M ניתן להשתמש. חיסרון של קו H הוא כי תוויות YFP הרבה נוירונים והתווית עולה עם הגדלת גיל (התבוננות אישית). הקו M מציג תיוג דליל של נוירונים. בין 2 – 4 שבועות של ניתוח השרשה חלון, דינמיקה microglial יכול להיות ואחריו הד...

פרוטוקול זה מתאר טכניקת השרשה כרונית חלון הגולגולת שניתן להשתמש בהם עבור הדמיה האורך של מבנים נוירווליו-כלי דם, אינטראקציות, ותפקוד בתנאים בריאים ונגועים. היא משמשת כחלופה משלימה לגישת הדימות הtranscranial, שבזמן הרצוי לעתים קרובות, יש כמה מגבלות קריטיות.

מיפוי המוח מדויק לבצע חוזרות ונשנות של הדמיה Vivo של נוירודינמיקה החיסונית בעכברים

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

פרוטוקול זה מדגים כיצד ניתן להשתמש במיקרוסקופיה של Vivo Two-Photon כדי לבצע הדמיה חוזרת של הדינמיקה התאית, באותו מיקום מוחי לאורך פרקי זמן ממושכים. היתרון של טכניקה זו הוא, זה מאפשר לדמיין את השינויים לטווח ארוך באלמנטים הסלולר של המוח, כולל הסדר, מורפולוגיה, אינטראקציות פיזיות בין סוג תאים שונים של CNS. טכניקה זו יכולה להיות שימושית במיוחד בהגייה של אינטראקציות בין תאים לתאים, דינמיקת תאים ושינויים מורפולוגיים במהלך פלסטיות המוח, ונוירוזנרציה.התחל על ידי הכנת צעיר או מבוגר צעיר, בן ארבעה עד 10 שבועות, עכבר הטרוזיגוטה GFP CX3CR1, ששוקל 17 עד 25 גרם, להשתלת חלון גולגולתי. לאחר הרדמה של העכבר, השתמש גוזם שיער כדי לגלח את השיער על ראשו, בין האוזניים, בערך, מן העיניים, לראש אזור הצוואר. הזיזו את העכבר לתחנת הניתוח הסטריאוטטית, חרוט האף וייצבו את ראשו באמצעות פסי אוזניים.שמור על העכבר על משטח החימום, לאורך כל ההליך. שימון את שתי העיניים עם משחת שמן, ולאחר מכן להזריק 100 microliters של 0.25%bupivacaine, ו 100 microliters של ארבעה מיליגרם למיליליטר dexamethasone, תת עורית באתר החתך. המתן לפחות חמש דקות לפני שתמשיך.לדמם את הראש מגולח, עם שלוש ספוגיות לסירוגין של betadine, ו 70% אלכוהול. ואז לעשות חתך הקרקפת קו האמצע עם להב כירורגי או מספריים. המשתרע מהגב של אזור הגולגולת, בין האוזניים, לאזור הקדמי בין העיניים.חותכים את העור הנותר כדי לחשוף את הגולגולת. לדמם את רקמת החיבור הממוקם בין הקרקפת לבין הגולגולת הבסיסית עם 3%מי חמצן, ולמקם את אזור המוח כדי להיות בתמונה עם קואורדינטות סטראוטקטיות. לקדוח פתח עגול, כארבעה מילימטרים לתוך הגולגולת, באמצעות קצת מקדחה שיניים.במהלך הקידוח, הרים באופן קבוע את הגולגולת עם מלוחים סטריליים מטליות כותנה כדי לקרר את המוח. לנקות את פסולת העצם, ולרכך את עצם הגולגולת. בסיום, הסר בזהירות חלק זה של הגולגולת עם מדפים מחודדים.לאחר הסרת הגולגולת, מניחים בזהירות כיסוי קטנה, לחה עם מלוחים בגולגולת. יש לייבש את התמיסת מלח העודפת באמצעות מגבון סטרילי. באמצעות מוליך מחודד, להחיל דבק cyanoacrylate סביב החלון, ולאפשר לו לצרף למוח ולגולגולת.החל את הדבק פריימר על שאר הגולגולת, לרפא אותו עם אור ריפוי במשך 20 עד 40 שניות. ליצור באר סביב החלון עם הדבק הסופי, לרפא אותו עם אור ריפוי במשך 20 עד 40 שניות. הדבק צלחת ראש קטנה על הגולגולת, על חצי הכדור ההפוך, craniotomy, עם הדבק פריימר, ולאחר מכן עם הדבק הסופי, ריפוי שניהם במשך 20 עד 40 שניות.לאחר שהעכבר מתעורר, להזריק מנה תת עורית אחת של buprenorphine SR כמו משכך כאבים לאחר הניתוח, אשר יהיה מספיק במשך 72 שעות. להחיות את העכבר עם מזון מלח נוסף כדי להקל על התאוששות בריאה. הדמיה יכולה להתבצע כבר שבועיים לאחר ניתוח ההשתלה.השתמש ברגים כדי להרכיב את צלחת הראש על שלב מיקרוסקופ שני פוטון, אשר צריך להישמר ב 35 מעלות צלזיוס עם צלחת חימום. להזריק את העכבר תת עורית עם 100 microliters של צבע כלי הדם, כגון רודמין B.Gently לנקות את פני השטח של החלון הגולגולתי עם ספוגית כותנה, dabbed ב 70% אתנול. שים כמה טיפות מים או מלוחים על החלון, ולהוריד את העדשה האובייקטיבית לתוך הפתרון.ודא שהלייזר כבוי כשהמטרה יורדת, וצייר מפת קורסים כדי לציין את ציוני הדרך העיקריים של כלי הדם, תוך כדי התבוננות דרך העינית. השתמש בציור זה כדי לזהות את האזורים הספציפיים במהלך דימות שני פוטונים. לאסוף תמונות של תאים פלואורסצנטיים וכלי באמצעות הדמיה שני פוטון.עיין בכתב היד של הטקסט לקבלת פרמטרי הדמיה, רשום הערות זהירות עם קואורדינטות מתאימות, כדי להבטיח שניתן יהיה לבקר מחדש את האזורים המדויקים להדמיה עוקבת. צייר כמו כמה שדות מבט במפגש הדמיה ראשוני זה, בסוף ההדמיה, להוריד את העכבר מהבמה, לאפשר לו להתעורר מהרדמה, ולהחזיר אותו לכלוב הבית שלו. השתמש בהערות ובתמונות שהושגו כדי לדמיין מחדש את האזורים במהלך ההפעלות הבאות.פרוטוקול זה שימש כדי לדמיין דינמיקה מיקרוגליאלית ב Vivo, בעכברי קו YFP-H טייוואן. דנדריטים ספציפיים, שימשו כציוני דרך יציבים למיפוי עדין של אזורי מוח. בעוד דנדריטים הם יציבים, כמה microglia לנוע מדי יום.עכברי CX3CR1/GFP מהופנטים יחידים, שימשו למעקב אחר מיקרוגליה במשך עד שמונה שבועות. זריקות של רודמין B, שימשו כדי לתייג את כלי הדם, במהלך כל מפגש הדמיה. בעוד כלי הדם נשאר קבועים באופן קבוע, המיקרוגליה דינמית.עכברי CX3CR1/GFP, שימשו למעקב אחר מיקרוגליה לפני ואחרי התקפים חמורים. מבנה מיטת כלי הדם נשמר, אך הרשת הסלולרית המיקרוגליאלית ונוף המיקום היו ארעיים. שינויים גדולים יותר נצפו בתוך 24 עד 48 שעות של התקפים.עכברים מהונדסים כפולים CX3CR1/GFP ו-NG2DS-Red, שימשו למעקב אחר מיקרוגליה, ו-NG2 לתאים חיוביים ב-Vivo. מבלי לתייג את כלי הדם, microglia, כמו גם טפילים הקשורים כלי, ותאי מבשר אוליגודנדרוציטים, או OPCs, זוהו. טפילים יש תהליכים מוארכים הבאים לאורך קיר כלי הדם, OPCs בדרך כלל להראות גופי תאים גדולים יותר השוכנים parenchyma המוח, הרחק כלי הדם.כאשר נעשה שימוש ברודמין B, ניתן היה להבדיל את הפלואורסצנטיות הבהירה יותר של טפילים מהפלואורסצנטיות הקלושה יותר של רודמין זוהר, למרות קריאה דומה במהלך ההדמיה. ההדמיה היומית הראתה כי טפילים היו ממוקמים באופן הדוק, בעוד OPCs ו microglia היו דינמיים. חשוב להקפיד על התבוננות זהירה באזור המדמיין, לצייר מפה מייצגת מדויקת ככל האפשר, ולציין את הצעדים שננקטו כדי להגיע למקומות האחרים ביחס לנקודת ההתחלה.בהפעלות ההדמיה הבאות, שלבים אלה, המפות שצוירו ביד והתמונות שצולמו בעבר, יהיו קריטיים בזיהוי אותם מיקומים שוב ושוב. טכניקה זו אפשרה לחוקרים להבהיר אינטראקציות נוירון-גליה, אינטראקציות נוירו-חיסוניות, ודינמיקה נוירו-תאית של תקופות זמן ממושכות הן בבריאות והן בפתולוגיה.

precise-brain-mapping-to-perform-repetitive-vivo-imaging-neuro-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מתארים שיטה שוב ושוב לדמיין microglia Murine והפצת...

הגולגולת דק חלון טכניקה כרונית דו פוטון ב-vivo הדמיה של microglia Murine של מודלים של Neuroinflammation

שיטות bioimaging להערכת biodistribution התא של חלקיקים המתאימים ניטור טיפולית אבחון של תרכובות nanoformulated. השיטות שתוארו לעיל הם רגיש וספציפי כאשר העריכו ידי coregistration היסטולוגית. מתודולוגיות לספק מסלול translational מ מכרסם ליישומים האדם.

Bioimaging רשום של ננו לניטור האבחון והטיפול

דימות תהודה מגנטית (MRI) הפך לכלי פופולרי יותר ויותר לבחינת הפנוטיפ של עכברים שעברו שינוי גנטי. מאמר זה מדגים את שיטות הדרושים כדי להשיג תפוקה גבוהה phenotyping של עכברים שעברו שינוי גנטי באמצעות מרובות עכבר MRI.

מרובה עכבר Neuroanatomical תהודה מגנטית

מקור: Bisht, K., et al. מיפוי מוח מדויק לביצוע הדמיה חוזרת של דינמיקה נוירו-אימונית בעכברים. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים הדמיה פלואורסצנטית של דינמיקה נוירו-אימונית בעכבר טרנסגני עם שתל גולגולת. יציבות כלי הדם והעצבים מצולמת לצד שינויים דינמיים במיקרוגליה, המשקפים תגובות חיסוניות לפעילות עצבית.

הדמיה פלואורסצנטית של דינמיקה נוירו-אימונית באמצעות שתל גולגולת

שינויים מולקולריים חוויה תלויה בתאי עצב חיוניים ליכולתו של המוח להסתגל בתגובה לאתגרים התנהגותיים.

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

סרטון זה מציג את הליך הגולגולת המאפשר הדמיה כרונית של נוירונים בקליפת המוח הרטרו-טחולית של העכבר באמצעות מיקרוסקופ פוטונים שני פוטונים in vivo בקו טרנסגני Thy1-GFP. גישה זו משולבת עם הזרקת נגיף הקשור לאדנו המבטא mCherry לתוך ההיפוקמפוס הגבי. טכניקות אלו מאפשרות ניטור ארוך טווח של פלסטיות מבנית תלוית ניסיון ב-RSC.

שני פוטונים סימולטני<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

מוצג כאן פרוטוקול להשתלת חלון גולגולתי כרוני להדמיה אורכית של תאי מוח בעכברים ערים ומרוסנים ראש.

השתלת חלון גולגולת להדמיה חוזרת ונשנית In Vivo בעכברים ערים

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המשלב הזרקת וירוסים הקשורים באדנו עם השתלת חלון גולגולתי לצורך הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים.

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

דימות טומוגרפיה טורית של שני פוטונים (STPT) היא טכניקה לדימוי מסה של רקמה בצורתה התלת-ממדית על ידי שילוב של דימות דו-פוטוני עם בקרת במה אוטומטית וחיתוך מיקרוטום. כאן אנו מתארים פרוטוקול ליישומו עבור מוחות מרמוסטים כדי להבין טוב יותר את התכונות המבניות שלהם.

טומוגרפיה טורית של שני פוטונים של כל המוח המרמוסטי לניתוחים נוירואנטומיים

הקמנו מבחן הכלאה דופלקס באתרו למיפוי איזופורמים של קולטני אינסולין IR-A ו-IR-B במקלעת הכורואיד של העכבר, תוך התגברות על מגבלות השיטות המסורתיות. גישה ברזולוציה גבוהה זו חושפת ביטוי ספציפי לאיזופורמים, ומציעה תובנות חדשות לגבי איתות אינסולין במוח וטיפולים ממוקדי איזופורמים פוטנציאליים להפרעות נוירולוגיות.

הדמיה מדויקת של קולטני אינסולין A ו-B במוח עכברים עם בדיקת היברידיזציה של RNA באתרו

למד טכניקת השתלת חלון גולגולתי לדימוי מוח לאורך זמן בעכברים CX3CR1 GFP באמצעות מיקרוסקופיית Two-Photon. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר דינמיקה תאית ואינטראקציות במערכת העצבים המרכזית.

מיפוי המוח מדויק לבצע חוזרות ונשנות של הדמיה Vivo של נוירודינמיקה החיסונית בעכברים

גלה סרטונים נוספים