גישת ניתוק תא יחיד לניתוח מולקולרי של שלפוחית השתן בעכבר בעקבות פגיעה בחוט השדרה

פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא משתמש במידע ביולוגי כדי להקל על יצירת תרחיף תא בודד עם כדאיות תא גבוהה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לייצר תרחיפי תאים בודדים השומרים על כדאיות תאים גבוהה וייצוג הולם של סוגי התאים המבודדים. מי שידגים את ההליך הכירורגי יהיה חוסיין עטא, עמית במעבדה שלי.

מדגימים את הליך דיסוציאציה של רקמות עלי האשמי, וניתוח ה-FACS, יאסר חשמתי. לאחר אישור חוסר תגובה לרפלקס הדוושה בעכבר מורדם בוגר, יש למשש את התהליך הקוצני הבולט ביותר בעמוד השדרה החזי. משככי כאבים ואנטיביוטיקה ניתנים לפני הניתוח.

גלח מלבן אורך בגב העכבר מהצוואר התחתון ועד ממש מתחת לתהליך הקוצני הבולט ביותר וסנטימטר אחד בכל צד של קו האמצע. יש לחטא את העור החשוף שלוש פעמים עם מגבונים רציפים של 10% פובידון יוד ו-70% אתנול בצורה מעגלית החל ממקום החתך וכלפי חוץ. לאחר הניגוב האחרון, כסו את העכבר בחתיכת ספוג גזה סטרילית בגודל ארבעה על ארבעה אינץ' עם חלון מעל שדה הניתוח.

כדי לגרום לפגיעה בחוט השדרה, בצע תחילה חתך של 1.5 סנטימטר באמצע הגב והשתמש בדיסקציה קהה חדה כדי להפריד את השרירים מהתהליכים הקוצניים ומהלמינה של חוליות T9, T10 ו-T11. השתמש במספריים עדינים כדי לחלק בחדות את הרצועות הבין-קוצניות בין T9 ל- T10 ו- T10 ו- T11 לפני ביצוע כריתת למינקטומיה דו-צדדית של התהליך הקוצני T10. לאחר כריתת הלמינה לחלוטין, השתמש במספריים כדי לחצות את חוט השדרה.

כדי לחתוך לחלוטין את העמודים הרוחביים, טאטא בעדינות את קצה המספריים העדינים משני הצדדים. השתמש במריחת קצה כותנה סטרילית כדי לדחוס כל דימום. לאחר השגת הומאוסטזיס, יש לסגור את העור עם 7-0 תפרים רציפים של פוליגלקטין910 ולספק תת עורית מיליליטר אחד של תמיסת מלח למניעת התייבשות לאחר הניתוח, ולאחר מכן להחזיר את החיה לכלוב טרי עם ניטור עד לשכיבה מלאה.

כל 12 שעות, החזק את בעל החיים ביד אחת ולעסות את הבטן התחתונה ביד השנייה, השתמש באצבע המורה ובאגודל כדי לאתר ולדחוס בעדינות את שלפוחית השתן הנפוחה כדי לעורר ביטוי ידני של שלפוחית השתן עד שהחיה מסוגלת להשתין בכוחות עצמה. לניתוח במורד הזרם של סוגי תאי שלפוחית השתן המעניינים, בנקודת הזמן הניסוי המתאימה ולאחר שהחיה מורדמת כראוי, בצע לפרוטומיה בקו האמצע מהאגן לסרעפת וחתוך את הסרעפת מהצלעות. בעקבות גבול סחוס העצם במקביל לעצם החזה, פתח את בית החזה לאורך הצלעות משני צידי החיה החל מהסרעפת והמשך לצלע הראשונה.

לאחר קיבוע דופן בית החזה הקדמית מעל ראשו של בעל החיים, השתמש במספריים עדינים כדי לחתוך את קרום הלב ולחבר מחט בגודל 23 למנגנון הזילוף. הכנס את המחט לחדר השמאלי וקדם לאט את המחט לתוך אבי העורקים מבלי לנקב את הרקמה. כאשר המחט במקומה, התחל להחדיר את הרקמה עם PBS בקצב זרימה של 15 מיליליטר לדקה והשתמש בקצות של זוג מספריים עדינים כדי לבצע במהירות חתך קטן באטריום הימני.

כאשר הניקוז צלול וניתן להבחין בצבע כבד מובהר, הפסק את הזלוף ושחרר את שלפוחית השתן מכלי הדם והשופכה, ואז הנח את שלפוחית השתן לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל תמיסת טירוד קרה כקרח. כדי להכין תרחיף תא בודד, לאחר איסוף כל שלפוחית השתן, קרעו צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המכיל 100 מיקרוליטר של תמיסת Tyrode. לאחר השקילה, טחנו את שלפוחית השתן בצלחת פטרי בגודל 10 סנטימטר המכילה 100 מיקרוליטר של תמיסת טירוד והשתמשו בקצה פיפטה רחב כדי להעביר את שברי הרקמה ל-2.5 מיליליטר של חיץ עיכול לכל שלפוחית השתן.

דגרו את הרקמה למשך 40 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על מערבל Nutator והשתמשו בפיפטה של חמישה מיליליטר כדי לשלש את הדגימה למשך דקה אחת לפני איסוף התאים והרקמות המנותקים על ידי צנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של תמיסת ניתוק תאים והניחו את התאים על מערבל Nutator למשך 10 דקות נוספות. בתום הדגירה, אסוף את התאים עם צנטריפוגה נוספת והשהה מחדש את הכדור במיליליטר אחד של מאגר ליזה של תאים אדומים.

לאחר דקה אחת, עצור את הליזיס בתוספת תשעה מיליליטר PBS וסנן את התאים דרך מסננת של 70 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מיליליטר, ואז צנטריפוגה שוב את התאים והשהה מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של מאגר צביעה בתוספת בלוק FC. לאחר דגירה של 10 דקות על קרח, אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הגלולה בנפח המתאים של תערובת נוגדנים מצומדים פלואורופור למשך 20 דקות על קרח מוגן מאור. בתום הדגירה, שטפו את התאים עם מיליליטר אחד של מאגר צביעת תאים והשעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של מאגר צביעת תאים טריים בתוספת חמישה מיקרוליטר של FITC Annexin V ומיקרוליטר אחד של פרופידיום יודיד.

לאחר 15 דקות בטמפרטורת החדר, מוסיפים לתאים 400 מיקרוליטר של מאגר מחייב אנקסין ומערבבים בהיפוך. כדי לנתח את התאים על ידי ציטומטריית זרימה, השתמש תחילה בדגימת תא לא מוכתמת כדי להגדיר את פרמטרי הפיזור הצדדי והקדימה של התאים, ולאחר מכן למדוד את פליטת הקרינה ב-530 ננומטר ויותר מ-575 ננומטר כדי לא לכלול את התאים המתים. השתמש ברשתות על כל כתם נקודה כדי להגדיר את האוכלוסייה השלילית בדעיכה הראשונה והשתמש בפקדי הקרינה מינוס אחד כדי לתקן את החפיפה הספקטרלית עד ליישור אמצעי האוכלוסייה השליליים והחיוביים.

לאחר מכן מדוד 100,000 אירועים של התאים עם סמני העניין הספציפיים, וצור שערים לאוכלוסיות התאים המעניינות לפי הצורך. לאחר הפעלת כל הדגימות, נתח את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח הזרימה הציטומטרית המתאימה. קולגן 1A1, קולגן 3A1, קולגן 1A2 וקולגן 6A1 הם סוגי הקולגן הנפוצים ביותר בשלפוחית השתן של העכברים.

הניתוח לקביעת רמות ביטוי ה-mRNA של קולגנים 1, 3, 6 והיאלורונן מגלה כי הביטוי של רכיבי מטריצה חוץ-תאיים אלה נפוץ יותר באוכלוסיות תאים מזנכימליים מאשר באורותליום. ניתוח ציטומטרי זרימה מצביע על כך שמספר פרוטוקולי עיכול אנזימטיים שונים מניבים אוכלוסיות תאים ברות קיימא כאשר פרוטוקול העיכול השלישי המשמש בניתוח זה נקבע כיעיל ביותר בשימור תאים. באמצעות שיטה זו, ניתן להשיג עלייה משמעותית במספר הכולל של תאים שבודדו משלפוחית השתן של עכברים שנפגעו בחוט השדרה כדי להשוות אותו לשלפוחית הבקרה.

בהשוואה לביקורת, שלפוחית השתן מבעלי חיים שנפגעו בחוט השדרה מציגה גם עלייה משמעותית בתאים חיוביים ל-CD45. שלב 7.1 חשוב לזיהוי באוכלוסיית הלב. אסטרטגיית השער צריכה להיות מושכלת על ידי התאים המעניינים.

לשלפוחית השתן מחיות SCI יש אוכלוסיית תאים מובחנת. פרוטוקול זה יכול לשמש למיון תאים, תרבית תאים ראשונית, ריצוף תאים בודדים והליכים אחרים של מולקולות ותאים במורד הזרם הדורשים תאים בודדים ברי קיימא. פרוטוקול זה מספק כדאיות גבוהה ולכן אובדן אוכלוסיית תאים נמוך המהווה נקודת מפתח לטכניקות ניתוח תאים בודדים כגון ריצוף RNA של תא בודד.