Name: מארז גרפן של תאי יונקים קבועים כימית עבור מיקרוסקופאלקטרונים בשלב נוזלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: למדו שיטה לתיוג חלבוני ממברנה בתאי יונק ודימוי מיקרוסקופיה אלקטרונית בשלב נוזלי באמצעות גרפן. הטכניקה מאפשרת לחקור קולטנים על תאי סרטן בסביבה טבעית ללא ייבוש או חיתוך.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ל-D. B. Peckys על העזרה בפרוטוקול תרבות התא, פ. ויינברג על סקירת כתב היד, ט. טרמפרט לעזרה בניסויים ובדמויות, ס. סמולקה על העזרה עם הדמויות, ו-א. ארזט על תמיכתו באמצעות INM. מחקר זה ממומן על ידי אלסר קרונר-פרסניוס-שטיפטונג.

<ol><li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-field+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Far-field optical nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li>
<li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li>
<li>Williams, D. B., Carter, C. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilliams%2C+DB+%22The+Transmission+Electron+Microscope%22">The Transmission Electron Microscope</a>. , Springer. (2009).</li>
<li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBozzola%2C+JJ+%22Electron+Microscopy+Principles+and+Techniques+for+Biologists%22">Electron Microscopy Principles and Techniques for Biologists</a>. , Jones and Barlett Publishers. (1999).</li>
<li>Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+sample+preparation+and+imaging+by+cryo-electron+microscopy+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology.</a> Methods. 100, 3-15 (2016).</li>
<li>Lucic, V., Leis, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+of+cells%3A+connecting+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography of cells: connecting structure and function.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 185-196 (2008).</li>
<li>Carson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+technical+elements+of+freeze-fracture%2Ffreeze-etch+in+biological+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51694(2014).</li>
<li>Nishiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+scanning+electron+microscope+observes+cells+and+tissues+in+open+medium+through+silicon+nitride+film%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film.</a> Journal of Structural Biology. 169 (3), 438-449 (2010).</li>
<li>Dahmke, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+Liquid+Enclosure+for+Single-Molecule+Analysis+of+Membrane+Proteins+in+Whole+Cells+Using+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Graphene Liquid Enclosure for Single-Molecule Analysis of Membrane Proteins in Whole Cells Using Electron Microscopy.</a> ACS Nano. 11 (11), 11108-11117 (2017).</li>
<li>Maruyama, Y., Ebihara, T., Nishiyama, H., Suga, M., Sato, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno+EM-OM+correlative+microscopy+in+solution+by+atmospheric+scanning+electron+microscopy+%28ASEM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Immuno EM-OM correlative microscopy in solution by atmospheric scanning electron microscopy (ASEM).</a> Journal of Structural Biology. 180 (2), 259-270 (2012).</li>
<li>Kinoshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-electron+microscopy+of+primary+cell+cultures+from+genetically+modified+animals+in+liquid+by+atmospheric+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 469-483 (2014).</li>
<li>Hauwiller, M. R., Ondry, J. C., Alivisatos, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+graphene+liquid+cell+transmission+electron+microscopy+to+study+in+situ+nanocrystal+etching%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using graphene liquid cell transmission electron microscopy to study in situ nanocrystal etching.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57665(2018).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Graphene+and+Its+Derivatives+for+Liquid-Phase+Transmission+Electron+Microscopy+of+Radiation-Sensitive+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">The Use of Graphene and Its Derivatives for Liquid-Phase Transmission Electron Microscopy of Radiation-Sensitive Specimens.</a> Nano Letters. 17 (1), 414-420 (2017).</li>
<li>Meng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene-Based+Fibers%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Graphene-Based Fibers: A Review.</a> Advanced Materials. 27 (35), 5113-5131 (2015).</li>
<li>Sun, P. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limits+on+gas+impermeability+of+graphene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Limits on gas impermeability of graphene.</a> Nature. 579 (7798), 229-232 (2020).</li>
<li>Kato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-precision+thickness+control+of+ice+layer+on+CVD+grown+bilayer+graphene+for+cryo-TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Carbon%22%5BJournal%5D)">High-precision thickness control of ice layer on CVD grown bilayer graphene for cryo-TEM.</a> Carbon. 160, 107-112 (2020).</li>
<li>Keskin, S., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Radiation+Damage+in+Transmission+Electron+Microscopy+of+Proteins+in+Graphene+Liquid+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Reduced Radiation Damage in Transmission Electron Microscopy of Proteins in Graphene Liquid Cells.</a> Nano Letters. 18 (12), 7435-7440 (2018).</li>
<li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nature Methods. 2, 743-749 (2005).</li>
<li>Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+nitride+windows+for+electron+microscopy+of+whole+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells.</a> Journal of Microscopy. 243 (3), 273-283 (2011).</li>
<li>Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+variations+of+HER2+dimerization+in+breast+cancer+cells+discovered+by+correlative+fluorescence+and+liquid+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence and liquid electron microscopy.</a> Science Advances. 1 (6), 1500165(2015).</li>
<li>Eigenbrot, C., Ultsch, M., Dubnovitsky, A., Abrahmsen, L., Hard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+high-affinity+HER2+receptor+binding+by+an+engineered+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structural basis for high-affinity HER2 receptor binding by an engineered protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (34), 15039-15044 (2010).</li>
<li>Textor, M., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+Preparing+Graphene+Liquid+Cells+for+Transmission+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Strategies for Preparing Graphene Liquid Cells for Transmission Electron Microscopy.</a> Nano Letters. 18, 3313-3321 (2018).</li>
<li>Henjes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+EGFR+signaling+in+cell+line+models+of+ERBB2-amplified+breast+cancer+attenuates+response+towards+ERBB2-targeting+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">Strong EGFR signaling in cell line models of ERBB2-amplified breast cancer attenuates response towards ERBB2-targeting drugs.</a> Oncogenesis. 1, 16(2012).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+Stoichiometry+of+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+in+Intact+Cells+using+Correlative+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (103), e53186(2015).</li>
<li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+starvation%3A+caveat+emptor%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 301 (2), 272-279 (2011).</li>
<li>Kohl, H., Reimer, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKohl%2C+H+%22Transmission+electron+microscopy%3A+physics+of+image+formation%22">Transmission electron microscopy: physics of image formation</a>. , Springer. (2008).</li>
<li>Yi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+immunogold+labeling+of+cell+surface+proteins+and+viral+glycoproteins+for+cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Native immunogold labeling of cell surface proteins and viral glycoproteins for cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography applications.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (10), 780-792 (2015).</li>
<li>Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-scanning+transmission+electron+tomography+of+vitrified+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells.</a> Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).</li>
<li>Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Jerome, W. G., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+locations+of+gold-labeled+proteins+in+a+whole+mount+eukaryotic+cell+obtained+with+3+nm+precision+using+aberration-corrected+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3 nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 174, 552-562 (2011).</li>
<li>Meier, C., Beckmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze+fracture%3A+new+avenues+for+the+ultrastructural+analysis+of+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Freeze fracture: new avenues for the ultrastructural analysis of cells in vitro.</a> Histochemistry and Cell Biology. 149 (1), 3-13 (2018).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+scanning+transmission+electron+microscopy%3A+imaging+protein+complexes+in+their+native+environment+in+whole+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Liquid scanning transmission electron microscopy: imaging protein complexes in their native environment in whole eukaryotic cells.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 346-365 (2014).</li>
<li>Egerton, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+radiation+damage+in+the+TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Control of radiation damage in the TEM.</a> Ultramicroscopy. 127, 100-108 (2013).</li>
<li>Wojcik, M., Hauser, M., Li, W., Moon, S., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene-enabled+electron+microscopy+and+correlated+super-resolution+microscopy+of+wet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Graphene-enabled electron microscopy and correlated super-resolution microscopy of wet cells.</a> Nature Communications. 6, 7384(2015).</li>
<li>Huebinger, J., Spindler, J., Holl, K. J., Koos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+protein+mobility+and+associated+reshuffling+of+cytoplasm+during+chemical+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantification of protein mobility and associated reshuffling of cytoplasm during chemical fixation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 17756(2018).</li>
<li>Glauert, A. M., Lewis, P. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGlauert%2C+AM+%22Biological+specimen+preparation+for+transmission+electron+microscopy%22">Biological specimen preparation for transmission electron microscopy</a>. , Princeton University Press. (2014).</li>
<li>Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Cell+Electron+Microscopy+Using+Graphene+Veils%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Live Cell Electron Microscopy Using Graphene Veils.</a> Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).</li>
<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%2C+2+edn%22">Handbook of biological confocal microscopy, 2 edn</a>. , Springer. (1995).</li>
<li>Chung, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+control+of+EGF+receptor+activation+by+reversible+dimerization+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells.</a> Nature. 464 (7289), 783-787 (2010).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

כדי להבין טוב יותר את תפקוד החלבון, חשוב להשיג מידע על מיקומי חלבון בממברנה פלזמה של תאים שלמים. שיטות לקבלת מידע זה כוללות מיקרוסקופית פלואורסץ ברזולוציהסופר 1,2. למרות מיקרוסקופית סופר ברזולוציה התפתחה עוד יותר בשנים האחרונות, הרזולוציה שלה עדיין מוגבלת כ 20 nm עבור תנאים מעשיים של ניסויים בתא, בעוד חלבוני קולטן טיפוסי יש גדלים בטווח של 1-10 נמיר. הדמיה של חלבונים על תא יחיד ברמת מולקולה אחת עם רזולוציה מספקת כדי לדמיין חלבונים אפשרי עם EM. אבל בשל מקטע, שיטות EM קונבנציונליות בדרך כלל לא להשאיר אתהתא ללא פגע 26, מה שמוביל לאובדן מידע חשוב על ההקשר ואת ההפצה המרחבית של חלבונים קרום פלזמה. שיטות עבור תאים שלמים עם cryo-TEM פותחו6, זה אפשרי לשלב תיוג חלבון עם cryo-EM27, גםcryo-STEM הוכח28. עם זאת, זרימות עבודה cryo-EM ממוטבות לחקר ultrastructure התא ומבנה החלבון, ולא כל כך הרבה לניתוח הפצות מרחביות חלבון קרום. ייבוש נקודה קריטית היא עוד שיטת הכנה תא שלמה אבל הדגימות כפופות מספר שלבי ייבוש, ואת הטכניקה היא זמן רבמאוד 29. חלבוני קרום נבדקו גם באמצעות שבר הקפאה7. בשיטה זו, התאים קבועים, קפואים ושברים. החלקים השברו משוכפלים על ידי שכבות פחמן ופלטינה, והדגימה הביולוגית מוסרת. לאחר מכן ניתן לנתח את העותקים המשוכפלים באמצעות EM30. ניתוח תא שלם הוא בלתי אפשרי עם השבר הקפאה כי מידע על התפלגות חלבונים בממברנה בהקשר של התא כולו הולך לאיבוד.
השיטה המוצגת כאן מאפשרת את קרום התא להיחקר ללא צורך לחתוך דק את הדגימה9,31. התאים נשמרים ללא פגע כך ההתיקות של חלבוני קרום גלוי מתמונות פלואורסקצנציה, אשר מתואמים עם תמונות EM. לימוד חלבונים ברמת תא יחיד מולקולה אחת בתוך תאים שלמים במצב הידראולי הראו להיות אפשרי עם רזולוציה של 2 nm באמצעות STEM של QD מתויג חלבונים באמצעות שיטת מארז גרפןזה 9. שמירה על תאים במצבם הטבעי היא קריטית, כפי שהוא משמר את ההפצה המרחבית של חלבוני קרום כזה ניתוחים אפשריים ברמת תא יחיד מולקולה אחת, אשר חשוב להבנת פונקציות חלבון, ופיתוח תרופות חדשות עבור גישות טיפול.
היבט קריטי נוסף של הדמיית דגימות ביולוגיות עם EM הוא נזק הקרינה של הדגימות שנגרמו על ידי קרן האלקטרונים. הפתרונות כוללים לעתים קרובות את הפחתת מינון האלקטרונים ככל האפשר או שיטות ציפוי שונות, כגון אנקיפת הדגימה בין שכבות דקות שלפחמן 32. השיטה שלנו מראה שציפוי גרפן מפחית חפצים המושרה על ידי קרן שצצות על פני התא לדגימות שאינן מצופים. בדיקה של מבחינה כימית קבוע, ודגימות ביולוגיות מצופה גרפן אפשרי תחת קרן אלקטרונים קרינה ב 200 keV קרן אנרגיה עד D = (7.8±0.4) x 103 e-/ Å 2 ללא נזקלקרינה, כגון נקודות בהירות, להופיע על המדגם. בהשוואה לשיטות EM אחרות המערבות הכנת מדגם משוכלל, לדוגמה, הכתמה, הטבעה, (cryo-) מקטע, שבירה, וכו ', השיטה המתוארת כאן היא פחות זמן רב. תיוג החלבונים מתבצע תוך מספר שעות, וציפוי גרפן דורש רק כ-15 דקות לחוקרים מיומנים. הכנת המדגם דומה עם ההליכים הדרושים למיקרוסקופ פלואורסצטי.
ניתן לשנות את הפרוטוקול בשלבים מסוימים. הגרפן על השבב יכול גם להיות מיובש באוויר כדי לוודא כי גרפן לא זז כאשר נמחץ עם נייר מסנן. אם הגרפן מזוהם במלח, ניתן לתת לו לצוף על פני המים במשך כשעה כדי להמיס את המלח ובכך למזער את הזיהום. זיהום נחושת או PMMA המתרחשים בגרפן יכול להיות מופחת על ידי הרחבת שלבי החריט המתאימים בפרוטוקול. שיטות ציפוי גרפן אחרות תוארו שבו, לדוגמה, גרפן-PMMA הופקד ישירות על תאים, PMMA הוסר על ידי כביסה אצטון לאחרמכן 33. בשיטה שלנו, PMMA הוסר לפני ציפוי כדי למנוע כל נזק אפשרי לתאים שנגרמו על ידי שלבי כביסה אצטון נוספים. NaCl נבחר כמצע כאן כי הוא שטוח, כך שהוא לא לקמט את הגרפן, והוא מתמוסס במים כדי לשחרר את הגרפן9. חוץ מזה, זה יכול להיות חתוך לגודל הרצוי ולא שאריות הצוללת נשארות על גרפן. אבל אם לוקחים את הקריטריונים האלה בחשבון, מצעים אחרים כמו אשלגן כלורי יכול לשמש גם כן.
כדי להפחית את הסיכוי של קיבוץ באשכולות פוטנציאליים הנגרמת על-ידי תווית, ניתן ליישם את שלב קיבעון GA מיד לאחר קיבעון FA, שלאחריו כל חלבוני קרום משותקים. צעד קיבעון הראשון עם FA כבר מתקן את המבנה הביולוגי, אבל רמה מופחתת של דיפוזיה חלבון קרום עדייןעלולה להתרחש 34, אולי מוביל תווית המושרה אשכולות בשל הנוכחות של סטרפטאבידין מרובים לכל QD. קיבעון עם GA עלול להוביל לאות השפעה אוטומטית במהלך LM, ולכן, נעשה לאחר LM בפרוטוקול המתואר, אך ניתן להפחיתו כמתואר במקוםאחר 34. מאגר Cacodylate הוא רעיל למדי, קיבעון אחרים יכול לשמש גם כן, אבל cacodylate משמש כאן כפי שהוא חיץ נפוץ עבור פרוטוקולי EM, מונע משקעים, מונע את הצמיחה של חיידקים ופטריות, והוא תואם יוני סידן הדרושים כדי לשמר את שלמות ultrastructural של קרום שומנים35. במידת הצורך, tetroxide osmium יכול לשמש קיבעון נוסף לייצוב השימנים. זה יעזור לשפר את הניגודיות של מבנה התא, אבל גם להוסיף מתכת נוספת למערכת ולהפחית את הניגודיות שהושגה על QDs.
הפרוטוקול המתואר כאן מכיל שלבים רבים הדורשים הדרכה טובה. הכשרה מסוימת נדרשת לפני טיפול שבבים כדי למנוע גירוד פני השטח SiN של השבבים כדי למנוע שבירה. כפי שהוזכר קודם לכן, מומלץ להכין שבבים בכפילויות כמו חלון SiN יכול לשבור מפעם לפעם. השגת המספר הנדרש של תאים על שבב גם דורש קצת ניסיון. ציפוי התאים עם גרפן צריך קצת אימון כפי שזה יכול להיות קשה למצוא את זווית הטיה הימנית לצוף גרפן על המים. בעת תפיסת גרפן מהמים, זה גם יכול להיות קשה לראות את גרפן דק. ברגע הגרפן הוא על השבב, עודף מים צריך להיות מנופח עם נייר מסנן. זה צריך להיעשות רק עם קצה נייר מסנן כזה כדי למנוע את גרפן מהשבב.
ציפוי גרפן מנע מחפצים להופיע על הדגימה. אבל עבור D < 4 x 102 e-/Å2 גם לא צצו חפצים עבור הדגימה שאינה מצופה, וחפצים הופיעו עבור 2 דגימות שאינן מצופה בלבד. לכן, בדיקות של תאים שאינם מצופים גם נראה אפשרי, אם כי עדיף להשתמש גרפן ולהימנע מהסיכון של היווצרות חפץ. הרכב חפצים אלה ניתן לנתח בעתיד כדי לתת רמזים על איך למנוע את היווצרותם. לגבי היציבות המבנית של התאים נצפתה רק שיפור קל של ציפוי גרפן. התאים הקבועים התייצבו ככל הנראה באזורים הדקים שנבדקו, שם המבנה שלהם היה בסמיכות לממברנה SiN. מה שלא בדקנו כאן, עם זאת, היו ייבוש חפצים שידועים להתרחש עבור דגימות סלולריות כאשר נחשפו ואקום4. ייבוש התאים יוביל להתכווצות התאים כך שגם מרחקי ה-QD ישתנו כתוצאה מכך. עבור מינון האלקטרונים המשמש כאן, המרחק של QDs של דגימות מצופה גרפן ולא מצופה נשאר יציב. מחקרים נוספים נדרשים כדי לבחון את ההשפעה של ציפוי גרפן על התאים עבור EM.
מגבלה אחת של שיטה זו היא כי קיבעון כימי של התאים הוא הכרחי; לכן, לא ניתן לבצע ניסויים בתא חי. אבל במקרה התיוג אינו נחוץ ותאים עם יציבות מבנית גבוהה יותר משמשים, למשל חיידקים, אז תאים לא תוקנים יכול להיות מוקף גרפן עבור EM36 אם כי עם סובלנות מינון אלקטרונים שונה. כמו כן, החלבונים אינם ניתנים לזיהוי ישיר, כך QDs נדרשים כדי לדמיין את החלבונים. השיטה תרוויח מתוויות קטנות יותר. נקודת דיון היא אם זה טוב או רע כי ultrastructure אינו נראה בבירור. השיטה שלנו דומה לזו של מיקרוסקופ פלואורסטי שבו רק חלבונים נבחרים נראים37. הגדלת הנראות של מבנה האולטרה גם תוסיף מידע רב יותר לתמונה, ולאחר מכן בשלב מסוים תמנע זיהוי של מיקומי התוויות הבודדות. יתר על כן, השיטה המתוארת כאן היא עבור מין חלבון אחד, ותוספות של הפרוטוקול נדרשים להיות מסוגלים לתייג חלבונים מרובים. אחרון, השיטה פועלת כאשר מולקולה קטנה גבוהה מחייבת במיוחד כגון נוגדןפנטומימה 21 או nanobody38 זמין. נוגדנים נפוצים הם הרבה יותר גדולים וימנעו זיהוי של המצב הפונקציונלי של יחידות משנה חלבון לתוך אוליגומרים.
השיטה שלנו שימושית לחקר תפקוד חלבון על תאים שלמים באמצעות EM תוך שמירה על התאים במצב הידרציה. ניתן לבחון סדרה של תאים. סוג אחר של תאים וחלבונים ניתן ללמוד גם כן. אם אין צורך בתיוג חלבונים, ניתן להשתמש בתת-קבוצה של הפרוטוקול לציפוי גרפן של מגוון רחב של דגימות ביולוגיות. היכולת לחקור תאים שלמים רלוונטית במחקר תאי להבנת מתאם של תפקוד חלבון ממברנה ברמה המולקולרית.

ניתוח של תפקוד חלבון ממברנה חיוני למחקר ביולוגי של תאים, ולצורך פיתוח תרופות. מחלקה של ניסויים חשובים כרוכה בבדיקה של תנוחות חלבון קרום בתאים. מידע זה יכול לשמש כדי להסיק מסקנות על הרכבת חלבונים במתחמי חלבון ומיקומם הספציפי בממברנה פלזמה, אשר, באמצעות הרכבה דינמית ופירוק, מניע מגוון רחב של פונקציות תאיות. בין שאר הטכניקות, מיקרוסקופ אור (LM) ומיקרוסקופאלקטרונים (EM) משמשים לחקר פונקציות חלבון בתאים. LM מאפשר ניתוח של תאים שלמים בנוזל; עם זאת, ההחלטה מוגבלת 200-300 צפון לm עבור קונבנציונלי ועד 20 צפון לערך עבור מיקרוסקופ פלורסנט רזולוציה סופר בתנאיםמעשיים 1,,2. EM מספק בסביבות 1 Åרזולוציות 3, אבל הכנה מדגם קונבנציונלי דורש התייבשות, כתמי מתכת כדי לשפר את ניגודיות התמונה, הטבעה בחומר הרכבה, כגון שרף, עבור מיקרוסקופאלקטרונים שידור (TEM)4. כדי לשמר דגימות ביולוגיות בסביבה מקומית יותר, ניתן להשתמש בטכניקות cryo-EM5,6. הדגימות מוקפאות במהירות לתוך קרח אמורפי, ובמידת הצורך, נותחות. אפשרות נוספת היא הקפאת שבירה EM7.
EM טכניקות לחקר חלבוני קרום בתוך תאים שלמים במצבם היליד, נוזליהופיעו בעשור האחרון 8,,9,,10,,11. רזולוציה מרחבית של 2 ננומטר הושגה על נקודה קוונטית (QD) שכותרתה חלבוני קרום בתאים שלמים גדל על קרום SiN ומוקף בשכבה של גרפן9.
כאן, פרטים של פרוטוקול לסימון חלבון וציפוי גרפן9,12 מתוארים. מטרת פרוטוקול זה היא לנתח את ההתפלגות המרחבית של HER2 בממברנה של תאים שלמים, קבועים, תוך שמירה על התאים במצב הידרציה. ציפוי עם גרפן מונע ייבוש של התאים בריק, וגם מפחית נזקי קרינה13. שיטה זו מספקת מידע על חלבוני קרום מתויג בתוך קרום פלזמה שלם, אבל השיטה אינה שימושית לחקר ultrastructure התא כפי שנעשה בדרך כלל עם EM.
גרפן הוא הננו-חומר הדק ביותר הידוע, ומורכב מסדין גבישי עבה של אטום פחמן יחיד המסודר בסריג חלת דבש14. יש לו מאפיינים ייחודיים כולל גמישות גבוהה וכוח מכני. מחקרים אחרונים הראו כי גרפן ללא פגמים הוא בלתי חדיר לגזים ונוזלים, אבל פגמים מאפשרים חריץ מימן15. דליפה זו ניתן להפחית באמצעות גרפן רב שכבתי כפי שנעשה כאן. גרפן Bilayer לאחרונה הראה להיות שימושי כתמיכה עבור דגימות cryo-EM, שיפור ההומוגניות של שכבת הקרח דק לעומת תחמוצת גרפן שבו רק שכבות שאינן דו-מדם ניתןלגבש 16. גרפן גם הוצג כדי להפחית את נזקי קרן של דגימות ביולוגיות במהלך מיקרוסקופאלקטרוןשידור שלב נוזלי 13,17. כונס למופת, HER2 בא לידי ביטוי בקו תא סרטן השד היונק SKBR3 סומן עם QDs18 וההפצה המרחבית שלה נרשם באמצעות STEM. תאים נזרעו על שבב Si עם ממברנה SiN שקוף אלקטרונים19. השבבים נבחרו כתמיכה כפי שהם חזקים, תואם LM ו EM, ואת כל הליך התיוג ניתן לבצע ישירות על שבב19. לאחר קובץ מצורף לתא, HER2 סומן עם פרוטוקול תיוג דו-שלים20. ראשית, תרכובת נוגדן נגד HER2 ביוטינילציה21 היה מחובר HER2. התאים תוקנו אז מבחינה כימית כדי למנוע קיבוץ קולטן המושרה על ידי תווית, ולהגביר את היציבות של ultrastructure התא. QDs מצופה סטרפטוודין היו קשורים לאחר מכן לתסביך פנטון HER2. אות הפלואורסץ הבהיר והליבה הצפופה באלקטרונים של ה-QD אפשרו מיקרוסקופית קורלציה ואלקטרונים (CLEM)20. CLEM שימושי במיוחד מכיוון שניתן לבחור אזורים סלולריים בעלי עניין בניתוח STEM מתוך תמונות המיקרוסקופיות של הפלואורסקציה המבטחת את ההתמקה יתורליזציה של HER2 בתאים. תאים נותחו על ידי מיקרוסקופ פלואורסץ כדי לזהות אזורים תאיים עם רמות HER2 גבוהות. לאחר מכן, 3-5 שכבה עבה גיליון של גרפן הועבר על התאיםלציפוי 9,22. לאחר מכן, הדגימה הורכבה במחזיק דגימה EM. נתוני STEM נרכשו באמצעות גלאי השדה האפל (ADF) טבעתי, מתן מידע על ההפצה המרחבית של HER2 על פני השטח של התא יחסית למיקום פני השטח של התא, אך לא מספק מידע על מבנה האולטרה של התא. כדי לקבוע את יציבות הדגימה תחת קרני קרן אלקטרונים, הדגימות נבדקו במינון הולך וגדל(D)בסדרת תמונות. ההבדל בין דגימות מצופה גרפן לדגימות לא מצופה נחקר. מספר סוגים של נזקי קרינה הוערכו.
הפרוטוקול המתואר כאן משתמש HER2 overexpressing קו תא סרטן השד יונק SKBR3 כמערכת מודל עבור מיקוד HER223. הפרוטוקול כולל הכנת דגימה אחת מצופה גרפן, ודגימה אחת דומה אך ללא ציפוי גרפן להשוואה. הניסוי מוכן בכפילות מאז חלון SiN עשוי לשבור מדי פעם, ולקבל עותק ניסיוני ברוב המקרים. התשואה הכוללת של השיטה היא משמעות גבוהה כי שבבים עם תאים מכוסים גרפן מתקבלים בדרך כלל עם שגיאה יוצאת דופן למרות לא כל חלון SiN עשוי להיות מכוסה גרפן בכל המקרים. כפילויות אינן מתוארות בפרוטוקול.
פרוטוקול תיוג (שלבים 1-5) דומה לפרוטוקול של תיוג קולטן גורם גדילה אפידרמי בתאי פיברובלסט COS7 שפורסמו בעבר24; פרטים בנייר זה מופנים לגבי הטיפול בשבים, והשימוש של צלחות באר. הפרוטוקול הבא ממוטב לסימון HER2, ציפוי גרפן9, ובדיקת עמידות הקרינה של המדגם.

<table><tbody><tr><td>אצטון ל-HPLC (מינימום 99.8%)</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, רנינגן, גרמניה</td><td>2626-1L</td><td></td></tr><tr><td>AL54 איזון אנליטי</td><td>Mettler-Toledo GmbH, Giessen, גרמניה</td><td>30029077</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Fraction V, ללא ביוטין, &ge; 98%, לביולוגיה מולקולרית</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, קרלסרוהה, גרמניה</td><td>0163.2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HER2 Affibody Molecule, ביוטין מצומד 20 ומיקרו; M</td><td>Affibody, Solna, שוודיה</td><td>10.0817.02.0001</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אנליטי ברזולוציה אטומית JEM-ARM200F</td><td>JEOL (גרמניה) GmbH, פרייזינג, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, דרמשטדט, גרמניה</td><td>B6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>חומצה קקודילית נתרן מלח טריהידראט &ge; 98</td>% <td>Carl Roth GmbH + Co KG, קרלסרוהה, גרמניה</td><td>5169.1</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית תאים, PS, מטופלות, סטריליות, מכסה בורג מסנן 50 מ"ל</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, גרמניה</td><td>7696781</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית תאים, PS, מטופלות, סטריליות, מכסה בורג מסנן 250 מ"ל</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, גרמניה</td><td>7696782</td><td></td></tr><tr><td>צלחות Multiwell תרבית תאים, מטופלות, 24 בארות</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, גרמניה</td><td>7696792</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית תאים Multiwell, מטופלות, 96 בארות</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, רנינגן, גרמניה</td><td>7696794</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית תאים של CELLSTAR מטופלות TC, 250 מ"ל</td><td>Greiner Bio-One GmbH, פריקנהאוזן, גרמניה</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plates 96-well</td><td>Greiner Bio-One GmbH, פריקנהאוזן, גרמניה</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה CELLSTAR 15 מ"ל סטריליים</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, גרמניה</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים CELLview, PS, 35/10 מ"מ, תחתית זכוכית, תא אחד</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, גרמניה</td><td>627861</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5418</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td><td>5401000010</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל סטרילי</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, גרמניה</td><td>7696705</td><td></td></tr><tr><td>Corning CellStripper תמיסת דיסוציאציה של תאים לא אנזימטיים</td><td>קורנינג, ניו יורק, ארה"ב</td><td>25-056-CI</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Saccharose min. 99,7%, אבקת</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, רנינגן, גרמניה</td><td>9286.1</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר חד פעמי C-Chip Neubauer משופר</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, קרלסרוהה, גרמניה</td><td>PK36.1</td><td></td></tr><tr><td>Easypet</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, גרמניה</td><td></td><td></td>4430000018</tr><tr><td>מחקר אפנדורף בתוספת פיפטות משתנה, 0.1 - 2.5 ומיקרו; l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, גרמניה</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research בתוספת משתנה פיפטה, 2 -20 ומיקרו; l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, גרמניה</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research בתוספת משתנה פיפטה, 10 - 100 ומיקרו; l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, גרמניה</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research בתוספת משתנה פיפטה, 100 - 1000 ומיקרו; l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, גרמניה</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט עבור HPLC (מינימום 99.9%)</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, גרמניה</td><td>2222-1L</td><td></td></tr><tr><td>חלבון מהונדס דמוי פיברונקטין *poly mer-plus</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, גרמניה</td><td>F8141</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי Leica DMI6000</td><td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), גלוקוז גבוה, תוסף GlutaMAX, פירובט</td><td>FisherScientific, המפטון, NH, ארה"ב</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Gibco סרום עגל עוברי (FCS)</td><td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td><td>10099141</td><td>מספר פריט: 1751893</td></tr><tr><td>Gibco Goat Serum, מוצא ניו זילנד</td><td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td><td>16210064</td><td>מספר פריט: 1788320</td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת Gibco פוספט (PBS), pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific, וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>גלקסי 48R CO2 חממת</td><td>ניו ברונסוויק, אפנדורף, וסלינג-ברצדורף, גרמניה</td><td>CO48310001</td><td></td></tr><tr><td>Gatan דגם 950 Solarus&mdash; מנקה פלזמה</td><td>Gatan GmbH, M&uuml; nchen, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת גלוטרלדהיד דרגה I, 25% ב-H2O, מטוהרת במיוחד לשימוש כמקבע מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, גרמניה</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Glycine &ge; 98.5% Ph.Eur., USP, BP</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, קרלסרוהה, גרמניה</td><td>T873.1</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ מעבדה הפוך Leica DM IL LED</td><td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, גרמניה</td><td>DM IL LED</td><td></td></tr><tr><td>פלטה חמה</td><td>Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, שוואבאך, גרמניה</td><td>MR 3002</td><td></td></tr><tr><td>MEM חומצות אמינו לא חיוניות (NEAAs) 100x W/O L-Glutamine</td><td>Biowest, Nuaill&eacute;, צרפת</td><td>X0557-100</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית מיקרוסקופ 76 מ"מ x 26 מ"מ</td><td>DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/צינורות מיקרו ראשיים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(1.5 מ"ל, 2 מ"ל) לא סטריליים</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, גרמניה</td><td>1.5 מ"ל: 7696751, 2 מ"ל: 7696752</td><td></td></tr><tr><td>MSc-Advantage&mdash; ארון בטיחות ביולוגי Class II</td><td>ThermoFisher Scientific, וולת'אם, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שבבי אוקיינוס חלון SiN 400x150 ומיקרו; m, מרווח 200 ננומטר</td><td>DENSsolutions, דלפט</td><td></td><td></td>, הולנד</tr><tr><td>מזרק אומניפיקס חד פעמי Luer Lock Solo (10 מ"ל, 20 מ"ל, 50 מ"ל)</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, גרמניה</td><td>10 מ"ל: C542.1 20 מ"ל: T550.1</td><td>נרכש באמצעות Carl Roth GmbH&Co. KG, Karlsruhe</td></tr><tr><td>Oven</td><td>Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, גרמניה</td><td>VO 200</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR, דרמשטדט, גרמניה</td> <td>#291-0057</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה Paraformaldehyde 16%,</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית בדרגת EM, Hatfield, PA, ארה"ב</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Perfekt-Kescher עם ידית</td><td>Plano GmbH, Wetzlar, גרמניה</td><td>T5112</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה עם מחסום אירוסול במתלים, Labsolute לא סטרילי</td><td>, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, גרמניה</td><td>2-200&micro; l: 7695892</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה עם מחסום אירוסול במתלים,</td><td>Labsolute סטרילי, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, גרמניה</td><td>0.1-10 ומיקרו; l: 7695880 2-100 ומיקרו; l: 7695883 100-1000 ומיקרו; l: 7695886 1250 ומיקרו; l XL: 7695887</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין 0.01% תמיסת mol. WT.70.000 - 150.000</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, רנינגן, גרמניה</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 655 Streptavidin Conjugate 1 & micro; M</td><td>Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ארה"</td>ב <td>סכין</td> גילוח Q10121MP<td></td></tr><tr><td>, Gem לא מצופה 3 פאות, גב פלדה, פרסונה נטולת שומנים</td><td>, להבי AccuTec, ורונה, וירג'יניה, ארה"ב</td><td>94-0451</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון עגול, ללא אפר, סרט כחול דרגה 589/3, קוטר. 150 מ"מ</td><td>Schleicher & Schuell, Dassel, גרמניה</td><td>300212</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו שגרתי Leica M60</td><td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, גרמניה</td><td>M60</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות ROTILABO סרולוגיות, סטריליות (1 מ"ל, 2 מ"ל, 10 מ"ל)</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, גרמניה</td><td>1 מ"ל: N231.1 2 מ"ל: N236.1 10 מ"ל: ET30.1</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות, סטריליות, (1 מ"ל, 2 מ"ל, 10 מ"ל)</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, גרמניה</td><td>1 מ"ל: 7695550 2 מ"ל: 7695551 10 מ"ל: 7695553</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות, סטריליות, (5 מ"ל, 25 מ"ל, 50 מ"ל)</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, גרמניה</td><td>5 מ"ל: 7695552 25 מ"ל: 7695554 50 מ"ל: 7695555</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים רועדים SW22</td><td>Julabo GmbH, Seelbach, גרמניה</td><td>9550322</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, קרלסרוהה, גרמניה</td><td>HN00.1</td><td></td></tr><tr><td>גבישי נתרן כלורי, שסועים 12 מ"מ x 12 מ"מ x 0.5-1 מ"מ</td><td>מעבדות קריסטל בינלאומיות, גארפילד, ניו ג'רזי, ארה"ב</td><td>9750</td><td></td></tr><tr><td>נתרן טטרבוראט דקהידרט, מגיב ACS, &ge; 99.5</td>% <td>Sigma-Aldrich, Merck, דרמשטדט, גרמניה</td><td>S9640-500G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פרסולפט</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, קרלסרוהה, גרמניה</td><td>4365.2</td><td></td></tr><tr><td>מסנני מזרק ROTILABO PES, סטרילי 0.22 ומיקרו; m</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, קרלסרוהה, גרמניה</td><td>P668.1</td><td></td></tr><tr><td>טריוויאלי העברה גרפן 3-5 שכבות, 1 ס"מ x 1 ס"מ</td><td>חומר ACS, פסדינה, קליפורניה, ארה"ב</td><td>TTG30011</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה Dumoxel 03</td><td>מייצרת D' Outils Dumont SA, מונטינייז, שוויץ</td><td>0103-7-PO</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה Inox 02</td><td>מייצרת D' Outils Dumont SA, מונטינייז, שוויץ</td><td>0102-7-PO</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה, קצה פלסטיק להחלפה</td><td>Ideal-tek SA, Balerna, שוויץ</td><td>5SVR.SA</td><td></td></tr><tr><td>מים ROTISOLV HPLC דרגת שיפוע</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, קרלסרוהה, גרמניה</td><td>A511.2</td><td></td></tr></tbody></table>

מארז גרפן של תאי יונקים קבועים כימית עבור מיקרוסקופאלקטרונים בשלב נוזלי

Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy

פרוטוקול מתואר לחקירת קולטן גורם גדילה אפידרמיס אנושי 2 (HER2) בממברנה פלזמה שלמה של תאים סרטניים השד באמצעות מיקרוסקופאלקטרונים שידור סריקה (STEM). תאים של קו תא סרטן השד יונק SKBR3 גדלו על שבבי סיליקון עם סיליקון nitride (SiN) חלונות. התאים תוקנו כימית, וחולי HER2 סומנו עם חלקיקי נקודה קוונטית (QDs), באמצעות פרוטוקול מחייב ביוטין-סטרפטאבידין דו-שלבי. התאים היו מצופים גרפן רב שכבתי כדי לשמור על מצב הידרציה, ולהגן עליהם מפני נזק קרן אלקטרונים במהלך STEM. כדי לבחון את היציבות של הדגימות תחת קרני קרן אלקטרונים, בוצע ניסוי סדרת מינונים. דגימות מצופה גרפן ולא מצופה הושוו. נזק שנגרם קרן, בצורה של חפצים בהירים, הופיע עבור כמה דגימות לא מצופה במינון אלקטרונים מוגבר D, בעוד שום חפצים הופיעו על דגימות מצופה.

איור 1א מראה תאים שנזרעו באופן כזה שהחלון מכוסה אך עם מספיק מקום כדי לאפשר להם לשטח ולדבוק, מה שמוביל להתאגידות של כ-2/3rd (איור 1B). במקרה תאים רבים מדי נזרעים על שבב(איור 1C),אין מספיק מקום עבור כל התאים לדבוק שבב. איור 1D מציג את אותו שבב לאחר 24 שעות. יותר ממחצית התאים לא השתטחו. מצד שני, אם מעט מדי תאים נזרעים(איור 1E),חלון SiN יהיה בסופו של דבר עם שטח ריק גדול לאחר 24 שעות כפי שניתן לראות איור 1F. איור 1G מציג את תמונת ה- DIC של התאים בא איור 1A ואיור 1B. איור 1H מציג את תמונת הפלואורסץ המתאימה בצבע כוזב בצהוב המציין תיוג מוצלח של HER2.
נתוני STEM מייצגים מוצגים באיון 4. תאי SKBR3 מצופים גרפן (עמודה שמאלית) ותאי SKBR3 שאינם מצופים (עמודה ימנית). איור 4א,B הצג M = תמונות מבט כולל של 800x של התאים בחלון. האזורים המוצגים כמו insets נתו ב M = 80,000x במהלך סדרת המינון, ראה איור 4C,D. ה-QDs נראים כנקודות בהירות כאן. איור 4E ואיור 4F מציגים M = 50,000 תמונות מוגדלות שנרכשו במיקומים של מלבנים באיור 4C,D. שתי התמונות נרשמו לאחר רכישת סדרת מינונים עם D = (7.8 ± 0.4) x 103 e-/Å2. סדרת המינונים הוקלטה ב- M = 80,000x. ניתן לזהות את האזורים החשופים כמלבנים, לפיהם המלבן היה גלוי בבירור עבור המדגם שאינו מצופה(איור 4F).
כדי לאמת את הנוכחות של גרפן, דפוסי iffraction של אזורים ללא תאים, אבל עם או בלי גרפן על חלון SiN נרכשו. המבנה המשושה של הגרפן נצפה בתבנית ההתפלה של המדגם מצופה גרפן(איור 4G),בזמן שהוא נעדר עבור המדגם שאינומצופה (איור 4H). דפוס ההתפלה של גרפן גביש יחיד יהיה סימטריה פי שישה בשל מבנה משושה מסודר מאוד של גרפן. אז, המבנה המשושה מצביע על נוכחות גרפן על הדגימות.
כדי לחקור את ההשפעה של תאורת קרן אלקטרונים על המדגם, תמונות STEM נרכשו בסדרת תמונות עם מינון אלקטרונים מצטבר. תוצאות מייצגות עבור דגימות שאינן מצופים וגרפן מוצגות באיור 5A-D וב- איור 5E-G, בהתאמה. כל הנתונים נרכשו בקצה התא, שבו התא הוא השטוח ביותר, והמבנה שנצפה הוא לפיכך הקרוב ביותר לממברנה SiN. החשיפה של דגימות שאינן מצופים הובילה למבנים בהירים המופיעים על משטחי התא ב- D = (1.9 ± 0.1) x 103 e-/Å2 (איור 5B). מבנים אלה הפכו גדולים יותר עם מינונים גבוהים יותר, כך שהם היו גלויים בבירור בתמונה האחרונה של הסדרה ב D = (7.8 ± 0.4) x 103 e-/ Å2 (איור 5C, D). נקודות אלה לא הופיעו באף אחת מהדגימות מצופה גרפן(איור 5E-G).
שבבים נוספים הוכנו ונבדקו באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל. בסך הכל נחקרו שש דגימות מצופים ושבע דגימות לא מצופים. שתיים מתוך שבע דגימות לא מצופה הראו את החפצים האלה. אף אחת מהדגימות המצופה לא הראתה נקודות בהירות נוספות.
כמדד נוסף של נזקי קרינה, המרחק בין QDs נבדק. אם נגרם נזק מבני, אפשר היה לצפות שמרחקים בין QDs ישתנו. שינויים במרחקים נמדדו עבור זוגות שונים של QDs עם צבירת D עבור טווח של מרחקים זוג. איור 5H מראה כי השינוי היחסי של החלקיקים עבור דגימות שאינן מצופים נשאר מתחת 1.3% בממוצע, בעוד המרחק היחסי הממוצע נשאר מתחת 0.8% עבור הדגימות מצופה. אפשר, לכן, להסיק כי ציפוי גרפן ייצב את המדגם אבל דגימות מיובשות ללא ציפוי גרפן היה גם יציב להפליא.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig01.jpg"> איור 1: זריעת תאים על חלון SiN של שבב סיליקון ו- HER2 מסומן. (A) תמונה למופת של אזור חלון SiN עם תאי SKBR3 5 דקות לאחר זריעת שבב. (ב)אותם תאים התפשטו על אותו חלון SiN לאחר 24 שעות (C)תאי SKBR3 על שבב Si 5 דקות לאחר זריעה. (D)אותם תאים כמו ב- (C) לאחר 24 שעות. התאים לא לשטח כראוי כמו שהיו יותר מדי תאים על השבבים על זריעה. (ה)תאים על שבב 5 דקות לאחר זריעה. (F)רק תאים מעטים נראו על החלון כי מעט מדי תאים נזרעו על השבב. (G) תמונת DIC של אותם תאי SKBR3 לאחר תיוג QD של HER2. (H) שכבת-על של תמונת DIC ותדמית פלואורסקצנה מתאימה של תאי SKBR3 עם תאי SKBR3 עם HER2-QD655 (בצבע כוזב בצהוב). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig02.jpg"> איור 2: ניקוי והעברה של גרפן על גבישי NaCl. (A) PMMA-גרפן על פולימר שקוע במים טהורים כדי לשחרר גרפן PMMA. PMMA-גרפן יכול להיתפס עם מגלשת זכוכית. (ב)זיהום על בסיס נחושת נחרטו באמצעות תמיסת נתרן שכנוע. כדי לנקות את הגרפן, הוא הועבר לבקת המכילה מים שהם מנוקים. שלבים אלה חזרו על עצמם 3 פעמים. ה-PMMA-גרפן הועבר לאחר מכן לתמיסה רוויה של NaCl במים טהורים. גביש NaCl שימש כדי לאסוף את הגרפן מתמיסת המלח. (ג)PMMA-גרפן על גביש NaCl היה מיובש במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. PMMA הוסר על ידי דגירה בלוק באצטון במשך 30 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig02large.jpg" target="_blank">דקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig3v2.jpg"> איור 3: ציפוי גרפן של תאים שנזרעו על שבב Si. (א)הליך של ציפוי גרפן. גרפן על גבישי NaCl משתחרר על פני המים. פיסת גרפן לאחר מכן נתפס עם לולאת מתכת ומועבר על שבב Si. (ב)שבב (2.0 x 2.6 מ"מ) עם חלון SiN של ממדים 400 x 160 μm ללא גרפן. תאי SKBR3 נראו ככתמים כהים. גרפן(עיגול אדום) צף על פני השטח של גם עם מים. גרפןנתפס עם לולאת מתכת. (ה)השבב המחובר לטיפות המים כך הגרפן היה על גבי חלון SiN. שבבFזעיר לאחר ציפוי גרפן. הגרפן היה נראה כנצנוץ סגול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig3v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig04v2.jpg"> איור 4: גזע של תאי SKBR3 מצופים גרפן ולא מצופה בחלון SiN. (A)תמונת STEM של מדגם מצופה גרפן שנרכשה ב- M = 800x. (B) תמונת STEM של מדגם לא מצופה שנרכשה ב- M = 800x. (C) M = תמונה של 80,000x שנרשמה במיקום המלבן הכחול בשורות צהובות A. מייצגת מרחקים דוגמאות הנמדדים בתוך חלקיק. (D) M = תמונה של 80,000x שתועדה במיקום המלבן הכחול ב- B. קו צהוב מייצג דוגמאות למרחקים הנמדדים בתוך חלקיקים. (E) M = תמונה של 50,000x באותו אזור שבו C נחשף ל- D = (7.8±0.4) x 103 e-/Å2. (F) M = תמונה של 50,000x באותו אזור כמו D ונחשפה ל- D = (7.8±0.4) x 103 e-/Å2. האזור החשוף נראה בבירור. (ז)תבנית מפזר של דגימה מצופה גרפן מאיזור ללא תאים. הסימטריה פי שישה של הגרפן נראית כנקודות בהירות. (H)תבנית מפזר של מדגם ללא גרפן מראה אין כתמים בהירים פי 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig05.jpg"> איור 5: חפצים הנובעים מדגימות ללא ציפוי גרפן. (א)תמונות ראשוניות של אזורים בדגימות ללא ציפוי גרפן שנרכשו ב- M = 80,000x, ונחשפו ל- D = (0.39 ± 0.02) x 102 e-/Å2. (ב)תמונות עם החפצים הראשונים הנובעים D = (1.94 ± 0.1) x 103 e-/Å2 (חצים צהובים). (ג, ד) מה אתה עושה? התמונה האחרונה של הסדרה שנרכשה עם D = (7.8 ± 0.4) x 103 e-/Å2. חפצים נראו כנקודות בהירות. אנילא יודע מה לעשות. דגימות מצופה גרפן ללא חפצים הנובעים. (E) D = (0.39 ± 0.02) x 10e -/Å2 (F) D = (1.94 ± 0.1) x 103 e-/Å2 (G) D = (7.8 ± 0.4) x 103 e-/Å2. (H)שינוי יחסי במרחקי חלקיקים עבור דגימות מצופה גרפן ולא מצופה. שתיים מהדגימות שאינן מצופים המציגות פריטים, אחד מהם מוצג ב- (A-C) והתמונה האחרונה של הדגימה השנייה ב- D, כמו גם שלוש דגימות מצופה נותחו (אחת מוצגת ב- E-G). בסך הכל נבחנו עשרה זוגות QD לכל מדגם עם מרחקים הנעים בין 250 טנ"מ ל-3 μm. השינוי היחסי משקף את הממוצע של כל המדידות בקבוצה אחת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
טבלה משלימה 1: מתכונים לפתרונות ומאגרים. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61458/Preparation_of_Solutions.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

מוצג כאן פרוטוקול לתיוג חלבוני קרום בתאים יונקים וציפוי המדגם עם גרפן למיקרוסקופ אלקטרונים שידור סריקה שלב נוזלי. היציבות של הדגימות נגד הנזק שנגרם על ידי קרינה יכול גם נחקר עם פרוטוקול זה.

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using ...

שיטה זו שומרת דגימות ביולוגיות בסביבה מקומית ומפחיתה את החפץ המושרה על ידי קרן אלקטרונים. היתרון העיקרי הוא כי טכניקה זו ישימה לתאים שלמים. אז תאים לא צריכים להיות מיובשים, מוכתמים, או חתוכו לפני מיקרוסקופ אלקטרונים.היכולת דימוי קולטנים על תאים סרטניים בהקשר של קרום פלזמה שלם כולו הוא היבט מרכזי שיכול להוביל גישות טיפול חדשות ופיתוח של תרופות נגד סרטן חדש. אני אדגים את העבודה עם תאים, ציפוי גרפן ומיקרוסקופיה, וסרקן קסקין יראה איך להכין את גרפן. כדי להתחיל, להוסיף 100 microliters של השעיית התא לשתי בארות של צלחת 96 גם המכיל שבבים מצופים PLL ו FLP עם קרום סיליקון ניטרייד מול למעלה ו 50 microliters של מדיום ללא סרום.דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך חמש דקות כדי לאפשר לתאים לצרף שבב. בדוק את צפיפות התאים על השבב עם מיקרוסקופ הפוך וודא כי התאים מכסים את החלון עם מספיק מקום כדי לשטח ולדבוק. כדי לתייג את HER2 בתאים, מקם את השבבים לתוך בארות השורה הראשונה של לוחית התיוג.לאחר מכן, לשטוף את השבבים עם PBS BSA. כדי למנוע כריכה לא ספציפית של מימטי הנוגדן, הדגירה שבבים עם PBS BSA GS במשך חמש דקות. ואז עם 200 מימטי נוגדן ננומולרי במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.כדי להסיר את גרפן PMMA מן הפולימר, פיפטה כמה טיפות מים על הפולימר סביב גרפן PMMA. לאחר מכן, לטבול אותו במים עם זווית של 30 עד 45 מעלות כדי לשחרר את גרפן PMMA. כדי לחרוט מזהמים מבוססי נחושת, prepair פתרון 50 מיליליטר של 0.42 נתרן טוחן לשכנע במים.השתמש בשקופית זכוכית סטנדרטית כדי להעביר גרפן PMMA לתוך פתרון שכנוע נתרן עם צד גרפן למטה. גרפן PMMA יצוף לראש הפתרון. תשאיר את זה שם למשך הלילה.למחרת, להעביר את גרפן PMMA מתסמת שכנוע נתרן למים נקיים. תן לו לצוף במים במשך חצי שעה. חזור על לשטוף בסך הכל שלוש פעמים כדי להסיר את כל שאריות נתרן שכנוע מן גרפן PMMA.לאחר מכן, להעביר את גרפן PMMA על גבייש נתרן כלורי. מכינים פתרון רווי של נתרן כלורי במים בצלחת פטרי ומעבירים את גרפן PMMA על גבי הפתרון עם צד גרפן למטה. החזיקו את גביש הנתרן כלורי עם פינצטה וקפו את גרפן PMMA הצף.לאחר מכן, החזק אותו אנכית במשך שתי דקות כדי לאפשר למים עודפים לזרום החוצה. תן לו להתייבש לטמפרטורת החדר במשך 30 דקות ואופים אותו בתנור ב 100 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. הסר לחלוטין את המים.מחממים אצטון בצלחת פטרי מזכוכית לכ-50 מעלות צלזיוס על צלחת חמה במכסה המנוע. צפה בטמפרטורה בזהירות כדי למנוע אש. טובל את גרפן PMMA על מלח לתוך צלחת פטרי מלא אצטון ולהשאיר אותו כדי להמיס את PMMA במשך 30 דקות.תן גרפן על מלח אוויר יבש ביסודיות לפני השימוש בו להכנת מדגם. לשטוף שבב מוכן ומסויג במים טהורים כדי להסיר את כל שאריות המלח מהחוצץ ולה מניח אותו על נייר מסנן. התאים צריכים להיות גלויים כנקודות כהות.השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את גרפן רב שכבתי על גביש נתרן כלורי לתוך חתיכה שמתאימה חלון ניטרד סיליקון של שבב זעיר. הסר את גרפן מקריסטל נתרן כלורי על ידי טבילתו בתוך מקור מים, הטיית הגביש בזווית של 45 מעלות ביחס לפני השטח. לתפוס את גרפן עם לולאת מתכת מפני השטח של המים, ואז לגעת את פני השטח העליונים של השבב עם משטח הלולאה התחתונה, גורם שבב להידבק לולאת המתכת.גרפן ניתן לראות על גבי השבב. תחת סטריאומיקרוסקופ, השתמש בנייר סינון כדי להסיר את המים הנותרים מהשבב כך שהגרפן יכסה את כל התאים בחלון ניטרד הסיליקון. מניחים את השבב על נייר סינון עם פינצטה.גרפן נראה כמו נצנוץ סגול על השבב. מעבירים את השבב מהנייר לצלחת פטרי תא. פיפטה טיפת מים לתוך אחד התאים החופשיים ולסגור את המכסה כדי לספק אווירה רוויה במים.לאחר מכן, לאטום את צלחת התא עם סרט פרפין ולאחסן אותו במקרר בארבע מעלות צלזיוס. הגדר את ה-STEM לאנרגיית קרן של 200 קילו-וולט באמצעות דגימת יישור לגודל בדיקה של לפחות 0.2 ננומטר על-ידי התאמת עדשות הדחוס. הגדר זרם בדיקה של 180 Picoampere ו התכנסות קרן חצי זווית של 13.2 מילירדיאנים על ידי החדרת צמצם.הגדר את גלאי ADF STEM פתיחת טווח חצי זווית ל 68 עד 280 מילירדיאנים על ידי התאמת הגדרות עדשת המקרן. לאחר מכן, הגדר את גודל תמונת STEM ל- 2048 על-ידי 2048 פיקסלים ואת זמן השתהות הפיקסלים לשישה מיקרו-שניות. לטעון את השבב עם תאים מצופים גרפן במחזיק דגימה סטנדרטי עבור tem באופן כזה התאים פונים כלפי מעלה לטעון את המחזיק לתוך מיקרוסקופ אלקטרונים.רכישת תמונת מבט כולל בהגדלה של 800 X. לאחר מכן, לזהות אזור של עניין ותמונה של חלקיקי נקודה קוונטית ב 80, 000 X עם גודל פיקסל של 1.3 ננומטר. תאים זרע אופטימלי מוצגים כאן.החלון מכוסה, אבל יש מספיק מקום כדי לאפשר להם לשטח ולדבוק. כאשר יותר מדי תאים נזרעו על שבב זעיר, לא היה מספיק מקום לכל התאים לדבוק. אחרי 24 שעות, יותר ממחצית התאים לא השתטחו.אם מעט מדי תאים נזרעים, חלון ניטרד הסיליקון יהיה בסופו של דבר עם שטח ריק גדול לאחר 24 שעות. תמונות DIC ו פלואורסצנטיות של תאים זרע אופטימלי מוצגים כאן, הוכחת תיוג מוצלח של HER2. STEM בוצע על תאי SKBR3 מצופים גרפן ולא מצופים.ההגדלות של 800 X דימויו ב- 80, 000 X.The חלקיקי נקודה קוונטית גלויים כנקודות בהירות בהגדלה של 50, 000 X. כדי לחקור את ההשפעה של תאורת קרן אלקטרונים על המדגם, תמונות STEM נרכשו בסדרת תמונות עם מינון אלקטרונים מצטבר. תוצאות מייצגות עבור דגימות לא מצופות מצופות גרפן מוצגות כאן.החשיפה של דגימות שאינן מצופות הובילה למבנים בהירים המופיעים על משטחי התא, אשר לא התרחשו עם אף אחת מהדגימות מצופות גרפן. שינוי המרחק היחסי הממוצע של זוגות חלקיקים נשאר מתחת ל-1.3% עבור דגימות לא מצופות ומתחת ל-0.8% עבור הדגימות המציפות. בעקבות הליך זה, סוגים שונים של חלבוני קרום ניתן לדמיין על תאים שלמים באמצעות שיטות מיקרוסקופיות אחרות.טכניקה זו מאפשרת תמונה חלבונים קרום פלזמה שלם כדי לקבל מידע נוסף על הארגון של קרום הפלזמה ואת האינטראקציה בין חלבונים.

graphene-enclosure-chemically-fixed-mammalian-cells-for-liquid-phase

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

גרפן נוזל התא מיקרוסקופ ניתן להתבונן nanocrystal dynamics בסביבה נוזלית עם רזולוציה מרחבית גדולה יותר מאשר טכניקות אחרות של מיקרוסקופ אלקטרונים תא נוזלי. תחריט premade nanocrystals ובעקבות צורתם באמצעות גראפן נוזלי תאים במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים יכולות להניב מידע מכניסטית חשוב על ננו-חלקיק המרות.

שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים של גראפן נוזל התא ללמוד בחיי עיר Nanocrystal תחריט

פרוטוקול להכנת בתאי הנוזלי של המיקרוגל הנתמכים על ידי מיקרוסקופיה אלקטרון באתרו של מיקרוסקופ של זהב nanocrystals מ-haucl4 הפתרון הקודמן מוצג. יתרה מזאת, שגרת הניתוח מוצגת באמצעות ככמת תחריט ודינמיקת צמיחה.

הכנת התאים הנוזליים של הגרפן לתאי הנוזלי עבור הילוכים באתרו מיקרוסקופ אלקטרוני

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליישום שכבה אחת של גרפן על רשתות מיקרוסקופיית אלקטרונים וכיצד להכין אותם לשימוש בקביעת מבנה cryoEM.

ייצור רשתות מצופות גרפן חד-שכבתיות למיקרוסקופ קריואלקטרון

היישום של שכבות תמיכה ברשתות מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryoEM) יכול להגדיל את צפיפות החלקיקים, להגביל אינטראקציות עם ממשק אוויר-מים, להפחית תנועה הנגרמת על ידי אלומה, ולשפר את התפלגות כיווני החלקיקים. מאמר זה מתאר פרוטוקול חזק לציפוי רשתות cryoEM בשכבה אחת של גרפן לשיפור הכנת דגימת קריו.

יישום גרפן חד-שכבתי ברשתות מיקרוסקופיית אלקטרונים קריו-אלקטרונים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה

לטווח ארוך הדמיה בתאי יונקים באמצעות מיקרוסקופית שדה רחב

שיטה של ​​מולקולות דנ"א בודדות התבוננות בתאים חיים מתוארת. הטכניקה מתבססת על הכריכה של חלבון מתויג fluorescently lac repressor לאתרי קישור מהונדס לתוך הדנ"א של עניין. שיטה זו יכולה להיות מותאמת למעקב DNAs רקומביננטי רב בתאי חיים לאורך זמן.

ניטור כפול פלסמיד בתאי יונקים חיים דרך מספר דורות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי

רמות heme תוך-תאיות משתנות קשורות למחלות נפוצות כגון סרטן. לפיכך, יש צורך למדוד את רמות הביוסינתזה של הם בתאים מגוונים. מטרת פרוטוקול זה היא לספק שיטה מהירה ורגישה למדידה והשוואה של רמות סינתזת הם בתאים שונים.

מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים

השגת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים באיכות גבוהה היא מאתגרת, במיוחד במקרה של תאי צמחים, שיש להם שפע של ואקואולים גדולים מלאים במים וחללים מאווררים. הקפאה בלחץ גבוה טנדם והחלפת הקפאה מהירה מפחיתים מאוד את זמן ההכנה של דגימות צמחים ל-TEM תוך הפקת דגימות עם שימור אולטרה-מבני מעולה.

הקפאה בלחץ גבוהה טנדם ומהיר הקפאת חילוף של צמח רקמות למיקרוסקופים אלקטרונים חודרים

פרוטוקול זה מתאר את טכניקות שונות הדרושות במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים כולל צביעת שלילי, חלוקתה ודק במיוחד עבור מבנה נתונים היסטוריים, חיסונית-זהב labelling כדי לקבוע את המיקום של חלבונים ספציפיים ב- exosomes.

הכנת הדוגמא והדימות של Exosomes על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

מכשיר ושיטות ההכנה של אמצעי אחסון מדגם בגודל nanoliter במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים מוצג. אין מדרגות נייר סופג נדרשים, וכך להימנע ההשלכות מזיקה שיכולה להיות חלבונים, הפחתת הדגימה אובדן ולאפשר הניתוח של תא בודד lysate עבור פרוטאומיקס חזותי באופן משמעותי.

הכנת הדוגמא ולמחקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

למדו שיטה לתיוג חלבוני ממברנה בתאי יונק ודימוי מיקרוסקופיה אלקטרונית בשלב נוזלי באמצעות גרפן. הטכניקה מאפשרת לחקור קולטנים על תאי סרטן בסביבה טבעית ללא ייבוש או חיתוך.

מארז גרפן של תאי יונקים קבועים כימית עבור מיקרוסקופאלקטרונים בשלב נוזלי

גלה סרטונים נוספים