קוונפיקציה של אזור הדבקה בתשתית התא והפצות צורות התא ב-MCF7 Cell Monolayers
June 24th, 2020
המאמר מתאר את הכמת של 1) את גודל ומספר של הידעיות מיקוד ו 2) אינדקס צורת תא ואת ההתפלגות שלה מתוך תמונות קונפוקלית וקד של המונאולאיירס הקונאולית של תאים MCF7.
פרוטוקול זה מאפשר כימות של האזור, ההיקף והצורה של מבנה תאי מהתמונה הדו-ממדית שלו. טכניקה זו מהירה וקלה, דורשת רק הגדרות מעבדה סטנדרטיות ומיקרוסקופ קונפוקל ומשתמשת בתוכנת opensource. הפגנת ההליך תהיה אנה Balcerak, דוקטורנט מהמעבדה שלי.
התחל על ידי זריעת ארבע פעמים 10 לתאים החמישיים ב 0.5 מיליליטר של תרבות בינונית לגם בשקופית תא מצופה ארבע באר אחד לתרבות של 24 שעות ביממה ב 37 מעלות צלזיוס וחמש מעלות פחמן דו חמצני אינקובטור. למחרת בבוקר, השתמש במיקרוסקופ אופטי הפוך כדי לאמת נוכחות של לפחות 90% מונוליאר קונפלונט ולהשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי להשיג תמונות בודדות של פרוסת Z. לניתוח הידבקות מוקד, פתחו את התמונות ב-ImageJ ובחרו לנתח, להגדיר קנה מידה, להסיר קנה מידה וגלובלי כדי להגדיר את סולם התמונה בפיקסלים.
כדי לכלול את שם הקובץ ואת האזור של אזור העניין באפשרויות המדידה, לחץ על נתח והגדר מידות ובדוק את אפשרויות האזור והצג תוויות. לחסר את הרקע, בחרו 'עבד' ו'חיסור רקע'. הגדר את רדיוס הכדור המתגלגל ל- 50 פיקסלים ובדוק פרבולואיד הזזה.
כדי לקבוע את האזור של האזור הקטן ביותר של עניין, מתאר את ההיתוך המוקד הבודד הקטן ביותר ולחץ לנתח ולמדוד כדי למדוד את האזור. כאשר לפחות 20 אזורי עניין נבחרו ונמדדו, חשב ושמור את ממוצע התוצאות שהתקבלו. הגדר את הגבול העליון ל- 25% מאזור תא טיפוסי.
כדי להעניק את התמונה לתמונה בינארית, לחץ על תמונה, התאם סף ובדוק את ברירת המחדל, רקע שחור-לבן ורקע כהה. כדי למדוד את המספר ואת האזורים של אזורי העניין, בחר לנתח ולנתח חלקיקים ובדוק יחידות פיקסלים, הצג תוצאות, נקה תוצאות וסכם. העבר את נתוני הגודל הממוצע של הפרוסה, הספירה והגודל הממוצע הכולל מחלון הסיכום לתוכנית ניהול הנתונים הרצויה.
עבור כימות הידבקות מוקד, פתח את המאקרו ImageJ הידבקות המוקד ולהיכנס לאזור של האזור הקטן ביותר של עניין כאזור של האזור הקטן ביותר של פרמטר עניין. הגדר את ערך סוג הסף כידני או אוטומטי ושמור את השינויים. לאחר מכן התקשר למאקרו מתוך ImageJ ובחר את התמונה לעיבוד.
לניתוח ידני של צורת תא, פתח תמונה בתוכנה מתאימה לעיבוד תמונה ובחר את הפרמטרים שיש למדוד. השתמש בכלי הבחירה ביד חופשית כדי לסמן ידנית את גבולות התא כפי שהם מסומנים בחלבוני הצומת הנבחרים. הפרמטרים שנבחרו יחושבו באופן אוטומטי עבור כל תא.
לאחר חלוקה לרמות של כל התאים, בחר עריכה, בחירה והוספה למנהל. יש לבחור רק תאים גלויים לחלוטין עם גבולות ללא הפרעה. כדי לבצע את המדידה, סמן את כל המספרים המופיעים בתיבה הימנית של מנהל אזור העניין ולחץ על מידה.
התוצאות יופיעו בתיבת התוצאות ו ניתן לייבא אותן לגיליון האלקטרוני של הבחירה. ניתוח תאים אוטומטי מאפשר כימות של מספר התאים הגדול. עבור כל סוג תא חדש, הפעל תחילה את המאקרו כדי ליצור פרמטרים.
לאחר סיום המאקרו, בחר הגדר גבולות גודל תא. לחץ על התווית של התאים הקטנים והגדולים ביותר ולחץ על מידה. הגדר את הערך של התא הקטן ביותר ומשתני התא הגדולים ביותר ושמור את השינויים.
סגור את כל חלונות המאקרו ובחר את התמונה לעיבוד בגווני אפור. לאחר מכן הפעל שוב את המאקרו. המאקרו יספק טבלה של התוצאות הכוללות את נתוני הרשימה אינדקס צורת תא, יחס גובה-רוחב ואזורים של בחירות עניין.
כאן, תמונות מייצגות של הידבקויות מוקד נספר עם ImageJ כולל קווי המתאר ממוספרים הסופיים ואת שכבות העל של קווי התווה הידבקות המוקד עם התמונה המקורית עבור שני קווי תא שליטה ו knockdown ניתן לראות. כפי שמודגם בניתוח זה, תאי ההפלה הדגימו מספר גבוה יותר של הידבקויות לכל תא, כמו גם הידבקויות שגודלן גדול יותר בהשוואה לתאי קו הבקרה. בתמונות אלה, אזורים מייצגים של מונואירים תאים לא מטופלים וכימותרפיים מוצגים.
תאי החלוקה לרמות התאפיינו על פי ערכי מדד צורת התא שלהם, למשל בניתוח זה המראים עלייה בסל האחרון ושיטוח הפסגות העיקריות של התאים המטופלים בתרופה בהשוואה לפקדים לא מטופלים. לאחר מכן ניתן ליצור התפלגות תדירות והתפלגות מצטברת עבור כל תרבות תאים. הדמיה בגווני אפור של המונו-שכבות כפי שהוכח אפשרה ניתוח וכימות של 512 תאים מ-12 שדות תצוגה שחשפו התפלגות תדרים יחסית של אינדקס צורת התא.
כדי שפרוטוקול זה יפעל, חשוב להשתמש בתמונות באיכות הטובה ביותר האפשרית. זריעת תאים נכונה, כתמים והדמיה צריכים להבטיח תמונות באיכות ניסיונית מספקת.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מפרט פרוטוקול לכימות הידבקויות פוקאליות ומדד צורת תאים במונוליירים צפופים של תאי MCF7 באמצעות הדמיה קונפוקלית. המחקר מדגיש כיצד ניתן לנתח וריאציות בהידבקות ובצורת התא באמצעות טכניקות הדמיה נגישות.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המחקר
- ביולוגיה של תאים
- ניתוח הידבקויות פוקאליות
- כימות צורת תאים
רקע
- הידבקויות פוקאליות חיוניות להידבקות תאים ולסיגנלים.
- הבנת צורת התא וההידבקות יכולה להשפיע על חקר ביולוגיה של סרטן.
- תאי MCF7 משמשים כמערכת מודל למחקר סרטן השד.
שיטות ששימשו
- מיקרוסקופיה קונפוקלית להדמיית מבנים תאיים.
- תוכנת ImageJ לניתוח אזורי הידבקות פוקאלית ומדד צורת תאים.
- פרוטוקולי ניתוח ידניים ואוטומטיים לאיסוף נתונים יעיל.
תוצאות עיקריות
- מספרים גדולים יותר והגדלים גדולים יותר של הידבקויות פוקאליות נצפו בתאי נוקדאאוט בהשוואה לתאים בקרה.
- הבדלי מדד צורת תאים נרשמו בין תאים לא מטופלים לבין תאים שטופלו בתרופות.
- מתודולוגיות חזקות אפשרו ניתוח של גדלי מדגם גדולים, והגבירו את הרלוונטיות הסטטיסטית.
מסקנות
- מחקר זה מספק פרוטוקול אמין לניתוח מורפולוגיה של תאים ותכונות ההידבקות שלהם.
- התוצאות תורמות להבנת התכונות המכניות של תאים, הרלוונטיות במחקר ופיתוח של סרטן.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantifying focal adhesion dynamics and cell shape distributions provides mechanistic insights into cancer cell behavior, supporting target validation in oncology drug discovery. This protocol enables reproducible, image-based assessment of adhesion and morphology, facilitating phenotypic screening and preclinical model characterization. The approach supports data-driven go/no-go decisions by linking molecular perturbations to functional cellular outputs relevant to therapeutic response.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying changes in focal adhesion number and size as functional readouts of target modulation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through standardized, image-based metrics that correlate molecular interventions with cellular phenotypes.
- Predictive Value: Generates quantitative adhesion and shape data that enhance confidence in target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces validated, quantitative outputs (adhesion area, count, shape index) suitable for high-content screening workflows.
- Reproducibility: Uses standardized staining, imaging, and open-source analysis to ensure consistent results across experiments and laboratories.
- Scalability: Automated macro-based analysis allows processing of large cell populations, supporting assay miniaturization and throughput.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to breast cancer models using MCF7 cells, enabling mechanistic de-risking of oncology targets.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by providing quantifiable, morphology-based biomarkers of drug response.
- Risk-Adjusted Advancement: Shape and adhesion distributions inform predictive models for cellular behavior in therapeutic contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly in cancer mechanobiology.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking genetic or pharmacological perturbations to measurable changes in adhesion and morphology.
- Screening: Delivers standardized, quantitative image outputs that enable reliable compound effect assessment in adherent monolayers.
- Analytics: Provides numerical readouts (focal adhesion count, size, cell shape index) that facilitate condition comparison and statistical evaluation.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through morphology-based biomarkers that reflect drug-induced cellular changes.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other cellular structures (e.g., mitochondria, nuclei) and cell types, supporting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in mechanistic links between targets and cellular phenotypes.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through defined staining, imaging, and analysis parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing objective, quantifiable phenotypic data early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional adhesion and shape outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, immunofluorescence staining, and confocal microscopy operation.
- Dependent on access to confocal microscopes and computers capable of running ImageJ and associated macros.
- Necessitates standardization of image acquisition settings (z-slice, lighting, focus) across users and experiments.
- Adaptation to new cell types or structures requires initial parameter optimization (e.g., size thresholds, staining validation).
- Limited to 2D image analysis; does not capture 3D adhesion dynamics or subcellular localization without modification.
