Name: מודל מורין של חשיפה עוברית לדלקת אימהית כדי ללמוד את ההשפעות של Chorioamnionitis חריפה על התפתחות מעיים שזה עתה נולד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: למדו את פרוטוקול FEMI לחקירת השפעות דלקת אימהית על התפתחות מעיים בצאצאי עכברים. השיטה משתמשת בהזרקת LPS כדי לדמות דלקת סטרילית וללמוד על מנגנוני פגיעה במעי ועל NEC בפגים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה באמצעות המכונים הלאומיים לבריאות (DK097335 & T32AI007260) והמחלקה לרפואת ילדים באוניברסיטת איווה סטד.

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת איווה (פרוטוקול #8041401). כל בעלי החיים שוכנו באגודה להערכה והסמכה של מעבדה לטיפול בבעלי חיים (AALAC) אישר vivarium באוניברסיטת איווה. כל העכברים היו סוג פראי זן C57Bl/6J.
1. הקמת FEMI בעכברים בהריון
<ol><li>הכנת LPS<ol>
<li>השתמש LPS נגזר Escherichia קולי O55:B5 (ריכוז מלאי 2 מ"ג / מ"ל).</li>
		<li>לדלל את ריכוז מלאי LPS 1:100 עם מלוחים סטריליים עבור ריכוז עבודה של 20 מיקרוגרם / מ"ל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הזרקת LPS אימהית<ol>
<li>להזריק סכרים בהריון ביום ההריון e15. נקודת זמן זו היא כ 75% דרך ההריון מורין, מה שהופך את המודל הזה מבחינה התפתחותית דומה השליש השלישי המוקדם של הריונות אנושיים, וזה כאשר רוב לידות פגים עקב chorioamnionitis להתרחש.</li>
		<li>לשקול עכברים בהריון מיד לפני ההזרקה כדי לקבוע מנון LPS המתאים.</li>
		<li>לחשב את המינון של ריכוז עבודה באמצעות הנוסחה הבאה: 5 μL x משקל גוף גרם (gbw), עבור מנה כוללת של LPS של 100 מיקרוגרם / קילוגרם. עבור חיות בקרה, השתמש בנפח שווה ערך של מלוחים רגילים להזרקה.</li>
		<li>פתרון LPS Vortex שלוש פעמים במשך 15 שניות על גבוה לפני כל זריקה.</li>
		<li>צייר עוצמת LPS למזרק של 1 מ"ל.</li>
		<li>לרסן את העכבר בהריון עם טכניקת קשקוש. להחזיק בתנוחת נסיוב הגב ולבצע את הזריקה.<ol>
<li>הכנס 30 מד 8 מ"מ המחט משופע מעל הרבע התחתון הימני של הבטן (כדי למנוע שלפוחית השתן וכלי הבטן) בזווית 30 \u201240°. הכנס על 1/4 כדי 1/2 את אורך המחט.</li>
			<li>משוך בחזרה על בוכנה מזרק כדי להבטיח לחץ שלילי לפני הזרקה. המשך עם הזרקה אם קיים לחץ שלילי.</li>
			<li>לאחר ההזרקה, לפקח על עכברים במשך כ 30 דקות ולאחר מכן לחזור לכלובים למשך שארית ההריון.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. משלוח וטיפול בצאצאים, וקציר מעיים
<ol><li>לספק גורים בדרך כלל באמצעות משלוח הנרתיק ב e20. הערה: לדגם זה יש שיעור אובדן עוברי תלוי מינון שניתן לראות באיור 1 והוא נדון בתוצאות שלהלן.</li>
	<li>אפשר גורים להישאר עם אמהות ולקבל הזנות libitum המודעה.</li>
	<li>ביום הקציר, בדרך כלל לאחר יום הלידה 14 (P14), המתת חסד גורים באמצעות נקע בצוואר הרחם בהתאם לפרוטוקולים מוסדיים של ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים.</li>
	<li>באמצעות מספריים ומלקחיים, לבצע חתך אנכי לאורך קו האמצע של הבטן, דרך העור הצפק, לכל אורך הבטן. מוציאים את המעי הדק מהקיבה אל הסקום עם המספריים ומסירים את המזנטריה במלקחיים.</li>
	<li>לבודד ולשמור על דיסטלי 1/3 של המעי הדק (נציג סעיף של איליום אנושי), השלכת המעי הדק הפרוקסימלי, cecum, ואת המעי הגס.</li>
	<li>מחלקים את חלק האילום לשניים באמצעות מספריים.</li>
	<li>מניחים את החצי הפרוקסימלי בתמיסת ייצוב RNA לכימות RNA מאוחר יותר.</li>
	<li>מקם את החצי הדיסטלי בפורמלין אגירה ניטרלי 10% להכנת שקופית.</li>
</ol>3. ניקוד פציעות מעיים
<ol><li>סעיף רקמה מוטבעת פרפין לפרוסות 5 מיקרומטר עבה הרכבה על שקופיות זכוכית. הערה: אנו שולחים את הדגימות לליבת היסטולוגיה להטמעת פרפין, חתך והרכבה על שקופיות.</li>
	<li>נקה שקופיות בהתאם לנהלים סטנדרטיים.</li>
	<li>כתמים עם המטוקסילין ואאוסין על פי נהלים סטנדרטיים.</li>
	<li>קטעי ציון בסולם של 3 נקודות עבור פגיעה במעיים כפי שתואר קודם לכן42,43.<ol>
<li>באמצעות מיקרוסקופיה קלה, להעריך פגיעה במעיים כללית על ידי שני חוקרים עיוורים נפרדים בסולם של 3 נקודות הערכת שלמות villus והפרדה מן קרום המרתף43 (איור משלים 1). פגיעה במעיים מוערכת בצורה הטובה ביותר בהגדלה של 20x וצמצם מספרי 0.50.</li>
		<li>להקצות ציון של 0 כדי לתאר רירית נורמלית.</li>
		<li>להקצות ציון של 1 לתאר פציעה קלה הכוללת את הפיתוח של החלל של גרואנהאגן subepithelial, vacuolization או הרמה subepithelial מוגבל לנמינה פרופריה או טיפים של וילי.</li>
		<li>להקצות ציון של 2 כדי לתאר פציעה חמורה, המצוין על ידי הרמת אפיתל ו vacuolization גדול ממחצית הווילי, עיוות וילי, או כיב רירית והתפוררות של פרופריה למינה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. כימות של פאנת ותאי גביע
<ol><li>לאחר deparaffinization, כתמים שקופיות של מקטעי רקמה משלב 2.8 עם כתם כחול /תקופתי Alcian שיף כדי לציין הן גביע תאים Paneth כפי שתואר קודם לכן44,45 על פי השלבים הבאים. הערה: בעוד כתם Alcian כחול / תקופתי חומצה שיף אינו ספציפי או Paneth או תאים גביע, מניסיוננו, חוקרים מנוסים עיוורים יש כימות הסלולר שווה ערך באמצעות כתם זה לעומת נוגדנים ממוקדים הסלולר, עם משמעותית פחות כתמי רקע46.</li>
	<li>Deparaffinize, כתם, ומייבש שקופיות כדלקמן.<ol>
<li>שקוע שקופיות בקסילן במשך 10 דקות פעמיים. התראה: Xylene יש להשתמש במכסה המנוע אדים.</li>
		<li>יש לשטוף עם 100% אט"ו.</li>
		<li>שקופיות שקועות ב- 100 % EtOH למשך 3 דקות, ולאחר מכן ב- 90% EtOH למשך 3 דקות, ואחריהן 70% EtOH למשך 3 דקות, ולבסוף שקופיות שקועות ב- 50% EtOH למשך 3 דקות.</li>
		<li>לשטוף תחת מי ברז זורמים במשך 5 דקות. התראה: כוון את המקטע הרחק מהמים הזורמים כדי למנוע אובדן של דגימת רקמה.</li>
		<li>סנן פתרון כתם כחול אלקיאני עם מסנן קפה סטנדרטי.</li>
		<li>כתמים מחליקים בכתם כחול אלסי במשך 15 דקות ולאחר מכן לשטוף תחת מי ברז זורמים במשך 2 דקות.</li>
		<li>לדלל 1 מ"ג של חומצה תקופתית ב 200 מ"ל של מים מזוקקים כפולים. שקוע שקופיות בפתרון זה במשך 5 דקות. ואז לשטוף תחת מי ברז זורמים במשך 1 דקות.</li>
		<li>כתם עם ריאגנט של שיף במשך 10 דקות. לשטוף תחת מי ברז זורמים במשך 5 דקות.</li>
		<li>הכתימו את המגלשות בהמטוקסילין במשך דקה אחת ולאחר מכן שטפו תחת מי ברז זורמים במשך 2 דקות.</li>
		<li>לטבול אותם אלכוהול חומצה (1 מ"ל של חומצה הידרוכלורית מעורבב 99 מ"ל של 70% EtOH) במשך 1 דקות.</li>
		<li>שקועים במי הברז של סקוט (0.1% ריכוז NaHCO3 במי ברז) במשך דקה ולאחר מכן לשטוף תחת מי ברז זורמים במשך דקה.</li>
		<li>לייבש את השקופיות.<ol>
<li>טובלים כל שקופית 10 פעמים ב-70% EtOH, ואז טובלים 10 פעמים ב-90% EtOH, ו-10 פעמים ב-100% EtOH.</li>
			<li>שקופיות שקועות ב- 100% EtOH למשך 10 דקות, ולאחר מכן שקועות פעמיים בקסילן טרי במשך 3 דקות כל אחת.</li>
		</ol>
</li>
		<li>מניחים טיפה של מדיה הרכבה על הדגימה ומניחים כיסוי על זה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ספירת תאי גביע<ol>
<li>באמצעות מיקרוסקופיה קלה, לספור תאי גביע (איור משלים 2). עבור כל פיסת רקמת מעיים, לספור את מספר תאי הגביע ו 500 תאי אפיתל ויחס תא גביע אקספרס כיחס לכל 100 תאי אפיתל. תאי גביע נספרים בצורה הטובה ביותר בהגדלה פי 20 וצמצם מספרי 0.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ספירת תאים בחלונית<ol>
<li>באמצעות מיקרוסקופיה קלה, לספור תאים Paneth (איור משלים 2). עבור כל פיסת רקמת מעיים, להביע כיחס של תאים Paneth לכל קריפטה מעיים. לספור 100 קריפטות מעיים לכל פיסת רקמת מעיים. התאים החלונית נספרים בצורה הטובה ביותר בהגדלה של 20x-60x ובצמצם מספרי 0.50-1.30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

Chorioamnionitis משפיע 2\u20124% של המונח ו 25\u201230% של משלוחי פגים8,9. עם זאת, ההשפעה של chorioamnionitis יכול להאריך זמן רב לידת העבר כפי שהוכח יש השפעות משמעותיות על העובר ניאונט10,11,12,13,14,15,16. חשוב לציין, chorioamnioniti...

הקרומים הכוריוניים ממלאים תפקיד אינטגרלי בהריון יונקים. הם כוללים את chorion ו amnion, אשר משרתים פונקציות מרובות. הם מקיפים ומגנים על העובר, מקלים על איתות פרוקרין בין התאים האימהיים והעובריים1, ויוצרים לולאות משוב מקומיות בתוך הקרומים הכוריוניים, אשר עשויים להיות מעורבים בייזום parturition1. ההבנה הנוכחית של הממברנות מצביעה על כך שהאמוניון מספק תפקוד מחסום מבני, והכוריון מספק חיץ חיסוני בעיקר כדי להגן על העובר המתפתח ממערכת החיסון האימהית2. דלקת של ממברנות אלה ידועה בשם chorioamnionitis. מבחינה היסטורית, האבחנה של chorioamnionitis קליני נעשה בעקבות נוכחות של קדחת אימהית בתוספת אחד או יותר ממצאים קליניים עובריים או אימהיים3,4. עם זאת, בעוד הגדרה זו שימושית קלינית, חוסר הדיוק שלה עשה מחקר chorioamnionitis מאתגר. בשנת 2015, בניסיון להבהיר את האבחנה, סדנת פאנל מומחים של המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם של יוניס קנדי שרייבר הגדירה את chorioamnionitis כדלקת תוך רחמית, או זיהום, או שניהם (משולש I)3. הבהרה זו חשובה כי בעוד זיהום המושרה מיקרוביאלית היא גורם חשוב של דלקת הרחם / מי השפיר, זה קורה פחות נפוץ מאשר דלקת הרחם / מי השפירסטרילית 5,6,7. בסך הכל, chorioamnionitis נשאר בעיה משמעותית בריאות הציבור, כפי שהוא נראה 2\u20124% של משלוחים לטווח ו 25 \u201230% של משלוחים פגים8,9.
Chorioamnionitis יכול להיות השפעות משמעותיות על העובר ניאונט. זה תועד היטב בספרות כי chorioamnionitis קשורה לסיכון מוגבר של רבים של תחלואה של פגות, כולל דיספלסיה ברונכופולמונארית10, פגיעה חומר לבן מוחי11, דימום תוך חדרי12, רטינופתיה של קדם בגרות13, ושניהם חשד ואישרו אלח דם יילודים תחילת מוקדם14,15. כפי שאנו מעוניינים במנגנוני פציעה ותיקון של מערכת העיכול בשלה, חשוב לציין כי chorioamnionitis קשורה גם עם התפתחות מאוחרת יותר של enterocolitis נמק (NEC)15,16. NEC היא מחלה הרסנית במערכת העיכול של פגים שתוצאתה תגובת מארח dysregulated לדלקת נמק מעיים הבאים17. בכל שנה, NEC משפיע על מעל 4000 תינוקות בארצות הברית, ועד שליש מהתינוקות האלה מתים מהמחלה18. הפתוגנזה של NEC ככל הנראה כרוכה בשילוב של חוסר בגרות במעיים, dysregulation של המערכת החיסונית בשלה, דלקת מעיים, טרנסלוקציה חיידקית19, שהגיע לשיאו במסלול משותף סופי של נמק מעיים. חשוב לציין, הופעת NEC מתרחשת לעתים קרובות שבועות לאחר הלידה וחשיפה פוטנציאלית chorioamnionitis, מה שהופך את הקשר המכניסטי בין chorioamnionitis ופיתוח לאחר מכן של NEC לא ברור20. מנגנון פוטנציאלי אחד שבאמצעותו chorioamnionitis עשוי לתרום הפתופיזיולוגיה של NEC היא באמצעות upregulation של המערכת החיסונית האימהית, לאחר מכן לייצר תגובה דלקתית עוברית חזקה אשר עלול לשבש דפוסים התפתחותיים עוברייםנורמליים 21,22,23.
דגמי יונקים מרובים של chorioamnionitis קיימים מכרסמים וכבשים24,25,26,27,28,29,30,31,32. עם זאת, נתונים מעטים קיימים לגבי התפתחות מערכת העיכול מעבר לתקופת היילוד הראשונית לאחר חשיפה עוברית הנגרמת על ידי chorioamnionitis לדלקת אימהית (FEMI). על מנת לחקור את הקשר בין FEMI לבין ההתפתחות הבאה של פגיעה במערכת העיכול הלא בוגרת, התאמנו את מודל ה- FEMI המושרה על ידי Lipopolysaccharide (LPS). Lipopolysaccharides הם מרכיב מרכזי של פני השטח החוץ תאיים על חיידקים שליליים גרם והם ממריץ חזק של המערכת החיסונית המולדת של מינים אוקריוטיים מרובים, כולל בני אדם33. תוצאות הזרקת LPS אימהית מפל דלקתי סטרילי ללא ההשפעות המבלבלות של חיידקים חיים, וזה מודל מבוסס היטב עבור אינדוקציה של לידה מוקדמת34, כמו גם מודל של chorioamnionitis חריפה ותסמונת התגובה הדלקתית העוברית (FIRS), שהיא הצורה החמורה ביותר של chorioamnionitis24,35. זה גם הוכח לגרום הן פגיעה חומר לבן ואפור מוחי בדגם כבשים36 ומודל מורין37,38,39,40. עם זאת, למיטב ידיעתנו, אנו הראשונים להשתמש במודל זה של chorioamnionitis ו FEMI כדי לחקור את השפעותיו על התפתחות מערכת העיכול בעבר הלידה, כמו גם לחקור קשר מכני אפשרי בין chorioamnionitis ופיתוח מאוחר יותר של NEC41,42.

<table><tbody><tr><td>10% ניטרלי חוצץ פורמלין</td><td>סיגמא</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>כתם כחול אלצ'יאני</td><td>אספקת עולה חדשה</td><td>1003A</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl6/J עכברים</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>דקון מעבדות</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>כתם המטוקסילין</td><td>Leica</td><td>381562</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ni-U מיקרוסקופ</td><td>Nikon</td><td>2CE-MQVJ-1</td><td></td></tr><tr><td>חומצה מחזורית</td><td>ACROS</td><td>H5106</td><td>CAS# 10450-59-9</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Thermofisher</td><td>Am7021</td><td></td></tr><tr><td>המגיב של שיף</td><td>Sigma</td><td>S5133</td><td></td></tr><tr><td>Secor Imager 2400</td><td>Meso Scale Discovery (MSD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V-Plex Assay</td><td>Meso Scale Discovery (MSD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma</td><td>534056</td><td></td></tr></tbody></table>

מודל מורין של חשיפה עוברית לדלקת אימהית כדי ללמוד את ההשפעות של chorioamnionitis חריפה על התפתחות מעיים שזה עתה נולד

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Chorioamnionitis הוא משקע נפוץ של לידה מוקדמת והוא קשור עם רבים של תחלואה של פגות, כולל אנטריוקוליטיס נמק (NEC). עם זאת, קשר מכני בין שני תנאים אלה עדיין לא התגלה. אימצנו מודל מורין של chorioamnionitis מעורבים lipopolysaccharide (LPS)-induced חשיפה עוברית לדלקת אימהית (FEMI). מודל זה של FEMI גורם למפל דלקתי סטרילי אימהי, שליה ועובר, אשר קיים גם במקרים רבים של chorioamnionitis קלינית. למרות שקיימים מודלים המשתמשים בחיידקים חיים ומחקים בצורה מדויקת יותר את הפתופיזיולוגיה של זיהום עולה וכתוצאה מכך chorioamnionitis, שיטות אלה עלולות לגרום להשפעות עקיפות על התפתחות מערכת העיכול הלא בוגרת ועל המיקרוביום המתפתח המשויך. באמצעות פרוטוקול זה, הוכחנו כי תוצאות FEMI הנגרמת על ידי LPS לעלייה תלוית מינון אובדן הריון ולידה מוקדמת, כמו גם שיבוש של התפתחות מעיים נורמלית בצאצאים. יתר על כן, הוכחנו כי FEMI מגביר באופן משמעותי פגיעה במעיים ציטוקינים בסרום בצאצאים, ובו זמנית הפחתת גביע ותאי Paneth, שניהם מספקים שורה ראשונה של חסינות מולדת נגד דלקת מעיים. למרות מודל דומה של FEMI הנגרמת על ידי LPS שימש כדי מודל הקשר בין chorioamnionitis ואת החריגות הבאות של מערכת העצבים המרכזית, למיטב ידיעתנו, פרוטוקול זה הוא הראשון לנסות להבהיר קשר מכני בין chorioamnionitis והפרעות מאוחר יותר בהתפתחות המעי כקשר פוטנציאלי בין chorioamnionitis ו NEC.

חשיפה ל-FEMI ביום העוברי 15 מובילה לאובדן הריון תלוי מינון ולשיעור תלוי מינון של לידה מוקדמת (איור 1)42. עבור הניסויים, בחרנו להשתמש במינון LPS של 100 מיקרוגרם / קילוגרם כדי למזער את אובדן ההריון ואת פגות (50% אובדן בין פגות ומוות עוברי תוך רחמי) תוך חשיפת העוברים עלבון דלקתי משמעותי.
באמצעות גישה זו, בדקנו את ההשפעות של FEMI על הפציעה הבאה של הצאצאים. באמצעות סולם היסטולוגי של 3 נקודות למדידת פגיעה כללית במעיים, מצאנו פגיעה משמעותית בלידה ...

פיתחנו מודל של chorioamnionitis כדי לדמות חשיפה עוברית לדלקת אימהית (FEMI) ללא סיבוכים של אורגניזמים חיים כדי לבחון את ההשפעות של FEMI על התפתחות מערכת העיכול של הצאצאים. זה מאפשר מחקר של סיבות מכניות להתפתחות של פגיעה במעיים בעקבות chorioamnionitis.

מודל מורין של חשיפה עוברית לדלקת אימהית כדי ללמוד את ההשפעות של Chorioamnionitis חריפה על התפתחות מעיים שזה עתה נולד

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

פרוטוקול FEMI זה מאפשר לחקור השפעות ארוכות טווח על יילודים בעקבות חשיפת העובר לדלקת אימהית. זה רלוונטי במיוחד להתפתחות של דלקת מעי נמקית, או NEC. טכניקה זו מחקה דלקת סטרילית הנראית לעתים קרובות בכוריואמניוניטיס, והיעדר חיידקים חיים יכול להיות בעל השפעות מבלבלות על מערכת העיכול המתפתחת ועל המיקרוביום.השלב החשוב ביותר בפרוטוקול זה הוא הזרקת LPS כדי לגרום ל-FEMI. חשוב מאוד להשתמש במינון LPS מתאים ושההזרקה לא תגרום לטראומה תוך צפקית לעכבר הגרביד. התחל בדילול מלאי ה-LPS מ-1 ל-100 במי מלח סטריליים לריכוז עבודה של 20 מיקרוגרם למיליליטר.להזריק סכרים בהריון ביום ההיריון E15. שקלו את העכברים מיד לפני ההזרקה כדי לקבוע את מינון ה-LPS המתאים, תוך שימוש בנפח שווה ערך של מי מלח רגילים עבור חיות ביקורת. מערבולת את תמיסת ה-LPS שלוש פעמים למשך 15 שניות בגובה.ואז משוך אותו למזרק של מיליליטר. השתמש בטכניקת הקשקוש כדי לרסן את העכבר ההרה, והחזק אותו בתנוחת השכיבה הגבית. הכנס כרבע עד חצי ממט שיפוע של שמונה מילימטר בגודל 30 כלפי מעלה, מעל הרבע התחתון הימני של הבטן בזווית של 30 עד 40 מעלות.משוך לאחור את בוכנת המזרק כדי להבטיח לחץ שלילי. לאחר מכן המשך בהזרקה אם קיים לחץ שלילי. עקבו אחר העכברים במשך כ-30 דקות, ולאחר מכן החזירו אותם לכלובים למשך שארית ההריון.ללדת גורים באמצעות לידה נרתיקית ב-E20, ולאפשר להם להישאר עם האימהות, ולקבל הזנה אד-ליביטום. קצרו את המעיים ביום 14 לאחר הלידה. השתמש במספריים ובמלקחיים כדי לבצע חתך אנכי לאורך קו האמצע של הבטן, דרך העור והצפק, לכל אורך הבטן.הוציאו את המעי הדק מהקיבה אל הצקום, והוציאו את המזנטריה. בודד את השליש הדיסטלי של המעי הדק, והשליך את המעי הדק הפרוקסימלי, הצקום והמעי הגס. מחלקים את חלק האילאום לשניים בעזרת מספריים.לאחר מכן הנח את החצי הפרוקסימלי בתמיסת ייצוב RNA לכימות RNA ואת החצי הדיסטלי בפורמלין ניטרלי של 10% להכנת שקופיות. חתכו רקמה משובצת בפרפין לפרוסות בעובי חמישה מיקרומטר, והרכיבו אותן על שקופיות זכוכית. הסר את השקופיות, ואז הכתים קטעים בהמטוקסילין ואאוזין על פי נהלים סטנדרטיים.השתמש במיקרוסקופ אור כדי להעריך פגיעה כללית במעי על ידי שני חוקרים עיוורים נפרדים בסולם של שלוש נקודות, להעריך את שלמות הווילוס וההפרדה מקרום הבסיס. הקצה ציון אפס לתיאור רירית תקינה. הקצה ציון של 1 לתיאור פציעה קלה, הכוללת התפתחות של מרחב גרונהגן תת-אפיתליאלי, ואקואוליזציה או הרמה תת-אפיתלית המוגבלת ללמינה פרופריה או לקצות הווילי.הקצה ציון של 2 לתיאור פציעה חמורה, המסומנת על ידי הרמת אפיתל ווואקאוליזציה של יותר ממחצית הווילי, עיוות וילי או כיב רירי והתפוררות של הלמינה פרופריה. טבלו שקופיות בקסילן פעמיים למשך 10 דקות. לאחר מכן שטפו אותם עם 100% אתנול.טבלו את השקופיות למשך שלוש דקות ב-100% אתנול, 90% אתנול, 70% אתנול ו-50% אתנול. לאחר מכן שטפו את המגלשות מתחת למים זורמים למשך חמש דקות, עם הפנים לחלק הרחק מהמים כדי למנוע אובדן דגימת רקמות. סנן תמיסת כתמים כחולים של Alcian עם פילטר קפה רגיל, והשתמש בו כדי להכתים את השקופיות למשך 15 דקות.לאחר מכן שטפו אותם תחת מי ברז זורמים למשך שתי דקות. יש לדלל מיליגרם אחד של חומצה תקופתית ב -200 מיליליטר מים מזוקקים כפולים, ולטבול את השקופיות בתמיסה זו למשך חמש דקות. לאחר שטיפה של דקה מתחת למים זורמים, יש להכתים את השקופיות במגיב של שיף למשך 10 דקות, ולשטוף אותן שוב למשך חמש דקות.לאחר מכן, יש להכתים אותם בהמטוקסילין למשך דקה אחת, ולשטוף במים למשך שתי דקות. טבלו אותם באלכוהול חומצי למשך דקה אחת, לאחר מכן במי הברז של סקוט למשך דקה אחת, ולאחר מכן שטיפה מתחת למי ברז זורמים למשך דקה. כדי לייבש את המגלשות, טבלו כל שקופית 10 פעמים ב-70% אתנול, 90% אתנול ולאחר מכן 100% אתנול.טבלו את השקופיות ב-100% אתנול למשך 10 דקות, ולאחר מכן טבלו פעמיים בקסילן טרי למשך שלוש דקות בכל פעם. הניחו טיפה של אמצעי הרכבה על הדגימה וכיסוי מעל. ספרו תאי גביע מתחת למיקרוסקופ.עבור כל פיסת רקמת מעי יש לספור את מספר תאי הגביע ו -500 תאי אפיתל. לאחר מכן מבטאים את תאי הגביע כיחס לכל 100 תאי אפיתל. ספור את תאי Paneth.עבור כל פיסת רקמת מעיים, רשום את היחס בין תאי Paneth לקריפטה של המעי, וספירת 100 קריפטות מעיים עבור כל פיסת רקמת מעיים. חשיפת העובר לדלקת אימהית, או FEMI, ביום העוברי ה-15 מובילה לאובדן הריון תלוי מינון ולשיעור תלוי מינון של לידה מוקדמת. FEMI גורם לפגיעה משמעותית במעי בלידה ובשמונה שבועות לחיים.פגיעה זו מתרחשת בהיעדר גירויים נוספים לבעלי החיים, מה שמרמז על כך ש-FEMI לבדו משבש את ההומאוסטזיס הרגיל של מערכת העיכול של העכברים שזה עתה נולדו. מספר תאי הגביע המייצרים מוצין ותאי Paneth המייצרים פפטידים אנטי-מיקרוביאליים בשליש הדיסטלי של מערכת העיכול הדק כומת. נמצא כי FEMI שיבש את ההרכב התקין של אפיתל המעי על ידי גרימת אובדן של שני סוגי התאים, בהשוואה לבעלי חיים ללא FEMI.כדי לחקור את ההשפעות של FEMI על התגובה הדלקתית של היילודים, כומתו מגוון סמנים דלקתיים בסרום, כולל אינטרלוקין-1 בטא, אינטרלוקין-10, KCGRO ואינטרלוקין-6, מסרום של גורים עם ובלי FEMI. FEMI הגדיל משמעותית את מפל הדלקת עבור כל הציטוקינים ב-P0. מפל הדלקת בגילאים מאוחרים יותר השתנה בהתאם לנקודת הזמן ולציטוקין. מעניין לציין שהיו רמות דומות של IL6 ב-P7 עד P28 בקבוצות FEMI ו-smedia.עם זאת, היו רמות גבוהות משמעותית בקבוצת ה-FEMI ב-P56, למרות שלא הייתה התערבות משנית. זה קריטי לבצע עקומת מינון LPS ראשונית, מכיוון שלמניות שונות של LPS יכולות להיות עוצמות שונות. מצאנו שתוצאות היילוד שלנו תלויות במינון ה-LPS המשמש לגרימת FEMI.

a-murine-model-fetal-exposure-to-maternal-inflammation-to-study

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

כאן, הליך מתואר להקמת זיהום מערכתי בחולדה היילודים עם תרבויות של Escherichia coli K1. הליך בלתי פולשני זה מאפשר קולוניזציה של מערכת העיכול, טרנסלוקציה של הפתוגן למחזור המערכתי, ופלישה של מערכת העצבים המרכזית במקלעת דמית העין.

דגם לא פולשנית של Neuropathogenic Coli Escherichia זיהום בעכברוש הילודים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשראת דלקת במעי הגס בעכברים על ידי העברה מאמצת של תאי Tגבוהים CD4+CD45RB סינגניים לנמענים חסרי תאי T ו-B. מאפיינים קליניים והיסטופתולוגיים מחקים מחלות מעי דלקתיות אנושיות. שיטה זו מאפשרת לחקור את התחלת דלקת המעי הגס והתקדמות המחלה.

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

אנצפלופתיה של פגות מקיפה את ההפרעות במערכת העצבים המרכזית הקשורות לפגיעה מלידה מוקדמת. דוח זה מתאר מודל חולדה רלוונטי מבחינה קלינית של איסכמיה מערכתית חולפת ברחם ומתן ליפופוליסכריד תוך מי שפיר (LPS) המחקה כוריואמניוניטיס, ואת ההשפעה הקשורה של גירויים זיהומיים ותת-עירוי שליה על התפתחות מערכת העצבים המרכזית.

דוגמנות אנצפלופתיה של פגות שימוש בהריון היפוקסיה-איסכמיה עם lipopolysaccharide Intra-השפיר בחולדות

מחקר זה מפרט את תהליך gavaging כמויות מדויקות של פרוביוטיקה לעכברים neonatal. הסידור ניסיוני אופטימלי כדי לכלול, אך אינה מוגבלת פרוביוטיקה מינון, שיטות ניהול, כימות של חיידקים במעיים.

פרוביוטיקה מחקרים בעכברים Neonatal באמצעות Gavage

זיהום של עכברים יילודים עם bioluminescent E. coli O1:K1:H7 תוצאות זיהום ספיגה עם דלקת ריאות משמעותית ופתולוגיה ריאות. כאן, אנו מתארים נהלים למודל וחקר נוסף אלח דם יילודים באמצעות הדמיה תוך ויציתית אורך במקביל ללקטואר של נטל חיידקי מערכתי, פרופיל דלקתי, היסטופתולוגיה ריאות.

מודל הדמיה יילודים של אלח דם חיידקי גרם שלילי

נמק enterocolitis (NEC) היא המחלה הקשה ביותר במערכת העיכול (GI) המתרחשת לעתים קרובות אצל פגים, במיוחד תינוקות במשקל לידה נמוך מאוד, עם תמותה גבוהה ופתוגנזה לא ברורה. הגורם ל- NEC עשוי להיות קשור לחריגות במערכת הרגולציה החיסונית הדלקתית. מודל בעלי חיים NEC הוא כלי הכרחי למחקר חיסוני מחלות NEC. מודלים בעלי חיים NEC בדרך כלל להשתמש C57BL / 6J עכברי יילודים; עכברי יילודים BALB / c משמשים לעתים רחוקות. מחקרים קשורים הראו כי כאשר עכברים נגועים, בידול התא Th2 הוא דומיננטי בעכברים BALB / c לעומת עכברי...

מודל עכבר BALB /c יילודים של דלקת אנטרוקוליטיס נמק

פרוטוקול זה מתאר מודל במבחנה של אנטרוקוליטיס נמקית (NEC), אשר יכול לשמש למחקרים מכניסטיים על פתוגנזה של מחלות. הוא מכיל שבב מיקרופלואידי שנזרע עם אנטרואידים במעי שמקורם במעי היילוד האנושי, תאי אנדותל ומיקרוביום המעי של יילוד עם NEC חמור.

מודל מיקרופלואידי של אנטרוקוליטיס נמקית המשלב אנטרואידים ממעיים של ילודים אנושיים ומיקרוביום דיסביוטי

לידה מוקדמת (לידה &lt; שבוע 37) היא בעיה בריאותית עולמית דחופה עם אפשרויות מניעה וטיפול לא אופטימליות. אנו מציגים מודל עכברי של לידה מוקדמת הנגרמת על ידי זיהום חיידקי בנרתיק ומתארים כיצד לנתח את התחלואה והתמותה של היילודים כתוצאה מכך.

מידול זיהום נרתיקי עולה, לידה מוקדמת ותחלואה בילודים בעכברים

פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר יילודים של דלקת מעיים נמקית (NEC) ובידוד לאחר מכן של תאי חיסון למינה פרופריה מהמעי הדק של עכברי היילוד.

מודל עכבר יילודים של דלקת מעיים נמקית ובידוד למינה פרופריה לפרופיל תאי חיסון

המאמר מספק פרוטוקול מקיף ליצירת מודל עכבר להפעלה חיסונית אימהית (MIA) לחקר השפעות הדלקת המוקדמת בהריון על התפתחות נוירולוגית, כולל מדדים מרכזיים להבטחת אמינות ושחזוריות.

יצירת מודל עכבר להפעלת מערכת החיסון של האם בהריון מוקדם להערכת דלקת טרום-לידית על התפתחות נוירולוגית

למדו את פרוטוקול FEMI לחקירת השפעות דלקת אימהית על התפתחות מעיים בצאצאי עכברים. השיטה משתמשת בהזרקת LPS כדי לדמות דלקת סטרילית וללמוד על מנגנוני פגיעה במעי ועל NEC בפגים.

מודל מורין של חשיפה עוברית לדלקת אימהית כדי ללמוד את ההשפעות של Chorioamnionitis חריפה על התפתחות מעיים שזה עתה נולד

גלה סרטונים נוספים