תרומה של Na⁺/ K⁺ משאבה להתפוצצות קצבית, נחקרת עם דוגמנות ניתוחי מהדק דינמיים

הידוק דינמי יכול לשנות או להכניס כל זרם ממברנה לנוירון. אנו מציגים ומשנים את משאבת נתרן אשלגן וזרם נתרן מתמשך לתוך אינטראורון לב חי של עלוקה. שימוש במנורה דינמית מאפשר שליטה מלאה עם הקשה על הדינמיקה והמשרעת של כל זרם שהוכנס לנוירונים בזמן אמת.

פיתוח מערכות אינטראקטיביות בזמן אמת כגון המהדק הדינמי מבסס את כל מחקר ה- BMI. כל ההיבטים של המחקרים התאיים על הפעילות החשמלית של נוירונים ורשתות יכולים להפיק תועלת פוטנציאלית משימוש מהדק דינמי. האתגרים העיקריים של טכניקה זו הם פיתוח המודלים בזמן אמת בנוירונים וכיול התאמות התכווצות דינמיות לנוירון שנבחר למחקר.

לבידוד של הגנגליון 7 מחבל עצב עלוקה, מלאו צלחת ניתוח קו שרף שחור עם כ-1 ס"מ של תמיסת מלח צוננת בתוספת נתרן כלורי, אשלגן כלורי, סידן כלורי, D-גלוקוז ו- HEPES במים מתובלים והצמידו צד עורי עלוקה מרדים קר למעלה בחדר. השתמש במיקרוסקופ סטריאו בהגדלה של פי 20 עם תאורת מדריך אור עקשני ומספריים קפיציים של חמישה מילימטר כדי לגרום לחתך אורך של לפחות שלושה סנטימטרים דרך דופן הגוף בחלק השלישי של הגוף. השתמש סיכות לפרק את רקמת דופן הגוף כדי לחשוף את האיברים הפנימיים ולשאוב את הדם כדי לקבל תצוגה טובה יותר.

לבודד גנגליון גוף בינוני בודד 7. באמצעות מלקחיים חדים מספר חמש כדי לעזור להנחות את החיתוך ולהחזיק את הסינוס, להשתמש במספריים כדי לפתוח את הסינוס שבו נמצא כבל העצבים, תוך דאגה לפצל את הסינוסים בצורה שרירית ובבטן. שמירה על הסינוס מחובר לכל אחד משני שורשי העצבים הדו-צדדיים שיוצאים מן הגנגליון, לחתוך את חבילות עצב החיבור rostral ו caudal כדי להסיר את הגנגליון מהגוף לחתוך את השורשים לרוחב למקום שבו הם יוצאים מן הסינוס.

השתמש מלקחיים ישנים קהים מספר חמש כדי לאבטח את רצועות הסינוסים ורקמה רופפת עם סיכות חרקים Minutien מקוצר בצד הגחון למעלה בצלחות פטרי ברורות מרופד שרף. הצמד את החיבורים rostral ו caudal רחוק ככל האפשר גנגליון ולהצמיד את השורשים בבטחה. הגדל את המיקרוסקופ הסטריאו ל- 40X או יותר ולהתאים את התאורה האלחכשפית כך שניתן יהיה לראות בקלות את גופי התא העצבי בצד הגחון של הגנגליון ממש מתחת לפרינוריום.

באמצעות מספריים מיקרו, להתחיל לחתוך את נדן peroneal רופף בין השורשים בצד אחד של הגנגליון, המשך החתך לרוחב לצד השני ולוודא לשמור על להב המספריים שטחי מבלי לפגוע בגופי התא העצבי ישירות מתחת נדן. בצע חתך שטחי דומה מהחתך לרוחב לאורך קו האמצע והשתמש במספר 5 מלקחיים דקים כדי למשוך דש רוחבי אחד של נדן מהנגליון בכל פעם כדי לאפשר לכל אחד מהם להיחתך. כאשר שני המדפים הוסרו, שני ההבחנות בלב צריכות להיחשף.

מניחים את המנה בהגדרת ההקלטה ומניחים את הדגימה עם תמיסת מלח בקצב זרימה של חמישה מיליליטר לדקה בטמפרטורת החדר. כדי לזהות את האינטראורונים על הגדרת ההקלטה, בחר הגדלה 50 עד 100X עם תאורת שדה כהה להלן ואתר נוירון HN 7 של הזוג הדו-צדדי על ידי מיקומו הקנוני במיקום הקדמי בגנגליון גוף באמצע 7. לאחר מכן, השתמש מניפולטור מיקרו כדי למקם אלקטרודה מיקרו חד מלא עם שני אצטט אשלגן טוחן ו 20 מילימולר אשלגן כלורי מיקרו אלקטרודה קרוב מאוד לגוף תא היעד ולהשתמש אלקטרומטר נוירופיזיולוגי כדי לבחון ברציפות את הפוטנציאל המתועד.

הגדר פוטנציאל זה לאפס מיליוולטים ולחדור את הנוירון עם microelectrode באמצעות המניפולטור לנהוג לאט האלקטרודה לאורך הציר הארוך שלה. השתמש בפונקציית זמזום אלקטרומטר 100 אלפיות השנייה עד שינוי שלילי בפוטנציאל הממברנה ופעילות spiking נמרצת הוא ציין. הגדר את האלקטרומטר לשלושה ק"מ לפחות במצב מהדק זרם לא רציאלי כדי לתעד בו זמנית את פוטנציאל הממברנה תוך העברת הזרם לנוירונים.

השתמש באוסצילוסקופ כדי לפקח על ההגדרה של האלקטרודה ולהשתמש מזרק זרם יציב כדי להזריק זרם קבוע של מינוס 0.1 ננו-amps במשך 1 עד 2 דקות כדי לייצב את ההקלטה. נוירון HN 7 ניתן לזהות על ידי צורת ספייק אופייני שלה ופעילות מתפרצת חלשה. להולכת מהדק דינמית והטמעה נוכחית, פתח תוכנת מהדק דינמית המותאמת אישית ללוח עיבוד האותות הדיגיטלי.

ובזמן שהמודל פועל, הגדר את זרם המשאבה המקסימלי ל- 0.1 עד 0.2 ננו-אמפים והגדיל בהדרגה את ההולכות המרבית של זרם הנתרן המתמשך עד להתפרצות רגילה. באופן שיטתי לשנות זרמים אלה במרווחים של 0.1 ננו-amp עבור הפלט המרבי של זרם המשאבה אחד ננו-קומינסים במרווחים עבור המוליכות המרבית של זרם הנתרן המתמשך ולהעריך את ההשפעות של עליות אלה על תדירות ספייק, מרווח בין התפרצויות, משך פרץ ותקופת פרץ. החזק את המוליכות המקסימלית של זרם הנתרן בערך קבוע מסוים וטאטא במרווחי ננו-ים אחד על פני מגוון זרמי משאבה מקסימליים כדי לתמוך בפעילות מתפרצת סדירה לפני הגדלת הערך הקבוע של מוליכת הנתרן על ידי ננו-קומינס אחד וסוחפת טווח שני של זרמי משאבה מקסימליים.

עבור כל זוג פרמטרים מיושם, לאסוף נתונים המכילים לפחות שמונה התפרצויות, כך שניתן לבצע אמצעים ממוצעים אמינים של תדירות הקו החדה, מרווח בין התפרצויות, משך פרץ ותקופת פרץ. לאחר מכן לאסוף נתונים ממספר נוירונים נוספים כפי שהוכח רק כדי ליצור גרף מורכב. באמצעות מודל זה, זרם המשאבה החיצונית מתנדנד לאורך מחזור הפרץ כריכוז פנימי של נתרן סביב רמה בסיסית.

זרם משאבה זה תורם לסיום פרץ במהלך שלב ההתפרצות. היפרפולריזציה המיוצרת על ידי זרם המשאבה מפעילה היפר קוטביות מופעלת זרם פנימה במהלך מרווח בין התפרצויות. מודל האינטראורון של הלב בזמן אמת מצביע על כך שזרם הנתרן המתמשך באינטראורונים לב תורם לחלק גדול מכניסת הנתרן המשפיעה מאוד על הריכוז הפנימי של הנתרן ובכך על זרם המשאבה.

מכיוון שזרם הנתרן המתמשך פעיל בפוטנציאל ממברנה שלילי יחסית, הוא מתנגד לזרם המשאבה הן במרווחי הפרץ והן במרווחי פרץ. כפי שניתן להמחיש, התפרצות חזקה משוחזרת באינטראורונים פעילים טוניק על ידי תוספת משותפת של זרמי משאבת נתרן ונתרן אשלגן מתמשך עם מלחציים דינמיים. תוצאות ראשוניות מצביעות על אינטראקציה מורכבת חזקה בין שני הזרמים, אשר ניתן לחקור עוד יותר באמצעות המודל.

ניסוי מוצלח תלוי בהתפרקות הטובה של הגנגליון ובנהיגה מכוונת בקפידה, חדירה וזמזום של המיקרו-קטרוד. אנו מעצימים את המלחציים הדינמיים על ידי יישום זרם משאבה תלוי נתרן המחושב על ידי הערכת הריכוז התאי של יון. הערכות כאלה יכולות לשמש כדי להזריק כל זרם תלוי יונים לתוך נוירון.