Name: תרומה של Na+/ K+ משאבה להתפוצצות קצבית, נחקרת עם דוגמנות ניתוחי מהדק דינמיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: חקור את תפקיד משאבת Na+/K+ וזרם Na+ מתמשך בנוירוני לב של עלוקה באמצעות טכניקת dynamic clamp. מחקר זה מספק תובנות לגבי השפעת זרמים יוניים על פעילות נוירונלית וקצביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לכריסטיאן ארקסלבן על ניסויי מלחציים דינמיים ראשוניים על נוירונים HN(7) שהדגימו את יכולותיהם המתפוצצות. אנג'לה ונינג סייעה לניסויים בעצות מומחים. אנו מכירים NIH למימון עבודה זו באמצעות גרנט 1 R21 NS11355 ל- GSC ו- RLC.

הערה: נושאים ניסיוניים בעלי חיים לא חולייתיים אינם מוסדרים על ידי האוניברסיטאות NIH או אמורי וג'ורג'יה. בכל זאת ננקטו כל האמצעים כדי למזער את סבל העלוקות המשמשות בעבודה זו.
1. הכן גנגליון מבודד 7 מחבל העצבים העלוקה
<ol><li>שמור על עלוקות Hirudo ורבנה במי בריכה מלאכותיים (המכילים 0.05% w /v של מלח ים) מדולל במים דה מיוננים ב 16 °C (על מחזור 12:12 אור כהה.</li>
	<li>הכן את העלוקות לניתוח על ידי קר-anesthizing אותם במיטה של קרח כתוש במשך &gt;10 דקות עד immobile.</li>
	<li>מלאו צלחת ניתוח שחורה מרופד שרף לעומק של כ-1 ס"מ עם תמיסת מלח צוננת המכילה 115 מ"מ NaCl, 4 מ"מ KCl, 1.7 מ"מ CaCl2, 10 מ"מ D-גלוקוז, ו-10 מ"מ HEPES במים נטולי יינון; pH מותאם ל 7.4 עם 1 M NaOH. מצמידים את צד העלוקה לתא מצופה השרף השחור (לפחות 20 ס"מ על 10 ס"מ עם עומק של לפחות 2 ס"מ מעל השרף בעובי של לפחות 2 ס"מ).</li>
	<li>תחת סטרומיקרוסקופ בהגדלה של פי 20 עם תאורת מדריך אור עקשני, בצע חתך אורך של לפחות 3 ס"מ עם מספריים קפיציים 5 מ"מ דרך דופן הגוף בחלק 1/3של הגוף. השתמש סיכות כדי למשוך הצידה את דופן הגוף ולחשוף את האיברים הפנימיים. הערה: כל ארוחת דם מאוחסנת ניתן להסיר על ידי שאיבה עם פיפטת פסטר מלוטש אש.</li>
	<li>לבודד גנגליון גוף בינוני בודד 7 (גנגליון פלחוני חופשי שביעי למוח).<ol>
<li>פתח את הסינוס שבו חבל העצבים שוכן באמצעות מספריים קפיציים 5 מ"מ. הקפידו לפצל את הסינוסים באופן שרירי ומשאירים שתי רצועות סינוס. השתמש במלקחיים חדים #5 כדי לעזור להנחות את החיתוך ולהחזיק את הסינוס.</li>
		<li>שמור את הסינוס מחובר לכל אחד משני שורשי העצבים הדו-צדדיים שיוצאים מן הגנגליון (הוא דבק בחוזקה לכל שורש) כדי להשתמש ברצועות אלה של סינוס להצמדת הגנגליון.</li>
		<li>הסר את הגנגליון מהגוף על ידי חיתוך חבילות עצב החיבור rostral ו caudal המקשרות את הגרעינים (רחוק מןהגנגליון 7 ככל האפשר) ואת רצועות הסינוס, ולאחר מכן לחתוך את השורשים לרוחב למקום שבו הם מגיחים מן הסינוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הצמידו את הגנגליון (באמצעות מלקחיים ישנים קהים מס '5) עם סיכות חרקים מקוצרות, בצד הגחון למעלה, בצלחות פטרי ברורות ומרופדים בשרף. הכנס סיכות ברצועות של סינוס ורקמות רופפות דבקות בשורשים ואת חיבורי rostral ו caudal, רחוק ככל האפשר מן הגנגליון. הערה: השרף חייב להיות לא עבה יותר מ 3 מ"מ אם תאורה טובה מלמטה הוא להיות מושגת במהלך ההקלטה. ודאו שההנגליון מתוח, הן לאורך והן לרוחב.</li>
	<li>הגדל את ההגדלה של סטריאומיקרוסקופ ל 40x או יותר, ולהתאים את התאורה האלקטורלית כך שגופי התא העצבי ניתן לראות בקלות על פני השטח הגחון של הגנגליון ממש מתחת פרינוריום.</li>
	<li>הסר את פרינוריום של הגנגליון (desheath) עם מיקרו-סיטסיטורים.<ol>
<li>התחל את desheathing על ידי חיתוך נדן רופף בין השורשים בצד אחד, ולהמשיך את החתך לרוחב לצד השני, הקפד לשמור על להבי המספריים שטחי ולא לפגוע בגופי התא העצבי ישירות מתחת נדן.</li>
		<li>לעשות חתך שטחי דומה caudally מן החתך לרוחב לאורך קו האמצע.</li>
		<li>עכשיו לתפוס את דש caudolateral של נדן בצד אחד עם מלקחיים #5 בסדר, למשוך אותו מן הגנגליון, ולחתוך אותו עם microscissors.</li>
		<li>חזור על הפעולה בצד השני; הליך זה חושף את שני הנוירונים HN(7) להקלטה עם microelectrodes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מניחים את צלחת ההכנה במערך ההקלטה, ומניחים עם תמיסת מלח בקצב זרימה של 5 מ"ל / דקה בטמפרטורת החדר.</li>
</ol>2. לזהות ולהקליט אינטראורונים לב עלוקה עם מיקרואלקטרודים חדים
<ol><li>למשך ההקלטה של נוירון HN(7) (הקלטות נמשכות בין 30 ל -60 דקות), לרכוש ודיגיטציה את עקבות הזרם התאי והמתח מדגם אלקטרומטר נוירופיזיולוגי בקצב של 5 kHz עם רכישת נתונים דיגיטליים (אנלוגי לדיגיטל, A עד D) וגירוי (דיגיטלי לאנלוגי, D עד A) מערכת, ולהציג על מסך מחשב. הערה: ניתן להשתמש בכל תוכנה מסחרית או מותאמת אישית ולוח A עד D ל- A לרכישת נתונים (A עד D). D עד A ותוכנה שנבנתה בהתאמה אישית נדרשות עבור מהדק דינמי.</li>
	<li>תחת סטרומיקרוסקופ ב 50-100x עם תאורת שדה כהה מלמטה, לזהות באופן זמני נוירון HN(7) של הזוג הדו צדדי על ידי מיקומו הקנוני בעמדה posteriolateral בגנגליון באמצע גוף שבע.</li>
	<li>כעת שואפים לחדור את הנוירון HN(7) putative עם microelectrode חד מלא 2 M אשלגן אצטט ו 20 mM KCl באמצעות מיקרומניפולטור.<ol>
<li>הנח את המיקרו-קטרוד קרוב מאוד לגוף תא המטרה.</li>
		<li>בחן ללא הרף את הפוטנציאל המוקלט עם האלקטרומטר, והגדר את הפוטנציאל הזה לאפס mV לפני החדירה לנוירונים.</li>
		<li>לחדור את הנוירון עם microelectrode, על ידי נהיגה איטית האלקטרודה לאורך ציר ארוך שלה עם המניפולטור. באמצעות פונקציית זמזום אלקטרומטר, להגדיר את משך זמזום 100 ms, עד שינוי שלילי בפוטנציאל הממברנה ופעילות spiking נמרצת הוא ציין.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הגדר את האלקטרומטר במצב מהדק זרם רצסיבי (DCC) ≥ 3 kHz כדי לתעד בו זמנית את פוטנציאל הממברנה ולעבור זרם עם microelectrode יחיד (פיצוי קיבולת מוגדר רק מתחת לצלצול ולאחר מכן חייג בחזרה 10%).<ol>
<li>לפקח על ההתיישבות של האלקטרודה במהלך DCC על אוסצילוסקופ.</li>
		<li>הזרק זרם קבוע של -0.1 nA עם מזרק זרם קבוע אלקטרומטר במשך דקה או שתיים כדי לייצב את ההקלטה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>זהה בוודאות את הנוירון HN(7) לפי צורת הספייק האופיינית לו ופעילות מתפרצת חלשה (איור 1Ci).</li>
	<li>בצע כל ניתוח נתונים במצב לא מקוון לאחר השלמת הניסוי ושמור את כל הנתונים בדיסק.</li>
</ol>3. לבנות HN בזמן אמת או נוירון מודל אחר
<ol><li>בנה תוכנה מותאמת אישית באמצעות לוח עיבוד אותות דיגיטלי (DSB; D עד A ו- A עד D) במחשב שולחני כדי ליישם בזמן אמת את זרמי המודל המתוארים בזרמי מודל2,4 או שונים עבור נוירונים או ניסויים אחרים.<ol>
<li>השתמש משוואות בסגנון הודג'קין-האקסלי מכיוון שהן השיטה המועדפת בדרך כלל לייצוג זרמי דגם.</li>
		<li>ראה7 לקבלת תיאור מפורט של היישום של מודל HN בזמן אמת ומהדק דינמי לפני הוספת זרם המשאבה. עיין בסעיף המבוא לתיאור הזרמים, ריכוז Na+ תאיים, ומוליכות של נוירון HN(7) חי במודל HN.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ליישם ולגוון מוליכות/זרמים דינמיים
<ol><li>השתמש בתוכנת הידוק דינמי שנבנתה בהתאמה אישית עבור ה- DSB כדי ליישם ולשנות בזמן אמת מהדק כל ממשק משתמש גרפי (איור 3) (GUI) מוליכות מתוכנתות וזרמים של מודל HN בזמן אמת של הנוירון HN(7). הערה: כתזכורת, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> והם ההולכה המקסימלית של זרם Na+ המתמשך (IP) וזרם המשאבה המקסימלי (אנימשאבה), בהתאמה.</li>
	<li>השתמש בתיבות הזנת GUI בתוכנה כדי לבצע שינויים, כאשר המודל פועל, בתיבה <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> (PumpMaxL) ו <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> -(GpinHNLive) (איור 3). הערה: תיבות הקלט של GUI מקבלות ערכים מוקלדים, ושלבים של 0.1 nA מומלצים עבור <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> ושלבים של 1 nS מומלצים עבור <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> .<ol>
<li>הוסף כמויות קטנות של <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> ועם מהדק דינמי כדי לייצב את פרץ של נוירון HN(7), אשר נחלש על ידי דליפה המושרה microelectrode, כפי שמוצג באיור 1Cii. הערה: חדירת מיקרו-ectרודe גורמת לנזק בממברנה המתבטא כמוליכת דליפה מוגברת או ירידה בהתנגדות לקלט.</li>
		<li>התחל על ידי הוספת <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> ערך של 0.1-0.2 nA, אשר מפצה על הדליפה הנגרמת microelectrode, אבל מדכא עירור, ולאחר מכן להגדיל בהדרגה <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> , אשר מגביר את העירור, עד מתפרץ רגיל מתפתח, בדרך כלל ב ~ <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> 1-4 nS (איור 4A).</li>
	</ol></li>
	<li>באופן שיטתי לשנות זרמים אלה (במרווחים של 0.1 nA עבור <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> ו 1 nS עבור <img alt="Equation 17" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> ) כדי נוירון HN(7) המוקלט עם מהדק דינמי (איור 3), ולהעריך את ההשפעות שלהם על מאפייני פרץ: תדירות ספייק (ו: ההדדיות של הממוצע של מרווח interspike במהלך פרץ), מרווח interburst (IBI: הזמן בין העלייה האחרונה בפרץ אחד לספייק הראשון בפרץ הבא), משך ההתפרצות (BD: הזמן בין העלייה הראשונה בפרץ לבין העלייה האחרונה בפרץ), ותקופת פרץ (T: הזמן בין העלייה הראשונה בפרץ לבין העלייה הראשונה בפרץ הבא).<ol>
<li>לשנות את הערכים של <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> , <img alt="Equation 19" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> כמו בהדגמת הווידאו, כדי להכיר את הטכניקה ולאחר מכן לצאת החוצה.<ol>
<li>החזק <img alt="Equation 20" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> בערך קבוע מסוים וטאטא בהפרשים קבועים של 1 nS על-פני טווח של <img alt="Equation 21" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> פעילות מתפרצת רגילה תומכת.</li>
			<li>כעת הגדל את הערך הקבוע של <img alt="Equation 22" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> 0.1 nA ושוב לטאטא על מגוון של <img alt="Equation 23" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> פעילות מתפרצת רגילה תומכת.</li>
			<li>עבור כל זוג פרמטרים מיושם, לאסוף נתונים המכילים לפחות 8 התפרצויות כך שניתן יהיה לבצע מדדים ממוצעים אמינים של f, IBI, BD ו- T.</li>
			<li>המשך עם גורפים כל עוד הנוירון נשאר בר קיימא, כפי שהוערך על ידי spiking חזק ופוטנציאל בסיסי יציב של תנודה.</li>
			<li>אסוף נתונים ממספר נוירונים (מבעלי חיים שונים) כדי ליצור גרף מורכב(איור 5).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Cymbalyuk, G. S., Gaudry, Q., Masino, M. A., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursting+in+leech+heart+interneurons%3A+cell-autonomous+and+network-based+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Bursting in leech heart interneurons: cell-autonomous and network-based mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 22, 10580-10592 (2002).</li>
<li>Hill, A. A., Lu, J., Masino, M. A., Olsen, O. H., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+a+segmental+oscillator+in+the+leech+heartbeat+neuronal+network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A model of a segmental oscillator in the leech heartbeat neuronal network.</a> Journal of Computational Neuroscience. 10, 281-302 (2001).</li>
<li>Tobin, A. E., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myomodulin+increases+Ih+and+inhibits+the+NA%2FK+pump+to+modulate+bursting+in+leech+heart+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Myomodulin increases Ih and inhibits the NA/K pump to modulate bursting in leech heart interneurons.</a> Journal of Neurophysiology. 94, 3938-3950 (2005).</li>
<li>Kueh, D., Barnett, W. H., Cymbalyuk, G. S., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%28%2B%29%2FK%28%2B%29+pump+interacts+with+the+h-current+to+control+bursting+activity+in+central+pattern+generator+neurons+of+leeches%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Na(+)/K(+) pump interacts with the h-current to control bursting activity in central pattern generator neurons of leeches.</a> eLife. 5, 19322(2016).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clamp%3A+computer-generated+conductances+in+real+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).</li>
<li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).</li>
<li>Barnett, W., Cymbalyuk, G. Hybrid systems analysis: real-time systems for design and prototyping of neural interfaces and prostheses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarnett%2C+W+%22Biohybrid+systems%3A+nerves%2C+interfaces%2C+and+machines%22">Biohybrid systems: nerves, interfaces, and machines</a>. Jung, R. , Wiley VCH Verlag. Weinheim. 115-138 (2011).</li>
<li>Sorensen, M., DeWeerth, S., Cymbalyuk, G., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+hybrid+neural+system+to+reveal+regulation+of+neuronal+network+activity+by+an+intrinsic+current%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Using a hybrid neural system to reveal regulation of neuronal network activity by an intrinsic current.</a> Journal of Neuroscience. 24, 5427-5438 (2004).</li>
<li>Olypher, A., Cymbalyuk, G., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+systems+analysis+of+the+control+of+burst+duration+by+low-voltage-activated+calcium+current+in+leech+heart+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Hybrid systems analysis of the control of burst duration by low-voltage-activated calcium current in leech heart interneurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 2857-2867 (2006).</li>
<li>Calabrese, R. L., Prinz, A. A. Realistic modeling of small neuronal networks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCalabrese%2C+RL+%22Computational+Modeling+Methods+for+Neuroscientists%22">Computational Modeling Methods for Neuroscientists</a>. DeSchutter, E. , MIT Press. MA, USA. 285-316 (2010).</li>
<li>Rybak, I. A., Molkov, Y. I., Jasinski, P. E., Shevtsova, N. A., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+bursting+in+the+pre-B%C3%B6tzinger+complex%3A+mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Rhythmic bursting in the pre-Bötzinger complex: mechanisms and models.</a> Progress in Brain Research. 209, 1-23 (2014).</li>
<li>Picton, L. D., Nascimento, F., Broadhead, M. J., Sillar, K. T., Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+pumps+mediate+activity-dependent+changes+in+mammalian+motor+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sodium pumps mediate activity-dependent changes in mammalian motor networks.</a> Journal of Neuroscience. 37, 906-921 (2017).</li>
</ol>

מידול, מהדק דינמי והניתוחים המתקבלים שהם מאפשרים הם טכניקות שימושיות לחקר האופן שבו יחידים וקבוצות של מוליכות/זרמים יוניים תורמים לפעילות החשמלית של תאי העצב (איור 1, איור 2,איור 4 ואיור 5). השימוש בטכניקות אלה מראה כיצד זרם Na+/K+ pump (Ipump) מקיים אינטראקציה עם זרמים מגודרים במתח, במיוחד זרם Na+ המתמשך (IP), כדי לקדם התפרצות חזקה ב- HNs הליבה של מחולל פעימות הלב של עלוקה. על ידי שילוב של ניסויי מלחציים דינמיים ודוגמנות, ניתן לבחון מודלים באופן ישיר יותר מהאפשרי עם הקלטת מתח רגילה וטכניקות מהדק זרם. התוצאות שנאספו מניסויי המלחציים הדינמיים (איור 5) ישמשו כדי לחדד עוד יותר את מודל ה-HN. השיטה הבסיסית של הידוק דינמי המודגם כאן ניתן להתאים אישית כדי לשקף את המאפיינים של כל נוירון תחת מחקר אם מודל מתמטי של זרמים עצביים ניתן לקבוע עם ניסויי מלחצי מתח.
השלמה מוצלחת של הניסויים מהסוג המוצג כאן דורשת שיפוד זהיר של HN או נוירון אחר בעת שימוש במיקרואלקטרודה חדה, מכיוון שהתפרצות חזקה מצטמצמת על ידי חדירת אלקטרודה1. (טכניקות הקלטה של תיקון תאים שלמים, אשר ממזערות את הדליפה שהוצגה, חלות גם על נוירונים אחרים, אך אינן פועלות היטב על נוירונים עלוקה.) זה קריטי כי שיגור של נוירון HN גורם נזק מינימלי הנוירון (דליפה נוספת), והתנגדות קלט צריך להיות במעקב חייב להיות בטווח של 60-100 MOhms לניסויים מוצלחים4.
מהדק דינמי הוא טכניקה רבת עוצמה, אבל יש לו מגבלות שהוטלו על ידי גיאומטריה עצבית כי מוליכות מלאכותיות מיושמות באתר של אלקטרודה הקלטה - בדרך כלל גוף התא - לא באתר שבו זרמים יוצרי קצב הם בדרך כללמקומיים 5,6,10. בנוירונים HN עלוקה, גוף התא קרוב חשמלית לאזור האינטגרציה (נוריט עיקרי) של הנוירון שבו רוב הזרמים הפעילים הם מקומיים, קוצים מופעלים.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61473">Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses</a>. An author name was updated.
The&#160;name of the first author was updated from:
Ricardo Javier Erazo Toscano
to:
Ricardo Javier Erazo-Toscano

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61473">Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses</a>. An author name was updated.

Erratum: Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses

פעימות לב בעלוקות מונעות על ידי CPG המורכב מ-9 זוגות דו-צדדיים של אינטראורונים לב (HNs) המופצים על פני גרעינים מגזריים בינוניים רבים. בליבת ה-CPG נמצאים זוגות מעכבים הדדית של אינטראורונים הממוקמים בגרעיניהחלק השלישי וה-4 המהווים מתנדים חצי-מרכזיים (HCOs)(איור 1A). נוירונים אלה ממשיכים להתפוצץ כאשר מבודדים באופן סינפטי באמצעות bicuculline1. אחרים, כגון הזוג בגרעיניהמגזרי 7 (המוקד של פרוטוקול זה), הם גם מתפרצים, המסוגלים לייצר פעילות מתפרצת כאשר מבודדים באופן סינפטי. הם אינם מחוברים זה לזה ומקבלים רק קלט יורד, ולכן מבודדים בקלות על ידי ניתוק הגנגליון משאר חוט העצבים. פעילות מתפרצת עצמאית זו רגישה לזרם הדליפה שהוכנס שנגרם על ידי חדירה עם מיקרו-ectrodes חד להקלטה אך מתפוצצת במרץ כאשר היא מוקלטת בשיטות תיקון רופף1.
הן נוירוני HN בודדים והן HN HCOs עוצבו (מודלים של תא איזופוטנציאלי יחיד מבוסס הודג'קין-האקסלי של נוירוני HN המכילים את כל הזרמים המגודרים והסינפטיים שזוהו באופן ניסיוני), וכל מאפייני הפרץ של המערכת החיה נתפסו בהצלחה2. מיומודולין, נוירופפטיד אנדוגני בעלוקות, מקטין באופן משמעותי את התקופה (T) של קצב הפרץ של נוירונים HN מבודדים ו- HN HCOs. אפנון זה פועל כדי להגדיל את זרם h (היפר-קוטביות מופעל זרם פנימה, אניh) כדי להקטין אנימשאבה3. תצפית זו הובילה לחקירה של איך אנימשאבה אינטראקציה עם Ih, וכיצד אפנון המשותף שלהם תורם לפעילות הקצבית של נוירונים HN. הפעלת המשאבה על ידי הגדלת [Na+]i (באמצעות מונסין ionophore) מאיצה את קצב פרץ HN הן HCOs HN נוירונים HN מבודדים4. האצה זו הייתה תלויה ב- ih. כאשר נחסמתי (2 מ"מ צלז צלזיון+), תקופת הפרץ לא שונתה בשיטה זו של הפעלת המשאבה; עם זאת, משך הפרץ (BD) צומצם, ומרווח הבין-גזעי (IBI) גדל הן ב- HN HCOs והן בנוירונים מבודדיםHN 4.
עבור פרוטוקול זה, כל הזרמים של נוירון HN(7) חי, כולל זרם המשאבה, אנימשאבה, משולבים במודל HN כדלקמן:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq01v2.jpg"> (1)
כאשר C הוא קיבוליות הממברנה (ב- nF), V הוא פוטנציאל הממברנה (ב- V), t הוא זמן (ב s). תיאורים ומשוואות זרם יוני מפורטים תוארו במקום אחר2,4. נוירון הדגם המלא של דגם HN פועל בזמן אמת(איור 2). התוכנה תהיה זמינה על GitHub עם הפרסום ויהיה מתאים לרוץ על לוח עיבוד האות הדיגיטלי המתואר בטבלת החומרים. כאן, מוקד החקירה הוא זרם Na+/ K+ משאבה (אנימשאבה) ואת הזרמים מגודר מתח תורם משמעותי Na+ שטף: זרם Na+ מהיר (INa) ו זרם Na+ מתמשך (IP). ההולכות המקסימליות של זרמים אלה הן <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq1a.jpg"> <img alt="Equation 1b" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq1b.jpg"> בהתאמה. Na+/ K+ משאבה מחליף שלושה Na תאי+ יונים עבור שני K חוץ תאי+ יונים, ובכך לייצר זרם חיצוני נטו. חשוב לציין, הוא שואב 3 פעמים Na+ מתוך הנוירון כפי שזרם זה מציין, אשר חשוב לחישוב Naתאי + ריכוז.
זרם המשאבה Na+/K+ תלוי בריכוזים תאיים של Na+ והוא בא לידי ביטוי על ידי הפונקציה הסיגמוידלית הבאה:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq02.jpg"> (2)
כאשר [Na]i הוא נה תאי+ ריכוז, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> הוא מקסימום Na+/ K+ משאבה הנוכחי, [Na]ih הוא נה תאי+ ריכוז עבור חצי הפעלה של Na+/ K+ משאבה, ו [Na]הוא הרגישות של Na+/ K+ משאבה ל [Na]i. [Na]אני בונה כתוצאה של Na+ זרם נישא על ידי IP ואני Na והוא פחת על ידי Na+ שפכים של Na+/ K+ משאבה. התרומה של Ih ואנידולף סך Na+ שטף הוא קטן ולא נחשב במודל בזמן אמת.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq03.jpg"> (3)
שבו, v הוא הנפח (~ 6.7 pL) של המאגר Na+ תאי תאי, F הוא הקבוע של פאראדיי, ואת נה+ ריכוז חוץ תאי נשמר קבוע.
מוליכות מגודרות מתח ודליפות הובחנו - אלה מגיבים לפוטנציאל הממברנה - מזרם המשאבה, המוסדר על ידי ריכוז Na+ תאי מחושב ([Na+]i). [נה+] i בנוי דרך Na+ כניסה באמצעות זרם Na+ מהיר (INa) המייצר פוטנציאל פעולה (קוצים) ואת זרם Na+ מתמשך (IP) המספק את depolarization כדי לתמוך spiking. [נה+] אני, בתורו, מופחת על ידי הפעולה של המשאבה דרך שחול של Na+. ערכי HN חיים בסיסיים של <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> (5nS) ו <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgna.jpg"> - (150 nS) הונחו, ואנו לוקחים בחשבון כל מהדק דינמי נוסף <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> .
מטרת הפרוטוקול המתואר כאן היא לתמרן אנילשאוב בדיוק והפכה בזמן אמת כדי לגלות כיצד הוא אינטראקציה עם זרמים מגודרים מתח (זרם Na+ מתמשך בפרוטוקול הנוכחי) כדי לשלוט פרץ קצבי ב- HNs יחיד. כדי להשיג מטרה זו, נעשה שימוש במצדק דינמי, אשר מציג באופן מלאכותי, על הפקודה, כמות מדויקת של כל זרם שניתן לחשב כמו המודל פועל. לשיטה זו יש יתרונות על פני מניפולציה פרמקולוגית של המשאבה, המשפיעה על הרקמה כולה, יכול להיות השפעות מחוץ למטרה כי הם לעתים קרובות קשה להפוך, ולא ניתן מניפולציה מדויקת. מהדק דינמי5,6 קורא את המתח של נוירון מוקלט בזמן אמת ( איור1B) ומחשב ומזריק, בזמן אמת, את כמות כל זרם המבוסס על משוואות מודל ואת הערכים שנקבעו של כל <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgx.jpg"> או <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> . שיטות דומות ניתן ליישם בקלות על כל נוירון שניתן להקליט תאיים. עם זאת, פרמטרים יצטרכו להיות rescaled הנוירון שנבחר, ואת הנוירון צריך להיות מבודד תשומות סינפטיות, למשל, פרמקולוגית.

<table><tbody><tr><td><חזק>בעלי חיים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><הם>Hirudo verbana</td><td>Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches</td><td></td><td>עלוקות חיות 2-3 גרם</td></tr><tr><td><חזקות>כימיקלים</חזקות></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מי</td><td></td><td></td><td></td>בריכה מלאכותיים</tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670-100G</td><td>1.8 מ"מ הוסף אחרון לאחר התאמת</td></tr><tr><td>pH גלוקוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G7021-100G</td><td>10 מ"מ</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>H4034-100G</td><td>10 מ"מ</td></tr><tr><td>אינסטנט אוקיינוס (מלח ים)</td> <td>ספקטרום מותגים בע"מ, מדיסון, ויסקונסין</td><td></td><td>0.05% (w/v) מדולל במים נטולי יונים</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td>4 מ"מ</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S7653-250G</td><td>115 מ"מ</td></tr><tr><td>NaOH 0.1 N תמיסה</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>2105-50 מ"ל</td><td>התאם ל-pH 7.4 עם NaOH</td></tr><<tr><td>חזק>מיקרואלקטרודות</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K אצטט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P1190-100G</td><td>2 מ</td></tr><tr><td>'KCl</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P9333-500G</td><td>20 מ"מ</td></tr><tr><td>מלח</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#5 מלקחיים</td><td>כלים מדעיים עדינים Dumont</td><td>11251-30 OR 11251-20</td><td>לדיסקציה כללית של עלוקה</td></tr><tr><td>AxoClamp 2A/2B DCC אלקטרומטר</td><td>מכשירי אקסון התקנים מולקולריים</td><td>2A/2B</td><td>לרישום פוטנציאל הממברנה העצבית ומהדק זרם לא רציף</td></tr><tr><td>שרף שחור</td><td>Dow Sylguard</td><td>170</td><td>קווים כללי צלחת ניתוח</td></tr><tr><td>זכוכית קפילרית קוטר חיצוני 1 מ"מ, קוטר פנימי 0.75 מ"מ</td><td>מערכות A-M</td><td>615000</td><td>לייצור מיקרואלקטרודות חדות</td></tr><tr><td>שרף שקוף</td><td>Dow Sylguard</td><td>184</td><td>קווים צלחת פטרי המשמשת להרכבת גנגליון לאלקטרופיזיולוגיה</td></tr><tr><td>מעבה שדה כהה</td><td>ניקון</td><td>יבש 0.95-0.80 MBL 1210</td><td>להארת הכנת הגנגליון במהלך חדירת התא</td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Axon CNS התקנים מולקולריים</td><td>1440A</td><td>מבצע A עד D ו-D עד A לרכישת נתונים וגירוי במהלך אלקטרופיזיולוגיה</td></tr><tr><td>לוח עיבוד אותות דיגיטלי</td><td>dSpace</td><td>CLP1104</td><td>התוכנה שלנו מיישמת את כל המוליכות/זרמים בנוירון HN המודל שלנו על לוח בקר DS1103 dSPACE PPC בזמן אמת בקצב של 20 קילו-הרץ עם ממשק משתמש גרפי של ControlDesk (dSPACE, פאדרבורן, גרמניה)9.&nbsp;</td></tr><tr><td>Falming/Brown Microelectrode Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>לייצור מיקרואלקטרודות חדות</td></tr><tr><td>Fiber-Lite תאורה בעוצמה גבוהה</td><td>דולן ג'נר תעשיות</td><td>170D</td><td>להארת הדיסקציה הכללית ולהארת הכנת הגנגליון במהלך החדרת תאים</td></tr><tr><td>מגבר Headstage עבור AxoClamp 2A</td><td>Axon Instruments</td><td>HS-2A רווח: 0.1LU</td><td>כעת חלק מהתקנים מולקולריים לרישום פוטנציאל הממברנה העצבית ומהדק זרם לא רציף</td></tr><tr><td>מדריך אור</td><td>דולן ג'נר תעשיות</td><td>Rev R 38 08 3729107</td><td>להארת הדיסקציה הכללית ולהארת הכנת הגנגליון במהלך חדירת התא</td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-385</td><td>מיקרומניפולטור להטמעת תאים עם מיקרואלקטרודות</td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור בקר</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td>שולט במיקרומניפולטורים להטמעת תאים עם מיקרואלקטרודות</td></tr><tr><td>סיכות Minuten</td><td>BioQuip</td><td>קוטר 0.15 מ"מ 1208SA</td><td>יש לקצר על ידי קיצור ל ~5 מ"מ</td></tr><tr><td>לוח לחם אופטי 3 'x 5' x 8 אינץ'</td> <td>ניופורט</td><td>מיושן</td><td>עם 4 המבודדים הפנאומטיים שלהלן המשמשים לבניית סביבת עבודה נטולת רעידות לאלקטרופיזיולוגיה</td></tr><tr><td>אוסצילוסקופ</td><td>HAMEG Instruments</td><td>HM303-6</td><td>לניטור יציבות אלקטרודות במהלך DCC</td></tr><tr><td>מספריים קפיציים של Pascheff-Wolff</td><td>Moria</td><td></td><td>מסופק על ידי Fine Science Tools (פוסטר סיטי, קליפורניה) קטלוג # 15371-92</td></tr><tr><td>pClamp 9 Software</td><td>Axon Instruments</td><td>9</td><td>כעת חלק מ-Moleculear Devices משתמש ב-Digidata 1440 לרכישת נתונים וגירוי במהלך אלקטרופיזיולוגיה</td></tr><tr><td>מבודדים פנאומטיים 28"</td><td>ניופורט</td><td>מיושנת</td><td>עם לוח אב-טיפוס אופטי המשמש לבניית סביבת עבודה נטולת רעידות לאלקטרופיזיולוגיה</td></tr><tr><td>תוכנת Simulink / MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2006 (מיושן)</td> <td>מיישם מהדק דינמי על לוח עיבוד האותות הדיגיטלי</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Wild</td><td>M5A</td><td>10x חלקי עיניים המשמשים לניתוח העלוקה והסרה והסרת גנגליונים</td></tr><tr><td>סטרומיקרוסקופ</td><td>Wild</td><td>M5</td><td>20x חלקי עיניים המשמשים בתחנה אלקטרופיזיולוגית להדמיית נוירון לחדירת מיקרואלקטרודות</td></tr><tr><td>סטודנט ואנאס מספריים אביב</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>91500-09</td><td>לדיסקציה כללית של עלוקה</td></tr></tbody></table>

תרומה של na+/ k+ משאבה להתפוצצות קצבית, נחקרת עם דוגמנות ניתוחי מהדק דינמיים

Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses

משאבת Na+/ K+ , הנחשבת לעתים קרובות כפונקציית רקע בפעילות העצבית, תורמת זרם חיצוני (Ipump) המגיב לריכוז הפנימי של Na+ ([Na+]i). בנוירונים מתפוצצים, כגון אלה שנמצאו ברשתות עצביות של מחולל דפוסים מרכזי (CPG) המייצרות תנועות קצביות, ניתן לצפות שמשאבתה- I [Na+] ולכן משאבת I תשתנה לאורך מחזור ההתפרצות. היענות זו לפעילות חשמלית, בשילוב עם עצמאות מפוטנציאל הממברנה, מעניקה לימשאבה עם תכונות דינמיות שאינן נפוצות בזרמים מבוססי ערוץ (למשל, ערוצי מתח או משדר מגודרים או דליפה). יתר על כן, בנוירונים רבים, פעילות המשאבה מווסתתת על ידי מגוון של אפננים, מה שמרחיב עוד יותר את התפקיד הפוטנציאלי של אנישואב בפעילות מתפרצת קצבית. מאמר זה מראה כיצד להשתמש בשילוב של מודלים ושיטות הידוק דינמיות כדי לקבוע כיצד אנימשאבה ואת האינטראקציה שלה עם Na+ פעילות קצבית השפעה נוכחית מתמשכת ב- CPG. באופן ספציפי, מאמר זה יתמקד בפרוטוקול מהדק דינמי ושיטות מידול חישוביות בלב פנימי של עלוקות רפואיות.

דוגמנות עם תוספת של משאבה4 הביאה את הממצאים הניסיוניים שהוצגו בסעיף המבוא לפוקוס חד יותר והחלה להסביר את מנגנון התפוצצות בסיוע המשאבה. המודל בזמן אמת שהודגם כאן מכוון ( <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgx.jpg"> <img alt="Equation 31" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> ופרמטרים נבחרו) כך שהוא מייצר פעילות קצבית סדירה הנופלת בגבולות הפעילות הרגילה כפי שנצפו בניסויים - f, IBI, BD, T - וממשיך לייצר פעילות כזו כאשר הפרמטרים המופננים למיומודולין <img alt="Equation 32" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> (זרם המשאבה המקסימלי) ו <img alt="Equation 33" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgh.jpg"> (מוליכות מקסימלית של h-זרם) מגוונים או מגוונים במודל. ערכי הפרמטר שנקבעו יכולים לשמש כמדד או ערכת קנונים לניסויי מידול. במקרי מודל אלה, אנישואב מתנדות לאורך מחזור הפרץ כמו [Na+]i סביב רמה בסיסית. אנימשאבה תורמת סיום פרץ במהלך שלב הפרץ, ואת hyperpolarization זה מייצר מפעיל אניh במהלך IBI; שימו לב לרמה המקסימלית של Ih ליד חניכת פרץ(איור 2).
למרות שמודל ה-HN בזמן אמת כולל את כל הזרמים המיושמים2,4 הזמינים להדק דינמי, ההתמקדות כאן הייתה <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> ב- ו- , אשר זמינים לשינויים בזמן שהמודל פועל ב- GUI המהדק הדינמי (איור 3). מהדק דינמי מאפשר לנסיין להוסיף (או להחסיר עם שלילי <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgx.jpg"> או <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> ) כל מוליכות או זרם לתוך נוירון באופן מלאכותי המחקה את המתח והתלות היונית של מוליכות אמיתית או זרם. לכן, ניתן לחקור באופן מלא כיצד מוליכות מסוימת / זרם אינטראקציה עם מוליכות אנדוגני / זרמים בתוך תאים (איור 1). מודל HN בזמן אמת מציין כי זרם Na+ מתמשך (IP) בנוירונים HN תורם הרבה של Na+ ערך משפיע מאוד [Na+]i (איור 2)ולכן, אנימשאבה. מכיוון ש-IP פעילה בפוטנציאל ממברנה שלילי יחסית, היא מתנגדת לכךשאשאוב אפילו במהלך ה-IBI.
תצפיות אלה מצביעות על כך שזה מאלף לחקור אינטראקציות בין <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> נוירונים מבודדים HN עם מהדק דינמי כפי שנדון בעבר8,9,10. ניסויים אלה (מתמשכים) מבוצעים עם הקלטות מיקרו-ectrode חדות בנוירונים בודדים ומבודדים סינפטיים HN(7) (גנגליון שביעי מנותק מחבל העצבים). עד כה, ניסויים אלה מראים כי התפרצות חזקה משוחזרת בנוירונים HN פעילים טוניק (בשל חדירת microelectrode הציג דליפה) על ידי תוספת משותפת של IP ואנימשאבה עם מהדק דינמי(איור 4). זוהי תצפית חשובה המציינת כי מנגנון מתפרץ זמין נוירונים אלה (גם כאשר דליפה נפגעת) הנובעת מהאינטראקציה של משאבת I ו- IP. תוצאות ראשוניות מצביעות על האינטראקציה המורכבת החזקה שלהם, שניתן לחקור במודל ובניסויים (איור 5).
לסיכום, אנישואב בתגובה לעלייה תקופתית ב[Na+]i במהלך פעילות מתפרצת תורם לקצב הפרץ באמצעות סיום פרץ (הפחתת BD). האינטראקציה של IP ואנימשאבה מהווה מנגנון כי הוא מספיק כדי לתמוך פעילות מתפרצת אנדוגני; מנגנון זה יכול להחזיר התפרצות חזקה ב HN interneurons נרשם תאית גנגליון 7. האינטראקציה בין IP ואנילשאוב דרך [Na+]אני משפיע על תקופת פרץ HN באופן לא מונוטוני ומבטיח חוסן של פרץ אוטונומי. מסקנות אלה עולות בקנה אחד עם ניסויים ומידול במערכות חוליות11,12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig01.jpg"> איור 1: פעילות חשמלית של לב עלוקה ויישום של I pump and IP עם מלחציים דינמיים. (A)פעילות מתפרצת רגילה נרשמה בו זמנית, באופן חוץ-תאי (למעלה) ובאופן תאי (למטה), בדופק עלוקה HCO מגנגליון שלישי, סכמטי של הנוירונים המתועדים והקשרים הסינפטיים המעכבים ההדדית שלהם מימין. (B)סכמטי מהדק דינמי בעת הקלטת HN(7) פנימי בגנגליון מבודד 7; הערה אין אינטראקציה סינפטית בין שני HN(7) interneurons. (Ci) מתפוצץ באינטריון HN(7) שנחשף על ידי דליפה. (Cii) פרץ חזק יותר יכול להיות מיוצר על ידי הוספת מהדק דינמי Iמשאבה ( <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> = 0.1 nA), אשר מפצה על הדליפה המושרה microelectrode, אבל מדכא את העירור, ו <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> (1 nS), אשר מגביר את העירור. קווים מקווקווים שחורים מציינים ערכי בסיס. קיצורים: HN = הלב interneuron; HCO = מתנד חצי מרכז; אנימשאבה = זרם כלפי חוץ; IP = נה מתמיד+ זרם; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg">= נה מקסימאלית+/ K+ זרם משאבה; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> = מוליכות מקסימלית של זרם Na+ המתמשך; Vm = פוטנציאל ממברנה; [נה+] i = ריכוז פנימי של Na+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig02.jpg"> איור 2: דגם פנימי יחיד של HN המציג עקבות לפוטנציאל הממברנה (Vm), Ih, Ipump, [Na+]i, ו- IP. זרמים היפרפולריים כלפי חוץ הם שליליים, וזרמים מפורק הם חיוביים. קווים מקווקווים שחורים מציינים ערכי בסיס. קיצורים: HN = הלב interneuron; אנימשאבה = זרם כלפי חוץ; IP = נה מתמיד+ זרם; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg">= נה מקסימאלית+/ K+ זרם משאבה; Ih = היפרפולריזציה מופעל זרם פנימי; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg">= מוליכות מקסימלית של זרם Na+ המתמשך; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgh.jpg"> = מוליכות מקסימלית של זרם פנים המופעל על-ידי היפרפולריזציה; Vm = פוטנציאל ממברנה; [נה+] i = ריכוז פנימי של Na+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig03.jpg"> איור 3: ממשק משתמש גרפי של מודל הלב (HN) בזמן אמת ומהדק דינמי המיושם בלוח עיבוד אותות דיגיטלי. משמאל עליון: תיבות מתמטיקה אדומה הן תיבות פרמטר שנקבעו על-ידי המשתמש עבור המודל בזמן אמת, ואילו תיבות Blue Live הן תיבות פרמטר שנקבעו על-ידי המשתמש המשמשות ב- מהדק הדינאמי. El = פוטנציאל ההיפוך של זרם הדליפה; Gl = מוליכות דליפה; Gh = h-הנוכחי מוליכות מקסימלית; Gp = P מוליכות מקסימלית נוכחית; GCaS = מוליכות מקסימלית זרם סידן איטי; PumpMax = משאבה זרם מקסימלי; [מוליכות סינפטית מקסימלית GSyn2 לנוירונים בהתאמה; סף חציית ספייק ThreshSyn2 לתיווך פוטנציאל סינפטי - אלה המשמשים להכנת מתנד חצי מרכז היברידי (חי / דגם) לא מאויר כאן.]. שמאל תחתון עבור מהדק דינמי. בצד שמאל נמצאים 5 ערכים ממוחשבים של משתני מהדק דינמיים: אנימשאבה = זרם משאבה מוזרק; Ih = h-הנוכחי מוזרק (לא בשימוש כאן); IP = זרם P מוזרק; NaI = מחושב פנימי Na+ ריכוז; ENa = פוטנציאל היפוך נתרן מחושב. שמאל תחתון עבור מהדק דינמי. מימין למשתנים המשושבים יש 6 תיבות פרמטר שנקבעו על ידי המשתמש: GNa = שימוש מרבי בנתרן מלוכסן אנדוגני לחישוב Na+ flux הקשורים לפוטנציאל פעולה; PumpMaxL = זרם משאבה מקסימלי להזרקה על ידי מהדק דינמי; נאי ראה משוואה (2); Gh = מוליכות מקסימלית כדי לקבוע h-זרם להיות מוזרק על ידי מהדק דינמי; Gp = שימוש מוליכות מקסימלית זרם אנדוגני P מניח כדי לחשב Na+ שטף הקשורים זרם P אנדוגני; GpinHNLive = מוליכות מקסימלית כדי לקבוע זרם P להיות מוזרק על ידי מהדק דינמי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig04.jpg"> איור 4: ניתוח מהדק דינמי של פריצה עצמאית של HN(7). עלייה של <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> מ- (A) 4.0 nS ל (B) 9.0 nS מאטה את קצב פרץ HN העצמאי. עקבות ניסיוניות מראות התפרצות קצבית בנוירונים מבודדים HN(7) עם מהדק דינמי. טווחי התנודה של [Na+]i ו- Vm גדלים עם upregulated <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> . עקבות מלמעלה למטה: Vm מוקלט, מוזרק לימשאבה,מחושב [Na+]i,והזריק IP. קווים מקווקווים שחורים מציינים ערכי בסיס. קיצורים: HN = הלב interneuron; אנימשאבה = זרם כלפי חוץ; IP = נה מתמיד+ זרם; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> = נה מקסימאלית+/ K+ זרם משאבה; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> = מוליכות מקסימלית של זרם Na+ המתמשך; Vm = פוטנציאל ממברנה; [נה+] i = ריכוז פנימי של Na+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig05.jpg"> איור 5: ניתוח מהדק דינמי של פריצה עצמאית של HN(7). Upregulation של <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> נוטה להקטין, ואחריו תקופת התפרצות HN מוגברת. בניסויים בודדים (נקודות המחוברות באמצעות קווים) באמצעות מהדק דינמי, <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> ערכים נסחפו <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> בעודם מוחזקים קבועים. צבעים מייצגים רמות קבועות שונות של הוסיף <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> בשימוש בניסויים שונים. קיצורים: HN = הלב interneuron; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> = נה מקסימאלית+/ K+ זרם משאבה; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> = מוליכות מקסימלית של זרם Na+ המתמשך. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

מוצג כאן היא שיטה לחקירה של התפקידים של Na+/ K+ משאבה מתמשכתNa + הנוכחי ineurons לב עלוקה באמצעות מלחציים דינמיים.

תרומה של Na+/ K+ משאבה להתפוצצות קצבית, נחקרת עם דוגמנות ניתוחי מהדק דינמיים

The Na+/K+ pump, often thought of as a background function in neuronal activity, contributes an outward current (Ipump) that responds to the internal ...

הידוק דינמי יכול לשנות או להכניס כל זרם ממברנה לנוירון. אנו מציגים ומשנים את משאבת נתרן אשלגן וזרם נתרן מתמשך לתוך אינטראורון לב חי של עלוקה. שימוש במנורה דינמית מאפשר שליטה מלאה עם הקשה על הדינמיקה והמשרעת של כל זרם שהוכנס לנוירונים בזמן אמת.פיתוח מערכות אינטראקטיביות בזמן אמת כגון המהדק הדינמי מבסס את כל מחקר ה- BMI. כל ההיבטים של המחקרים התאיים על הפעילות החשמלית של נוירונים ורשתות יכולים להפיק תועלת פוטנציאלית משימוש מהדק דינמי. האתגרים העיקריים של טכניקה זו הם פיתוח המודלים בזמן אמת בנוירונים וכיול התאמות התכווצות דינמיות לנוירון שנבחר למחקר.לבידוד של הגנגליון 7 מחבל עצב עלוקה, מלאו צלחת ניתוח קו שרף שחור עם כ-1 ס"מ של תמיסת מלח צוננת בתוספת נתרן כלורי, אשלגן כלורי, סידן כלורי, D-גלוקוז ו- HEPES במים מתובלים והצמידו צד עורי עלוקה מרדים קר למעלה בחדר. השתמש במיקרוסקופ סטריאו בהגדלה של פי 20 עם תאורת מדריך אור עקשני ומספריים קפיציים של חמישה מילימטר כדי לגרום לחתך אורך של לפחות שלושה סנטימטרים דרך דופן הגוף בחלק השלישי של הגוף. השתמש סיכות לפרק את רקמת דופן הגוף כדי לחשוף את האיברים הפנימיים ולשאוב את הדם כדי לקבל תצוגה טובה יותר.לבודד גנגליון גוף בינוני בודד 7. באמצעות מלקחיים חדים מספר חמש כדי לעזור להנחות את החיתוך ולהחזיק את הסינוס, להשתמש במספריים כדי לפתוח את הסינוס שבו נמצא כבל העצבים, תוך דאגה לפצל את הסינוסים בצורה שרירית ובבטן. שמירה על הסינוס מחובר לכל אחד משני שורשי העצבים הדו-צדדיים שיוצאים מן הגנגליון, לחתוך את חבילות עצב החיבור rostral ו caudal כדי להסיר את הגנגליון מהגוף לחתוך את השורשים לרוחב למקום שבו הם יוצאים מן הסינוס.השתמש מלקחיים ישנים קהים מספר חמש כדי לאבטח את רצועות הסינוסים ורקמה רופפת עם סיכות חרקים Minutien מקוצר בצד הגחון למעלה בצלחות פטרי ברורות מרופד שרף. הצמד את החיבורים rostral ו caudal רחוק ככל האפשר גנגליון ולהצמיד את השורשים בבטחה. הגדל את המיקרוסקופ הסטריאו ל- 40X או יותר ולהתאים את התאורה האלחכשפית כך שניתן יהיה לראות בקלות את גופי התא העצבי בצד הגחון של הגנגליון ממש מתחת לפרינוריום.באמצעות מספריים מיקרו, להתחיל לחתוך את נדן peroneal רופף בין השורשים בצד אחד של הגנגליון, המשך החתך לרוחב לצד השני ולוודא לשמור על להב המספריים שטחי מבלי לפגוע בגופי התא העצבי ישירות מתחת נדן. בצע חתך שטחי דומה מהחתך לרוחב לאורך קו האמצע והשתמש במספר 5 מלקחיים דקים כדי למשוך דש רוחבי אחד של נדן מהנגליון בכל פעם כדי לאפשר לכל אחד מהם להיחתך. כאשר שני המדפים הוסרו, שני ההבחנות בלב צריכות להיחשף.מניחים את המנה בהגדרת ההקלטה ומניחים את הדגימה עם תמיסת מלח בקצב זרימה של חמישה מיליליטר לדקה בטמפרטורת החדר. כדי לזהות את האינטראורונים על הגדרת ההקלטה, בחר הגדלה 50 עד 100X עם תאורת שדה כהה להלן ואתר נוירון HN 7 של הזוג הדו-צדדי על ידי מיקומו הקנוני במיקום הקדמי בגנגליון גוף באמצע 7. לאחר מכן, השתמש מניפולטור מיקרו כדי למקם אלקטרודה מיקרו חד מלא עם שני אצטט אשלגן טוחן ו 20 מילימולר אשלגן כלורי מיקרו אלקטרודה קרוב מאוד לגוף תא היעד ולהשתמש אלקטרומטר נוירופיזיולוגי כדי לבחון ברציפות את הפוטנציאל המתועד.הגדר פוטנציאל זה לאפס מיליוולטים ולחדור את הנוירון עם microelectrode באמצעות המניפולטור לנהוג לאט האלקטרודה לאורך הציר הארוך שלה. השתמש בפונקציית זמזום אלקטרומטר 100 אלפיות השנייה עד שינוי שלילי בפוטנציאל הממברנה ופעילות spiking נמרצת הוא ציין. הגדר את האלקטרומטר לשלושה ק"מ לפחות במצב מהדק זרם לא רציאלי כדי לתעד בו זמנית את פוטנציאל הממברנה תוך העברת הזרם לנוירונים.השתמש באוסצילוסקופ כדי לפקח על ההגדרה של האלקטרודה ולהשתמש מזרק זרם יציב כדי להזריק זרם קבוע של מינוס 0.1 ננו-amps במשך 1 עד 2 דקות כדי לייצב את ההקלטה. נוירון HN 7 ניתן לזהות על ידי צורת ספייק אופייני שלה ופעילות מתפרצת חלשה. להולכת מהדק דינמית והטמעה נוכחית, פתח תוכנת מהדק דינמית המותאמת אישית ללוח עיבוד האותות הדיגיטלי.ובזמן שהמודל פועל, הגדר את זרם המשאבה המקסימלי ל- 0.1 עד 0.2 ננו-אמפים והגדיל בהדרגה את ההולכות המרבית של זרם הנתרן המתמשך עד להתפרצות רגילה. באופן שיטתי לשנות זרמים אלה במרווחים של 0.1 ננו-amp עבור הפלט המרבי של זרם המשאבה אחד ננו-קומינסים במרווחים עבור המוליכות המרבית של זרם הנתרן המתמשך ולהעריך את ההשפעות של עליות אלה על תדירות ספייק, מרווח בין התפרצויות, משך פרץ ותקופת פרץ. החזק את המוליכות המקסימלית של זרם הנתרן בערך קבוע מסוים וטאטא במרווחי ננו-ים אחד על פני מגוון זרמי משאבה מקסימליים כדי לתמוך בפעילות מתפרצת סדירה לפני הגדלת הערך הקבוע של מוליכת הנתרן על ידי ננו-קומינס אחד וסוחפת טווח שני של זרמי משאבה מקסימליים.עבור כל זוג פרמטרים מיושם, לאסוף נתונים המכילים לפחות שמונה התפרצויות, כך שניתן לבצע אמצעים ממוצעים אמינים של תדירות הקו החדה, מרווח בין התפרצויות, משך פרץ ותקופת פרץ. לאחר מכן לאסוף נתונים ממספר נוירונים נוספים כפי שהוכח רק כדי ליצור גרף מורכב. באמצעות מודל זה, זרם המשאבה החיצונית מתנדנד לאורך מחזור הפרץ כריכוז פנימי של נתרן סביב רמה בסיסית.זרם משאבה זה תורם לסיום פרץ במהלך שלב ההתפרצות. היפרפולריזציה המיוצרת על ידי זרם המשאבה מפעילה היפר קוטביות מופעלת זרם פנימה במהלך מרווח בין התפרצויות. מודל האינטראורון של הלב בזמן אמת מצביע על כך שזרם הנתרן המתמשך באינטראורונים לב תורם לחלק גדול מכניסת הנתרן המשפיעה מאוד על הריכוז הפנימי של הנתרן ובכך על זרם המשאבה.מכיוון שזרם הנתרן המתמשך פעיל בפוטנציאל ממברנה שלילי יחסית, הוא מתנגד לזרם המשאבה הן במרווחי הפרץ והן במרווחי פרץ. כפי שניתן להמחיש, התפרצות חזקה משוחזרת באינטראורונים פעילים טוניק על ידי תוספת משותפת של זרמי משאבת נתרן ונתרן אשלגן מתמשך עם מלחציים דינמיים. תוצאות ראשוניות מצביעות על אינטראקציה מורכבת חזקה בין שני הזרמים, אשר ניתן לחקור עוד יותר באמצעות המודל.ניסוי מוצלח תלוי בהתפרקות הטובה של הגנגליון ובנהיגה מכוונת בקפידה, חדירה וזמזום של המיקרו-קטרוד. אנו מעצימים את המלחציים הדינמיים על ידי יישום זרם משאבה תלוי נתרן המחושב על ידי הערכת הריכוז התאי של יון. הערכות כאלה יכולות לשמש כדי להזריק כל זרם תלוי יונים לתוך נוירון.

contribution-na-k-pump-to-rhythmic-bursting-explored-with-modeling

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה וידאו מדגים את ההגדרה, את ההליכים לתיקון גופי תא וכיצד ליישם את הקלטות מהדק דינמיות מתאי הגנגליון בכל הר עכבר רשתיות. טכניקה זו מאפשרת החקירה של התרומה המדויקת של תשומות סינפטיים מעוררות ומעכבות, ואת העצמה היחסית והעיתוי שלהם לspiking העצבי.

יישום קלאמפ דינמי עם Conductances Synaptic ומלאכותי בתאי עכבר גנגליון רשתית

כימות של פונקציה הדיאסטולי הגלובלית מדויקת, המבוסס על סיבתיות הושגה על ידי ניתוח המבוסס על המודלים kinematic של זרימת transmitral באמצעות הדיאסטולי Parametrized מילוי פורמליזם (PDF). PDF יוצר נוקשות, הרפיה, ופרמטרי עומס ייחודיים ומבהיר פיזיולוגיה 'חדשה', תוך מתן מדדים רגישים וספציפיים להפרעה בתפקוד.

כימות של פונקציה הגלובלית הדיאסטולי על ידי ניתוח המבוסס על דוגמנות Kinematic של Transmitral זרימה באמצעות הפורמליזם מילוי Parametrized הדיאסטולי

הנה אזור רומן של פרוטוקול ניתוח ריבית המבוססת על מיון אליפסות מיטבית הוקצו לאזורים של אות חיובית בתוך רצפי זמן לשגות תמונה דו ממדי מודגם. אלגוריתם זה עשוי לאפשר לחוקרים לנתח באופן מקיף אותות פיסיולוגיים + Ca 2 עם קלט משתמש מינימאלי ומשוא פנים.

ניתוח האוטומטי של דינמי Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות ברצפי תמונות

במהירות voltammetry מחזורית לסרוק יכול לפקח על וירו דופאמין נוירוטרנסמינציה בהקשר של סמים, מחלות, מניפולציות ניסיוניות אחרות. עבודה זו מתארת ​​את יישום QNsim1.0, תוכנה לעיצוב תגובות דופמין מגורה חשמלית על פי המודל הנוירוביולוגי כמותי לכמת הערכות של שחרור דופאמין ודינמיקה reuptake.

דוגמנות מהירה סריקה מחזורית Voltammetry נתונים מ חשמלית חשמלית דופמין ניטור נתונים באמצעות QNsim1.0

סידן תאיים מיחזור שמשחק תפקיד בוויסות של תפקוד סיסטולי, דיאסטולי אצל cardiomyocytes. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להעריך sarcoplasmic רשת Ca2 + שמורת ובפונקציה הסרת סידן הדיאסטולי ב cardiomyocytes מאת סידן מערכת הדמיה.

הערכה של רשת Sarcoplasmic סידן סידן הדיאסטולי שימור, תאיים הסרת Cardiomyocytes חדרית מבודד

טכניקה מהירה ואמינה מוצעת לשליטה בתנודות הצורה של בועה אקוסטית אחת לכודה המבוססת על טכניקת התלכדות בין שתי בועות. תנודות צורת הבועה במצב יציב ומבוקרות סימטריה מאפשרות ניתוח של זרימת הנוזל הנוצרת בקרבת ממשק הבועות.

השראת מיקרו-סטרימינג על ידי תנודות בועות לא כדוריות במערכת ריחוף אקוסטית

הרפיה מהירה של שריר הלב והלב חיונית לפיזיולוגיה תקינה. מנגנוני הרפיה מכניים ידועים כיום כתלויים בקצב המאמץ. פרוטוקול זה מספק סקירה כללית של רכישה וניתוח של ניסויים כדי להמשיך לחקור את הבקרה המכנית של הרפיה.

בקרה מכנית של הרפיה באמצעות trabeculae לב שלם

מכשיר המציצה הלא מזין (NNS) יכול לאסוף ולכמת בקלות תכונות NNS באמצעות מוצץ המחובר למתמר לחץ ומוקלט באמצעות מערכת איסוף נתונים ומחשב נייד. כימות של פרמטרים NNS יכול לספק תובנה חשובה לגבי ההתפתחות העצבית הנוכחית והעתידית של הילד.

מדידות פרמטרי מציצה לא מזינים באמצעות מערכת מתמרי לחץ מותאמת אישית

פרוטוקול זה מציג תיבה התנהגותית מבוססת מיקרו-בקר להערכת עיכוב קדם-דחף (PPI) על ידי איסוף נתוני תאוצה מחיישן מתחת לקופסה. נתונים אלה מעריכים ליקויים בשער חושי בחולדות מבודדות חברתית, עם שיטה נוספת לסנכרון נתונים עם פעילות עצבית כדי לקדם מחקרים נוירופיזיולוגיים על הפרעות התנהגות.

פיתוח קופסה התנהגותית להערכת עיכוב קדם-דופק ופעילות עצבית במודלים של בעלי חיים פסיכיאטריים

אלקטרופיזיולוגיה של מהדק דינמי יכולה לבסס קשרים סיבתיים בין ליקויים בירי עצבי לתפקוד לקוי של תעלת יונים. אנו מתארים שיטות ופרוטוקולים של מהדק דינמי בנוירונים של פורקינג'ה במוח הקטן של העכבר, תוך ציון משאבים שימושיים ושיקולים טכניים. במחקר מייצג, אנו מוסיפים מוליכות נתרן מעוצבת לנוירונים Tsc1-/- Purkinje כדי להציל ירי חוזר.

שיטות מהדק דינמי לחקירת ריגוש עצבי לקוי הקשור לאוטיזם

מוצג פרוטוקול ניסיוני להרכבה, גירוי חשמלי וניתוח דו-שכבתיות מממשק טיפות עם גרמיצידין A. יחסי מבנה-תפקוד בין ליפידים לחלבון נמדדים על ידי מדידת שינויים בשטח הממברנה, בזרם יוני ובהולכה חד-ערוצית, וקישור תגובות אלו לשינויים דמויי פלסטיות בהולכה יונית במודל ממברנה בהשראת סינפסות חשמליות.

אפיון מבנה תפקוד ממברנת ליפידים-חלבון באמצעות דו-שכבות ממשק טיפות

חקור את תפקיד משאבת Na+/K+ וזרם Na+ מתמשך בנוירוני לב של עלוקה באמצעות טכניקת dynamic clamp. מחקר זה מספק תובנות לגבי השפעת זרמים יוניים על פעילות נוירונלית וקצביות.

תרומה של Na⁺/ K⁺ משאבה להתפוצצות קצבית, נחקרת עם דוגמנות ניתוחי מהדק דינמיים

גלה סרטונים נוספים