Name: אוסף תאים בודדים של תאי טרופוביסט בעוברים אנושיים שלב השתלה פרי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: למד איסוף תאים בודדים של תרופובלסטים בשלב השתלת העובר האנושי. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני ההשתלה המוקדמת והבנת סיבות לאובדן הריון וכשל בהשתלה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להכיר בחולים הרבים במרכז קולורדו לרפואת פוריות (CCRM) שתרמו באדיבות את העוברים שלהם למחקר. ברצוננו גם להודות קארן Maruniak ואת המעבדה הקלינית ב CCRM על עזרתם בעיבוד דגימות hCG, כמו גם סו מקורמיק וצוות אמבריולוגיה הפריה חוץ גופית קלינית שלה ב CCRM על עזרתם עם איסוף עובר, אחסון, מעקב, ותרומה. המימון סופק באופן פנימי על ידי CCRM.

כל העוברים האנושיים נתרמו בהסכמה לשימוש במחקר. פרוטוקולים לתרבות עובר אנושית מורחבת אושרו על ידי ועדת הביקורת המוסדית המערבית (מחקר מס' 1179872) ובהתאם להנחיות הבינלאומיות. כל שימוש בעוברים אנושיים חייב להיבחן על ידי האתיקה המתאימה וגופים שלטוניים הקשורים למוסד המחקר באמצעות פרוטוקול זה.
1. הכנה
<ol><li>הכן את אמצעי התקשורת והצלחות ההתאוששות יום אחד לפני התחממות העובר במכסה מנוע זרימה למינאר סטרילי.<ol>
<li>הכן 2 מ"ל של תקשורת תרבות blastocyst (BM) עם 10% v / v תחליף חלבון סרום (SPS). הערה: תקשורת תרבות Blastocyst עשויה להכיל או לא יכולה להכיל חלבון נוסף. כאן, השתמשנו במדיום שיש להשלים עם 10% של חלבון אלבומין שצוין. בדוק את ההנחיות של היצרן עבור וריאציה בתוסף זה. יש לסנן את כל המדיה באמצעות מסנן μM סטרילי 0.22 המחובר למזרק סטרילי לפני שיווי המשקל.</li>
		<li>מלאו שתי מנות לשטוף כלים של תרבות איברים עם 500 μL של BM עם 10% v/v SPS מכוסה ב-500 μL של שמן כיתה של תרבות העובר.</li>
		<li>בצלחת תרבות רקמות 60 מ"מ, שכבה 8 מ"ל של שמן תרבות העובר ולאחר מכן עוגן 20 μL טיפות של BM עם 10% v/v SPS לתחתית צלחת התרבות. בצע טיפה אחת עבור כל עובר חימם. הערה: ניתן יהיה לעשות יותר מדיה, טיפות וכלים לפי הצורך. ניתן להוסיף גם טיפות לצלחת לפני השמן הוא שכבות. עיגון טיפות תחת השמן יעזור להפחית אידוי וכל השינויים הבאים osmolality.</li>
		<li>שיוויון BM עם 10% v /v SPS לשטוף כלים וצלחת התאוששות ב אינקובטור ב 37 ° C, 6% CO2, 5% O2 עבור לפחות 4 שעות.</li>
		<li>להפשיר בקבוקון אחד של הצעד הראשון של מדיה תרבות מורחבת (IVC1) ב 4 ° C או על הספסל העליון.</li>
		<li>הכינו צלחת כביסה אחת של 500 μL של IVC1 ללא כיסוי שמן. Aliquot כ 4 מ"ל של IVC1 לתוך צינור 5 מ"ל הצמדה כובע.</li>
		<li>צלחת כביסה IVC1 Equilibrate וצינור הצמדה קטן של IVC1 ב 37 ° C, 6% CO2, ו אטמוספרי O2 לפחות 4 שעות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכינו צלחות תרבות מורחבות יום אחד לפני התחממות העובר במכסה מנוע זרימה למינאר סטרילי.<ol>
<li>דילל פיברונקטין מנסיוב אנושי בתמיסת מלח פוספט אגירה (PBS) כדי 30 μg / מ"ל. 250 μL של 30 μg / מ"ל פיברונקין לכל עובר יהיה צורך לכסות את התאים.</li>
		<li>פתח את 8 חבילת כיסויים קאמרית היטב מתחת למכסה המנוע תוך הקפיד לא לגעת בארות. בעדינות פיפטה 250 μL של 30 μg / מ"ל פיברונטין לתוך כל באר.</li>
		<li>מחזירים את המכסה לכיסויים הקאמריים וממקם ב-4°C למשך 20-24 שעות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכינו צלחת תרבות מורחבת בבוקר של התחממות העובר.<ol>
<li>לאחזר את כיסויים קאמריים עם פיברונקטין והמקום בכיסוי המנוע זרימה למינאר. מוציאים את תערובת הפיברונקטין עם פיפטה של 1 מ"ל וזורקים לתוך מיכל הפסולת.</li>
		<li>אחזר חימום, מערך IVC1 מדיה מ קטן 5 מ"ל snap cap צינור.</li>
		<li>פיפט 300 μL של IVC1 equilibrated לתוך כל באר. היזהר לא לתת לכל נוזל לגעת במכסה כמו זה יגדיל את הסיכון לזיהום.</li>
		<li>להחזיר את הכיסויים התאים עם IVC1 כדי לדגור ב 37 °C, 6% CO2, ו אטמוספרי O2 עד להסרת zona pellucida בשלב 4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. התחממות עוברי D5 אנושיים זגוגיים
הערה: יצרנים אחרים עשויים להיות פרוטוקולים מעט שונים על פי טכנולוגיית זגוגית משלהם. עיין בהוראות היצרן לשימוש כאשר הדבר ישים.
<ol><li>חם 3.0 מ"ל של פתרון הפשרה (TS) בצלחת 35 מ"מ עד 37 °C. להביא 300 μL של פתרון דילול (DS) ושתי בארות של 300 μL של תמיסת כביסה (WS) בצלחת 6 גם לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>באמצעות מפסים, בזהירות להסיר את שרוול התקן cryo תוך הבטחה כי העובר זגוגי תמיד נשאר תחת חנקן נוזלי.</li>
	<li>הזז במהירות את התקן ההקפאה מחנקן נוזלי וצלל בקצה התקן ההקפאה ב-TS ב-37°C. הגדר טיימר למשך דקה אחת והגדר ההקפאה יהיה שקוע עד שהעובר יתנתק לתוך ה-TS. הערה: עוברים חמים אחד בכל פעם כדי לעקוב אחר זהויות העובר כפי שהם עשויים להתייחס למידע דמוגרפי המטופל בניתוח במורד הזרם.</li>
	<li>במהלך הדגירה של 1 דקות ב-TS, הסירו בזהירות את התקן ההקפאה והרים בעדינות את העובר ועוברים לצד הנגדי של צלחת ה-TS. הערה: אם תקבר עוברים מרובים, היו חרוצים כדי להפריד בין העוברים כדי להבטיח שזהויות נאותות יישמרו.</li>
	<li>לאחר 1 דקות, בעדינות להרים את העובר עם כמות קטנה של TS, כ 2 μL. להעביר את העובר לתחתית של 300 μL DS גם תוך כיסוי העובר בשכבה דקה של TS מן הפיפטה. קבעו טיימר למשך 3 דקות והיקבעו את הצלחת בעלת 6 הבארות על הספסל העליון בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לאחר 3 דקות, להרים את העובר עם כמות קטנה של DS, כ 2 μL, ולהזיז את העובר לתחתית הבאר הבאה המכילה 300 μL של WS. שוב, בעדינות שכבה כמות קטנה של DS מן הפיפטה מעל העובר. הגדר טיימר במשך 5 דקות ולחזור לספסל העליון.</li>
	<li>לאחר 5 דקות, להרים את העובר עם נפח מינימלי של WS ולעבור לראש הבאר הסופית של 300 μL WS. העובר יפול באיטיות וישטוף את ה-WS לתחתית. לגרש כל WS נשמר מהפיפטה לבאר ריקה.</li>
	<li>להרים את העובר עם נפח מינימלי ולחזור לראש של אותו 300 μL באר של WS. העובר שוב ייפול לתחתית הבאר. הגדר טיימר למשך דקה אחת והחזר את צלחת 6-באר לראש הספסל.</li>
</ol>3. שחזור עוברים חמים
<ol><li>אחד בכל פעם, להעביר עוברים חמים לתוך צלחת רקמת איבר מרכז היטב המכיל 500 μL של BM שווה ערך עם 10% v/v SPS תחת 500 μL של שמן כיתה תרבות עובר שווה.</li>
	<li>לשטוף עוברים על ידי להרים כל עובר והעברתם סביב למספר אזורים בצלחת תוך פיצוץ מדיה ישנה בין מהלכים. להרים את העובר ולהזיז אותו בודדים 20 μL תרבות ירידה של BM equilibrated עם 10% v / v SPS תחת שמן.</li>
	<li>תנו לעוברים המחממים להתאושש למשך 2 שעות באינקובטור ב-37°C, 6% CO2, 5% O2.
</li>
</ol>4. הסרת
<ol><li>לאחר החלמה של 2 שעות, להעריך עוברים להרחבה מחדש ולצלם כל עובר.</li>
	<li>להעביר עוברים בנפרד ב 500 μL של 3-(N-morpholino)-פרופנסולפונית חומצה (MOPS)-אגירה טיפול בינוני עם 5% (v /v) סרום עגל עוברי (FCS) לפני הטיפול עם הפתרון של טירוד חומצי.</li>
	<li>להעביר עובר אחד במהירות דרך 300 μL של הפתרון של טירוד חומצי חם תוך כדי צפייה פעילה דרך המיקרוסקופ. הזונה פלוצ'ידה תתחיל להתמוסס באופן חזותי. זה ייקח בערך 5 שניות.</li>
	<li>מיד להעביר את העובר עם המסת zona לתוך 300 μL של MOPS חימם אגירה בינוני כדי להרוות את הפתרון של החומצה Tyrode.</li>
	<li>להזיז את העובר עם נפח מינימלי של MOPS אגירה בינוני לתוך צלחת רקמת איברים במרכז גם המכיל 500 μL של BM equilibrated עם 10% v/v SPS תחת 500 μL של שמן כיתה תרבות עובר שיוויון לשטוף.</li>
	<li>להחזיר את העובר לירידה 20 μL התאוששות מ שלב 3.2. הערה: בבדיקה חזותית לאחר הסרת zona, כל עובר עם pellucidae נשמר עשוי להיות מטופל עוד יותר עם הפתרון של Tyrode חומצי במידת הצורך, על ידי חזרה על שלבים 4.2-4.6. מזעור החשיפה לפתרון של Tyrode הוא רצוי.</li>
</ol>5. תרבות מורחבת של בלאסטוקיסט
<ol><li>העבר את העוברים בנפרד לצלחת הכביסה עם מדיה IVC1 equilibrated מ שלב 1.1.6. בזהירות להעביר עובר אחד לבאר אחת של כיסויים קאמריים עם IVC1 equilibrated ולשמור על זיהוי העובר. הערה: יש לסיים שלב זה במהירות האפשרית כדי למזער אידוי בינוני.</li>
	<li>החזר כיסויים קאמריים לאקובטור המוכן ל-37°C, 6% CO2, Oאטמוספרי O 2 למשך יומיים. הערה: הקפד להפשיר ולהשיל מדיה ב- 37 °C, 6% CO2, Oאטמוספרי O 2 עבור חילופי מדיה 4 שעות מראש.</li>
	<li>ב outgrowth D2 (D7 לאחר הפריה), לבחון בקפידה את ההחזקה של עוברים תחת המיקרוסקופ ולבצע חילופי מדיה.<ol>
<li>שים לב איזה עובר מחובר לצלחת לפני החלפת מדיה. הקש בעדינות על הצלחת ובדוק אם העובר מחובר היטב לצלחת מתחת למיקרוסקופ.</li>
		<li>הסר את המכסה ולהסיר בזהירות 150 μL של IVC1 ולזרוק תוך כדי לא מפריע העובר המצורף. אם העובר עדיין לא מחובר לצלחת, אל תחליף את התקשורת, מכיוון שהסרום ב-IVC1 תסייע בחיבור העובר.</li>
		<li>פיפטה 150 μL של מדיה תרבות מורחבת equilibrated, IVC2, לאט לתוך כל באר ולהחזיר את המכסה כיסוי קאמרי. הערה: ודא שהסרת המכסה מהכיסויים הקאמריים ממוזערת כדי למנוע אידוי בינוני.</li>
	</ol>
</li>
	<li>החזר בזהירות את הכיסויים הקאמריים לאקובטור מבלי להתיז מדיה כלשהי על המכסה. חזור על חילופי מדיה וקובץ מצורף לבדוק כל יום של תרבות מורחבת עד העוברים מוכנים קיבעון או עיכול תא יחיד.</li>
</ol>6. אוסף אופציונלי של מדיה שהושקעה
<ol><li>לחלופין, לאסוף מדיה שהושקעה במהלך חילופי מדיה תרבות לאחר D7 או כל יום לאחר מכן. במהלך שלב 5.3.2, במקום להיפטר הצמד-להקפיא בינוני 150 μL של הוסר IVC1 לתוך סטרילי, נמוך לאגד 0.5 מ"ל צינור לניתוח עתידי.</li>
</ol>7. קיבעון אופציונלי עבור אימונואורס
<ol><li>השתמש 200 μL פיפטה לשטוף עוברים עם 1/2 חילופי מדיה של PBS עבור 3x לפני קיבעון כדי להסיר את כל פסולת חוץ תאית. שטיפת פסולת עודפת וחלבון תסייע לייעל את הבהירות ולהפחית את הרקע בתמונות המתקבלות עם חיסון.</li>
	<li>הסר את כל המדיה ולהוסיף לאט 200 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) ב PBS לבאר. העובר ירצה להיצמד לפני השטח של הנוזל. 150 μL מרובים שוטפים עם 4% PFA לפני הסרת כל הנוזלים יעזור למזער כל נזק לעובר.</li>
	<li>דגירה העוברים ב 4% PFA במשך 20 דקות עבור קיבעון.</li>
	<li>לשטוף עוברים 3x במשך 10 דקות לכל שטיפה עם 200 μL של 0.1% v / v polysorbate 20 PBS טרי.</li>
	<li>לאחסן עוברים קבועים ב 0.1% v /v polysorbate 20 ב PBS ב 4 ° C לפני שנמשיך עם פרוטוקול immunofluorescence.</li>
</ol>8. עיכול תא יחיד עם טריפסין
הערה: עוברים טריים (לא קבועים) משמשים לעיכול של תאים בודדים.
<ol><li>לשטוף את העובר פעם אחת עם 200 μL של PBS ולהוסיף 200 μL של פתרון שלושה לכל באר. מחזירים את הכיסויים הקאמריים לאקובטור למשך 5 דקות.</li>
	<li>הסר את כיסויי הכיסוי הקאמריים מהאינקובטור ובדקו את העוברים תחת סטריאוטיפ. תאים בפריפריה של העובר יתחילו לסגת MTB עדיין צריך להיות מחובר לצלחת שבו הם ממוקמים מרחוק מן העובר.</li>
	<li>השתמש פיפטה קטנה או פיפטה פה משך דק כדי להרים MTB בודד לפני פירוק העובר כולו. דלג קדימה לשלב 9.1 כדי לשמור MTB ולחזור לשלב 8.4 לאחר שלב 9.3.</li>
	<li>השתמש פיפטה מיקרו-מאניפולציה כף יד או פיפטה הפה כדי לנתק בעדינות את העובר על ידי שאגן למעלה למטה.</li>
	<li>תאים יתחילו להתנתק מכל העובר. המשך לשאוף את העובר בעדינות ושוב ושוב באמצעות קצה פיפטה קוטר קטן יותר או פיפטה הפה עד העובר כבר דגירה במשך סך של 10 דקות ב trypsin.</li>
</ol>9. בחירת תא יחיד ואוסף לדוגמה
<ol><li>עם שלושה נסיפסין מינימלי, להעביר את התאים דיסוציאציה דרך שלוש טיפות לשטוף של 20 μL PBS + 0.1% polyvinylpyrrolidone (PVP) תחת שמן תרבות העובר עם טיפול לא לאבד את כל התאים.</li>
	<li>לאחר שטיפת התאים, השתמש בפיפטת זכוכית נשלפת דק כדי לבחור תא אחד. בזהירות פיפטה התא היחיד לתוך צינור סטרילי 0.2 מ"ל בכריכה נמוכה עם נפח מינימלי של PBS + 0.1% PVP.</li>
	<li>הצמדה להקפיא תאים בודדים בחנקן נוזלי (LN2),ולאחסן ב -80 °C לשימוש עתידי.</li>
</ol>

<ol><li>Carter, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+placentation--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Animal models of human placentation--a review.</a> Placenta. , Suppl A 41-47 (2007).</li>
<li>Carter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+placentation+and+animal+models%3A+patterns+of+trophoblast+invasion+--+a+workshop+report%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report.</a> Placenta. 27, 30-33 (2006).</li>
<li>Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+article%3A+trophoblast+invasion+and+the+establishment+of+haemochorial+placentation+in+man+and+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals.</a> Placenta. 2, 71-91 (1981).</li>
<li>Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+stages+of+fertilization+in+vitro+of+human+oocytes+matured+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro.</a> Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+progression+of+the+human+inner+cell+mass+during+embryonic+stem+cell+derivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).</li>
<li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+using+a+post-inner+cell+mass+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate.</a> Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).</li>
<li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li>
<li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+the+in+vitro+attached+human+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of the in vitro attached human embryo.</a> Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+the+transcriptome+and+DNA+methylome+landscapes+of+human+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation.</a> Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).</li>
<li>Lv, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+RNA+sequencing+reveals+regulatory+mechanism+or+trophoblast+cell-fate+divergence+in+human+peri-implantation+conceptuses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses.</a> PLoS Biology. 17 (10), 3000187(2019).</li>
<li>West, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+trophoblast+differentiation+in+peri-implantation-stage+human+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Nationals+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos.</a> Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).</li>
<li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li>
<li>Mall, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+upon+the+collection+of+human+embryos+at+the+johns+hopkins+university%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university.</a> The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).</li>
<li>Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuettner%2C+KA+%22Embryo+Project+Encyclopedia%22">Embryo Project Encyclopedia</a>. , (2007).</li>
<li>Carnegie Institution of Washington. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Contributions+to+embryology%22">Contributions to embryology</a>. , Carnegie Institution of Washington. Washington, D.C. (1915).</li>
<li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+description+of+34+human+ova+within+the+first+17+days+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">A description of 34 human ova within the first 17 days of development.</a> American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).</li>
<li>Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+cylinder+development+during+in+vitro+extended+embryo+culture+predicts+the+post+transfer+developmental+potential+of+mouse+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

התפתחות הפרוטוקול לתרבות עוברים אנושיים באמצעות השתלה אפשרה למדענים לחקור תקופה לא ממופה בעבר בפיתוח8,9. כאן, אנו משתמשים במערכת תרבות מורחבת כדי לתרבות עוברים אנושיים וללמוד בידול trophoblast מוקדם לפני היווצרות שליה villous. השיטות המתוארות כאן מאפשרות לנו לאסוף קווי משנה שונים של TB לשימוש בניתוח תא יחיד במורד הזרם. עבודה זו מאפשרת לקהילה המדעית הזדמנות להבין תקופה קריטית ואדיגמטית זו בהתפתחות האנושית, עשויה לפתוח הזדמנויות חדשות לטיפולים טיפוליים להפלה או פתו...

השתלה אנושית והוווים של שליה מוקדמת קשה מבחינה היסטורית לחקור ולהישאר ידוע במידה רבה כי רקמות אנושיות אינן נגישות בשלב זה כאשר ההריון הוא בלתי ניתן לגילוי קלינית. מודלים של בעלי חיים אינם מספקים, מכיוון של שליה אנושית יש מאפיינים ייחודיים משלה בהשוואה ליונקים אחרים. לדוגמה, שליה אנושית פולשת עמוק לתוך ההחלטה עם כמה תאים trophoblast להגיע לפחות את השלישי הפנימי של רירית הרחם בעוד תאים אחרים לאשט את העורקים ספירליים הרחם. אפילו אבותינו האבולוציוניים הקרובים ביותר, הפרימטים הלא אנושיים, מראים הבדלים במורפולוגיה שליה ובאינטראקציות טרופיות עם הרקמות המחליטותהאימהיות 1,,2,,3. קבלת עוברים אנושיים לפני ההשתלה במבחנה לא הייתה אפשרית עד בשנות ה-80 כאשר אדם קליני הפריה חוץ גופית (הפריה חוץ גופית) התחיל כתרגול שגרתי לטיפולבפוריות 4. עכשיו, blastocysts אנושי יכול לגדול במבחנה כדי לאפשר את הבחירה של עוברים קיימא יותר להעברה, כמו גם לאפשר בדיקות גנטיות בטוחות. שיפור בטכניקות תרבות העובר, כמו גם את השימוש הגובר של הפריה חוץ גופית הניב blastocysts עודף רבים אשר נשאר לאחר מחזורי הטיפול של המטופל הושלמו. בהסכמת המטופל, אישור IRB, ועם הגבלות מסוימות, blastocysts אלה עשויים להיות מנוצלים למחקרים. הם הפכו למשאב יקר ערך ששימש לגירת תאי גזע עוברייםאנושיים 5, הבנת המעבר של מסת תאים פנימית לתאי גזעעובריים 6,7, ולאחרונה,כבר תרבותית בהצלחה עד היום (ד') 13 כדי לשפץ את ההשתלההאנושית 8,9. על ידי ניצול גישות omics תא יחיד שפותחו לאחרונה, הגישה לשלב השתלה אלה רקמות העובר האנושי הציע הזדמנויות ייחודיות לתאר את המנגנונים המולקולריים המווסתים את תהליך הבידול תא דינמי מאוד זה, אשר בעבר לא ניתןהיה לחקור 10,11,12,13.
כאן, אנו מתארים את השיטות המשמשות בפרסום האחרון שלנו המאפיינות את הדינמיקה של בידול trophoblast במהלך השתלהאנושית 12. פרוטוקול זה כולל את ההתחממות של blastocysts זגוגית, תרבות עובר מורחבת עד D12 לאחר הפריה חוץ גופית, עיכול אנזימטי של העובר לתאים בודדים, ואיסוף תאים עבור נתונים במורד הזרם(איור 1). מערכת תרבות מורחבת זו תומכת בשלב פרי-השתלה התפתחות העובר האנושי ללא קלט אימהי וcapitulates בידול trophoblast המופיע בקנה אחד עם תצפיות שנעשו דגימות היסטולוגיות לפנישנים רבות לפני 14,15,16,17. במהלך ההשתלה, אוכלוסיית trophoblast מורכבת לפחות משני סוגי תאים: ציטורופובלסט כמו אב מונוז'יטורופובלסט (CTB) ואת הבדיל הסופני, multinucleated syncytiotrophoblast (STB). עם עיכול trypsin, CTB הם קטנים, תאים עגולים כי הם מורפולוגית לא ניתן להבחין בין נסיונים אחרים של תאים(איור 2A,פאנל שמאלי). הפרדה של CTB מנושאים אחרים של תאים, כגון epiblast ו endoderm פרימיטיבי, ניתן להשיג על ידי פרופילים transcriptomic ברור שלהם גילה על ידי רצף RNA תא יחיד. ניתן לזהות בקלות תאים סנכרוניים כמבנים בעלי צורה לא סדירה, הגדולים משמעותית מסוגי התאים האחרים וממוקמים בעיקר בפריפריה של העובר (איור 2א,לוח אמצעי; איור 2ב', החלונית השמאלית). תאי טרופוביסט נודדים (MTB) הם קו משנה נוסף של trophoblast שנמצא במהלך תרבות מורחבת עובר, ניתן לזהותו כמתרחק לכאורה מן הגוף הראשי של העובר(איור 2A, פאנל ימני, איור 2B,פאנל ימני). trophoblast נודד, למרות הבעת רבים של סמנים זהה כמו trophoblast villous נוסף (EVT), לא צריך להיות מכונה EVT, מאז המבנים villous שליה לא הופיע בשלב מוקדם מאוד זה של פיתוח.
מבחינה ניסיונית, הצלחנו לאסוף CTB קטן STB גדול כי הם ניתן להבחין בקלות לאחר עוברים מתעכלים לתאים בודדים ב D8, D10, ו D12 (איור 2A,B). טרופוביסטים נודדים מתעוררים בשלבים מאוחרים יותר של תרבות העובר המורחבת ותוכל לאסוף אותם ב-D12 לפני עיכול אנזימטי של העובר כולו (איור 2א', ב). על ידי הפרדת שלוש קווי משנה אלה trophoblast לפני ניתוח תא יחיד, אנחנו יכולים לזהות סמנים תעתיק ספציפיים ולהגדיר את התפקיד הביולוגי של כל סוג תא. Cytotrophoblast הם משגשגים מאוד לפעול כתאי אב אדם באספקת תוחסין מובדיל STB ו MTB10,11,12,13. Syncytiotrophoblast מעורבים בייצור הורמוני שליה כדי לשמור על ההריון, עשוי להיות גם אחראי על העוברים חופרים לתוך ריריתהרית הים 10,,11,,12,,13. trophoblast נודד יש תכונות חזקות עוד יותר של פנוטיפ פולשני, נודד והם כנראה אחראים להתיישבות עמוקה ונרחבת יותר של ריריתהרחם הרחם 10,,11,12,,13. לאחר הגדרת החתימה transcriptomic של כל סוג תא, ניתוחי קיבוץ באשכולות חשפו גם שתי קבוצות משנה נוספות של תאים שלא ניתן להבחין מורפולוגית מ CTB והיה transcriptomes עם תכונות של STB ו MTB,בהתאמה 12. תאי שלב ביניים אלה הם כנראה בתהליך של הבדיל CTB או MTB או STB sublineages והיה להתעלם אם עוברים היו מתעכלים באופן עיוור ותאים הופרדו על ידי transcriptome לבד.
הפרוטוקול המתואר כאן משתמש במערכת תרבות דו-ממדית (דו-ממדית) ולא יכול להיות אופטימלי לתמיכה בפיתוח מבני תלת מימדי (תלת-ממדי), כפי שהוצע בפרסום שפורסם לאחרונה המתאר מערכת תרבות תלת-ממדית שפותחהלאחרונה 13. אף על פי כן, במערכת דו-מית-מית-מית-ת- נראית כך שההבחנה של טרופהובלסט מוקדמת עולה בקנה אחד עם תצפיות שנעשו בדגימות vivo14,15,16,17. פרוטוקול זה עשוי גם להיות מותאם בקלות לשימוש במערכת תרבות 3D שתוארה לאחרונה13 עם שינויים מינימליים. כל הצעדים מתבצעים עם פיפטה מיקרו-מאניאלית ידנית עם טיפים חד-פעמיים זמינים מסחרית או פיפטת פה מפיפטת זכוכית נשלפת דק המחוברת לצינורות גומי, מסנן ופיה.

<table><tbody><tr><td>מזרק סטרילי NORM JECT Luer Lock</td><td>VWR</td><td>53548-019</td><td>חבילה של 100</td></tr><tr><td>3130 או 3110 Forma Series II חממת CO2 עם מעטפת מים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-998-078</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ צלחת תרבית רקמות קורנינג פרימריה</td><td>VWR</td><td>62406-038</td><td>מארז של 500</td></tr><tr><td>5 מ"ל צינור כובע הצמד</td><td>VWR</td><td>60819-295</td><td>חבילה של 25</td></tr><tr><td>רקמות קורנינג פרימריה 60 מ"מ צלחת תרבות</td><td>VWR</td><td>25382-687</td><td>מארז של 200</td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>Agtech Inc.</td><td>D18</td><td>חבילה של 1, 10 או 50</td></tr><tr><td>תמיסה של טירוד חומצי</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1788</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>ביוטיקס 1250 ומיקרו; קצות פיפטה</td><td>L VWR</td><td>76322-156</td><td>חבילה של 960</td></tr><tr><td>פיצוץ, מדיה לתרבית בלסטוציסט</td><td>Origio</td><td>83060010</td><td>10 מ"ל</td></tr><tr><td>תמיסת דילול</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>1 x 4 מ"ל</td></tr><tr><td>חד פעמי בורוסיליקט זכוכית פסטר פיפט</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>1367820D</td><td>5.75 אינץ'. (146 מ"מ); 720/CS</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Salt</td><td>Millipore Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>שמן פרפין תרבית עובר OvOil</td><td>Vitrolife</td><td>10029</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>צינורות Eppendorf PCR 0.2 מ"ל</td><td>VWR</td><td>47730-598</td><td>חבילה של 1,000</td></tr><tr><td>צינורות Eppendorf PCR 0.5 מ"ל</td><td>VWR</td><td>89130-980</td><td>מארז של 500</td></tr><tr><td>פיברונקטין מפלזמה אנושית. תמיסה נוזלית .1%</td><td>Millipore Sigma</td><td>F0895</td><td>1 מ"ג</td></tr><tr><td>גילסון 1 מ"ל Pipetteman</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipetteman 200-1000 & מיקרו; ל</td></tr><tr><td>גילסון 20 ומיקרו; L Pipetteman</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipetteman 2-20 ומיקרו; ל</td></tr><tr><td>גילסון 200 ומיקרו; L Pipetteman</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipetteman 50-200 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>G-MOPS טיפול במדיה</td><td>Vitrolife</td><td>10129</td><td>125 מ"ל</td></tr><tr><td>טיפול במדיה</td><td>Origio</td><td>83100060</td><td>60 מ"ל</td></tr><tr><td>Ibidi 8 כיסוי תא היטב</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>15 שקופיות לכל קופסה</td></tr><tr><td>IVC1 / IVC2</td><td>מערכות הנחיית תאים</td><td>M11-25 / M12-25</td><td>5-5 מ"ל aliquots</td></tr><tr><td>K מערכת T47 צלחת חימום</td><td>קופר כירורגית</td><td>23054</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeSigma Millex מסנני מזרק סטריליים עם Durapore PVFD ממברנה</td><td>פישר SLGVR33RS מדעי</td><td></td><td>חבילה של 50</td></tr><tr><td>חתיכות</td><td>פה IVF חנות</td><td>MP-001-Y</td><td>100 חתיכות</td></tr><tr><td>צלחת באר מרכז Oosafe</td><td>OOPW-CW05-1</td><td>מארז של 500</td><td></td></tr><tr><td>Quinn's Advantage SPS</td><td>Origio</td><td>ART-3010</td><td>12x 12 מ"ל</td></tr><tr><td>צינורות לטקס גומי לחלקי פה</td><td>חנות</td><td>IVFS IVFS-NRL-B-5</td><td>5 רגל</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>ניקון</td><td>SMZ1270</td><td></td></tr><tr><td>טיפים חשפנית</td><td>קופר כירורגי</td><td>MXL3-275</td><td>20/pk 275 ומיקרו; m</td></tr><tr><td>פתרון הפשרה</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>2 x 4 מ"ל</td></tr><tr><td>החשפנית Micropipetter</td><td>Cooper Surgical</td><td>MXL3-STR</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), ללא פנול אדום</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>12604013</td><td>1 x 100 מ"ל</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1379-25ML</td><td>בקבוק 25 מ"ל</td></tr><tr><td>VWR 1-20 ומיקרו; קצות פיפטה L</td><td>VWR</td><td>76322-134</td><td>חבילה של 960</td></tr><tr><td>VWR 1-200 ומיקרו; קצות פיפטה L</td><td>VWR</td><td>89174-526</td><td>חבילה של 960</td></tr><tr><td>תמיסת כביסה</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>1 x 4 מ"ל</td></tr></tbody></table>

אוסף תאים בודדים של תאי טרופוביסט בעוברים אנושיים שלב השתלה פרי

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

השתלה אנושית, ההדבקה וההדבקה על אפיתליה פני הרחם והפלישה הבאה של blastocyst לתוך ההחלטה אימהית, הוא אירוע ביולוגי קריטי אך אניגמטי כי היה קשה מבחינה היסטורית ללמוד בשל מגבלות טכניות ואתיות. ההשתלה היא יזם על ידי הפיתוח של trophectoderm כדי trophoblast מוקדם ובדידול הבאים לתוך קווי משנה trophoblast ברורים. בידול trophoblast מוקדם חריג עלול להוביל לכשל השתלה, פתולוגיות שליה, חריגות עובר, הפלה. לאחרונה, פותחו שיטות המאפשרות לעוברים אנושיים לגדול עד היום ה-13 לאחר הפריה במבחנה בהיעדר רקמות אימהיות, פרק זמן המקיף את תקופת ההשתלה בבני אדם. זה נתן לחוקרים את ההזדמנות לחקור השתלה אנושית ולסיכום הדינמיקה של בידול trophoblast בתקופה קריטית זו מבלי לבלבל השפעות אימהיות והימנעות מכשולים טבועים ללמוד אירועי בידול העובר מוקדם ב vivo. כדי לאפיין תת-קוובלסטים שונים במהלך ההשתלה, אימצנו שיטות תרבות דו-ממדיות (דו-ממדיות) קיימות ופיתחו הליך לעיכול אנזימטי ולבודד סוגים שונים של תאי טרופוביסט לתאגידות במורד הזרם. עוברים תרבותיים בתנאים דו-ממדיים יש מורפולוגיה שטוחה יחסית עשוי להיות תת אופטימלי במידול בארכיטקטורות עובריות vivo תלת מימדי (3D). עם זאת, בידול trophoblast נראה פחות מושפע כפי שהוכח על ידי מורפולוגיה צפויה ושינויים ביטוי גנים במהלך תרבות מורחבת. קווי משנה שונים של trophoblast, כולל ציטוטרוהובלסט, סינכרון ו-trophoblast נודדים יכולים להיות מופרדים לפי גודל, מיקום והופעה זמנית, ולהשתמש בהם לאפיון נוסף או ניסויים. חקירה של תאים אלה trophoblast מוקדם עשוי להיות חיוני בהבנת השתלה אנושית, טיפול פתולוגיות שליה נפוצות, ולהקל על השכיחות של אובדן הריון.

עוברים בריאים הפגינו המשך התפשטות במהלך תרבות מורחבת (איור 2B). עוברים חריגים החלו לסגת מהקצוות החיצוניים שלהם והתפוררו(איור 2C). מניסיוני, כ-75% מהעוברים היו מחוברים לתחתית המנה המצופה בפיברונקטין ב-48 שעות והחיבור גדל לכ-90% ב-72 שעות בתרבות. ההצלחה של חיבור העובר עשויה להיות מושפעת במידה רבה על ידי האיכות הראשונית של blastocysts. עוברים שלא מחוברים עד 72 שעות כנראה לא ישרדו.
ב D8 לאחר הפריה (D3 של תרבות מורחבת), רוב התאים בעוברים ה...

כאן, אנו מתארים שיטה לחימום בלסטוציטים אנושיים זגוגיים, איסוף אותם דרך תקופת ההשתלה במבחנה, לעכל אותם לתאים בודדים ואיסוף תאי trophoblast מוקדם לחקירה נוספת.

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

הריונות רבים נכשלים בשלב מוקדם בהתפתחות העובר האנושי סביב שבע או שמונה לאחר ההפריה. פרוטוקול זה מציע הזדמנויות לחוקרים לגדל מושגים אנושיים במבחנה במהלך חלון ההשתלה המסתורי הזה. זה מאפשר לנו להבין את המנגנונים העומדים ביסוד ההצלחה של השתלה אנושית היווצרות שליה מוקדמת.שימוש במערכת תרבות מורחבת לגידול עוברים אנושיים בשלב פרי-השתלה במבחנה הוא כנראה הדרך היחידה להשיג חומרים אותנטיים לחקר השתלה והתמדה מוקדמת של טרופובלסט. טכניקה פשוטה זו היא כלי רב עוצמה המאפשר לנו לענות על שאלות בסיסיות רבות על ההתפתחות המוקדמת האנושית. מחקר שנערך עם השימוש בפרוטוקול זה יתרום במידה רבה להבנת אובדן הריון מוקדם, כשל בהשתלה חוזרת ונשנית ופתולוגיות שליה.הפגנת ההליך תהיה דירדרה לוגסון, סטודנטית לדוקטורט ממעבדה. יום אחד לפני התחממות העובר, הכינו את לוחות התקשורת וההתאוששות במכסה המנוע של זרימה למינארית סטרילית. מלאו שתי מנות שטיפת תרבות איברים מרכזיות היטב ב-500 מיקרוליטרים של BM עם 10%SPS, ולאחר מכן כסו את ה-BM ב-500 מיקרוליטרים של שמן ברמת תרבות העוברים.בצלחת תרבות רקמה 16 מילימטר, שכבה שמונה מיליליטר של שמן תרבות העובר עוגן 20 טיפות microliter של BM עם 10% SPS לתחתית. לצייד את כלים לשטוף צלחת התאוששות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 6% פחמן דו חמצני ו 5% חמצן לפחות ארבע שעות. Aliquot כארבעה מיליליטר של IVC 1 לתוך צינור כובע הצמד חמישה מיליליטר ולהכין צלחת כביסה אחת עם 500 microliters של IVC 1 ללא כיסוי שמן.יש לצייד את המנה והצינור באינקובטור למשך ארבע שעות לפחות. לדלל פיברונאטין מנסיוב אנושי ב PBS ל 30 מיקרוגרם למיליליטר. פתח את שמונה חבילת כיסויים תאים היטב דואג לא לגעת בארות, ואז בעדינות pipette 250 microliters של fibronectin לתוך כל באר.החלף את המכסה על כיסוי הדגירה אותו בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 עד 24 שעות. הכינו את צלחת התרבות המורחבת בבוקר של התחממות העוברים. אחזר את החלקת הכיסוי התאית עם פיברונקין והצב אותה במכסה המנוע של הזרימה למינארית.לאחר מכן להסיר את תערובת fibronectin עם פיפטה מיליליטר אחד להשליך אותו. פיפטה 300 microliters של IVC שיווי משקל 1 לתוך כל באר ולמקום את הכיסוי לתוך החממה עד הסרת שונה pellucida. לאחר התחממות והתאוששות של העוברים האנושיים D5, להעריך אותם להתרחבות מחדש ולצלם של כל עובר.העבר כל עובר ל- 500 מיקרוליטרים של אמצעי טיפול במאגר MOPS עם 5%FCS. ואז לטפל בו עם הפתרון של טיירוד חומצי כמתואר בכתב היד טקסט. מיד להזיז את העובר עם zona מתמוסס לתוך 300 microliters של מדיום חנית MOPS מחומם כדי להרווה את הפתרון של טירודה.ואז להעביר את העובר לתוך צלחת רקמת איברים באר מרכזית המכילה את BM משובץ עם 10% SPS תחת שמן כיתה תרבות העובר. ואז להחזיר את העובר לירידה 20 התאוששות microliter. בנפרד להעביר את העוברים לצלחת לשטוף עם המדיה IVC 1 שיווי משקל, ואז בזהירות להעביר כל עובר ל הבאר של כיסוי התא, הקפדה לעקוב אחר זיהוי העובר.החזירו את הכיסויים הקאמריים לאנקובטור שנקבע ל-37 מעלות צלזיוס, 6% פחמן דו-חמצני וחמצן אטמוספרי למשך יומיים. ביום השני, בחנו היטב את ההחזקה של העוברים מתחת למיקרוסקופ והחליפו את התקשורת. לדעת איזה עובר מחובר לצלחת על ידי הקשה עדין על הצלחת.כדי לשנות את התקשורת, להסיר את המכסה בזהירות שאפו 150 microliters של IVC 1, דואג לא להפריע העובר המצורף. אם העובר עדיין לא מחובר לצלחת, אל תחליף את התקשורת מכיוון שהנסיוב ב- IVC 1 יסייע בהחזקה. לאט לאט pipette 150 microliters של מדיה תרבותית מורחבת שווה, IVC 2 לתוך כל באר ולהחליף את המכסה על כיסוי.החזיר בזהירות את הכיסויים הקאמריים לאנקובטור. חזור על חילופי מדיה ובדיקה מצורפת כל יום עד העוברים מוכנים קיבעון או עיכול תא יחיד. אם אוסף של מדיה בילה הכרחי לניתוח נוסף, הצמד להקפיא את 150 microliters של IVC הוסר 1 לתוך צינור סטרילי נמוך לאגד 0.5 מיליליטר.לשטוף כל עובר פעם אחת עם 200 microliters של PBS, ולאחר מכן להוסיף 200 microliters של פתרון טריפסין לכל באר. החזירו את הכיסויים הקאמריים לאנקובטור לחמש דקות. השתמש פיפטה קטנה או פיפטה בפה משוך דק להרים MTB בודדים ואז להשתמש פיפטה גדולה יותר בעדינות לנתק את העובר על ידי שאיפה למעלה ולמטה.המשך לשאוב את העובר בעדינות ושוב ושוב באמצעות קצה פיפטה בקוטר קטן יותר עד שהעובר הודגר במשך סך של 10 דקות ב טריפסין. כדי לבצע בחירת תא יחיד, להעביר את התאים דיסוציאציה דרך 320 טיפות לשטוף microliter של PBS ו 0.1% PVP תחת שמן תרבות העובר, דואג לא לאבד תאים. לאחר שטיפת התאים להשתמש פיפטה זכוכית משוך דק כדי לבחור תא אחד.בזהירות pipette התא הבודד לתוך צינור קשירה נמוך סטרילי 0.2 מיליליטר עם נפח מינימלי של PBS ו PVP. הצמד תאים בודדים חינם בחנקן נוזלי ולאחסן אותם ב 80 מעלות צלזיוס שלילי לשימוש נוסף. עוברים בריאים הפגינו התפשטות מתמשכת במהלך התרבות המורחבת, בעוד עוברים חריגים החלו לסגת מהקצוות החיצוניים שלהם להתפורר.ביום שמונה לאחר ההפריה, רוב התאים בעוברים היו ציטוטרופיבלסט או CTBs, שהיו חיוביים עבור סמן trophoblast GATA-3. בפריפריה של העובר, CTBs כבר התבהר לתוך סינקטיוטרופיבלסטים מרובי גרעינים, אשר היה גיליון כמו המראה מוכתם חיובי עבור בני אדם CGB. ביום 10, היווצרותם של תאי טרופובלסט נודדים חיוביים של CGB הייתה מקסימלית, אשר אושרה על ידי העלייה בייצור HCG בשלב זה.טרופובלסטים נודדים שהכתימו חיובי עבור HLA-G, החלו גם הם לצאת ולהגר הרחק מגוף העובר. ביום 12, התמדת STB הייתה בירידה וייצור MTB הפך בולט יותר, מה שמרמז על שינוי של דגש מייצור הורמון ביום 10 להגירה סלולרית ביום 12. שינויים אלה ניתן לראות וידאו לשגות זמן של תקופת ההשתלה פרי.הסרטון מדגים את קריסתו של blastocele, היווצרות STB, ואת ההתברמות וההגירה בסופו של דבר של MTB. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת השלמת הליך זה הוא שאתה עובד עם עוברים חיים רגישים לשינויים בטמפרטורה, osmolality ו- pH. צמצום משך הזמן שהמנות יוצאות מהאינקובטור הוא קריטי לשמירה על בריאות העובר.לאחר השלמת הליך זה, החוקרים יכולים להשתמש בתאים בודדים מבודדים עבור בדיקות omics תא יחיד במורד הזרם, כגון רצף RNA תא יחיד רצף דו-קוטבי הגנום כולו כדי להבין טוב יותר שינויים אפיגנטיים ותעתיקים במהלך ההשתלה האנושית היווצרות השליה המוקדמת.

single-cell-collection-trophoblast-cells-peri-implantation-stage

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את בידודה של blastocysts העכבר ואת הגזירה של בתאי גזע trophoblast מ blastocysts. אנחנו גם לתאר את תנאי תחזוקה של הנכס בתאי גזע, כמו גם גיוס של בידול בתרבות.

גזירת Trophoblast עכבר בתאי גזע Blastocysts

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הנתיחה של placentae מהעכבר על ההריון d10.5, ואחרי הבידוד של תאי trophoblast באמצעות שיפוע Percoll. אז אנחנו מדגימים שימוש בתאים המבודדים בassay פלישת matrigel.

בידוד של תאים ראשוניים עכבר Trophoblast וAssay הפלישה Trophoblast

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה transfecting siRNA ב cytotrophoblasts villous אדם המבודד טרי באמצעות microporation וזיהוי מתחמים-חלבון ה- DNA בתאים אלה. תאי transfected יכולים להיות במעקב על ידי כתם מערבי Emsa מנתח בזמן תרבות 4 ימים.

ניתוח Transfection siRNA ו Emsa על Cytotrophoblasts Villous אדם המבודד טרי

כאן אנו מציגים פרוטוקול להמרה ישירה של פיברובלסטים עובריים של עכברים לתאי גזע טרופובלסטים מתפקדים ויציבים לחלוטין על ידי ביטוי יתר של Tfap2c, Gata3, Eomes ו-Ets2.

פרוטוקול עבור ההמרה הישירה של Murine העוברי פיברובלסטים לתאי גזע Trophoblast

תאי ענק טרופובלסט (TGCs) ממלאים תפקיד מפתח בשליה כדי להבטיח הריון בריא. אנו מציגים פרוטוקול להערכת מצב השעתוק של גנים ב-TGCs על ידי הכלאה פלואורסצנטית מתפתחת באתרה על קטעי קריוסטט של עוברים לאחר השרשה או תרביות לטווח קצר של קונוסים חיצוניים עובריים ביום 7.

ניתוח תעתיק ידי ינוקא RNA FISH של<em&gt; In vivo</em&gt; תאים ענקים Trophoblast או<em&gt; במבחנה</em&gt; לטווח קצר תרבויות של Ectoplacental Cone Explants

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור יעיל של תאים טרופובלסטיים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות חלבון מורפוגני בעצם 4 ומעכבים של מסלולי האקטיבין/צמתים. שיטה זו מתאימה להתמיינות יעילה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ויכולה לייצר כמויות גדולות של תאים למניפולציה גנטית.

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

המוצג כאן הוא פרוטוקול עבור דגימה של רקמה אנושית היפרדות villous חלקית ואחריה בידוד של cytotrophoblasts לתרבות התא הראשי. טיפול trophoblasts עם TNFα recapitulates דלקת התוך-רחמית שמנים ומקל על גילוי מטרות מולקולריות מוסדר על ידי דלקת מאחד לשני עם השמנת יתר אימהית.

מודל ראשי Trophoblast האנושי כדי לחקור את ההשפעה של דלקת הקשורות בהשמנת יתר אימהית על ויסות Autophagy את השליה

פרוטוקול זה מדגים שיטת הבידוד של תאים אנושיים decidual הראשית שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae אשר יכול לשמש למגוון רחב של יישומים (קרי immunocytochemistry, cytometry זרימה, וכו ') מכוון ללמוד את התפקיד של אוכלוסיות תאים שונים בסיבוכים בהריון.

בידוד של ראשי תאים Decidual האנושי בקרום עוברי של המונח Placentae

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול ונגישות גבוהה להערכת תנועת התא בתאים trophoblast האנושי באמצעות שלושת מבחני במבחנה: וזמינותו מאפס, וזמינותו הפלישה transwell ואת וזמינותו התפשטות תאים.

במבחני חוץ גופית כדי להעריך את ההעברה הפלישה, התפשטות של שורות תאים מונצחים Trophoblast בטרימסטר הראשון אנושי

הפרוטוקול הנוכחי מאפשר התאוששות של מבנים דמויי צינור שנוצרו במבחן היווצרות צינור אנגיוגנזה קלאסי במבחנה שבו תאים, כגון תאי טרופובלסט, מתארגנים במבנים דמויי נימים על גבי שכבה של מטריצת קרום בסיס חוץ-תאית. המבנים המשוחזרים משמשים לבידוד RNA וחלבונים לניתוחים ביוכימיים שונים.

התאוששות תאי טרופובלסט מבדיקת היווצרות צינורות אנגיוגנזה לניתוח ביטוי סמן התמיינות

פרוטוקול זה מאפשר טיהור, אפיון ותרבות של טרופובלסטים ראשוניים מסוג HLA-G+ אקסטרווילוס (EVT) מהדצידואה בזליס ומהקרום הכוריוני של שליות המונחים האנושיים. תרביות EVT ראשוניות שומרות על חיוניות למשך 96 שעות, ומאפשרות קו-קלטור עם תאי חיסון אימהיים תואמים לדגימה וניתוח זרימה ציטומטרי ומולקולרי של האינטראקציות ביניהן.

טיהור של טרופובלסטים HLA-G+ אקסטרווילוס מרקמות שליה במונחים אנושיים לצורך פנוטיפינג וניתוח תפקודי

למד איסוף תאים בודדים של תרופובלסטים בשלב השתלת העובר האנושי. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני ההשתלה המוקדמת והבנת סיבות לאובדן הריון וכשל בהשתלה.

אוסף תאים בודדים של תאי טרופוביסט בעוברים אנושיים שלב השתלה פרי

גלה סרטונים נוספים