טכניקות אימונוהיסטוכימיה לניתוח התפשטות תאים ונוירוגנזה בחולדות באמצעות BrdU אנלוגי של תימידין
9 בספטמבר 2020
מאמר זה מציג ארבע מהטכניקות הנפוצות ביותר להדמיית תאים חיוביים של BrdU למדידת נוירוגנזה בוגרת בחולדות. עבודה זו כוללת הוראות להכנת מגיבים, ניהול אנלוגי של תימידין, פרפוזיה של שריר הלב, הכנת רקמות, תגובה אימונוהיסטוכימית של פרוקסידאז, אימונופלואורסצנציה, הגברת אותות, צביעה נגדית, הדמיית מיקרוסקופיה וניתוח תאים.
זהו פרוטוקול מפתח בתחום נוירוגנזה למבוגרים. כאן אנו מציגים תיאור מפורט של השלבים הנדרשים להשגת צביעה מוצלחת. טכניקה זו מאפשרת לזהות בו זמנית חלבונים ספציפיים המתבטאים בתאים הנמצאים בחלוקה תוך שמירה על שלמות הרקמה.
אנו ממליצים לבדוק את הנוגדנים והתנאים ברקמות מראש. השלבים המכריעים הם חדירה לממברנה, דנטורציה זהירה של DNA ובדיקת הזמנים לשלבי חסימה ושטיפה. סטנדרטיזציה של הטכניקה מאתגרת עבור מעבדות חדשות.
הכנת המגיב ומתן אנלוגי תימידין במכרסמים הם קריטיים לתוצאות מוצלחות למתן BrdU אנלוגי תימידין, יש לשתק את חלל הבטן התחתונה כדי לרסן את חולדת הניסוי ולהשתמש במזרק מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 23 כדי להזריק תוך צפקית תמיסת BrdU שהוכנה טרייה של 50 מיליגרם לק"ג לבעל החיים. בנקודת הסיום הניסוי המתאימה, אסוף את המוח והקפיא את המוח כדי לאפשר רכישה של חתכים עטרתיים בעובי 40 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום קריוסטט והנח את החלקים לבארות בודדות של צלחת תרבית תאים של 24 בארות בתמיסת הגנה קריו לפי סדר האיסוף שלהם. לאחר איסוף כל החלקים, יש לאחסן את הדגימות בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס עד מספר חודשים.
כדי להעריך את צביעת BrdU, באמצעות תגובת פרוקסידאז, עם קומפלקס אבידין-ביוטין-פרוקסידאז, העבירו את הפרוסות מתמיסת ההגנה הקריו ל-0.1 PBS מולארי עד שהדגימות מגיעות לטמפרטורת החדר ושטפו את הרקמות שלוש פעמים במשך 10 דקות עם 0.1 PBS מולארי טרי לכל שטיפה. לאחר הכביסה האחרונה, דוגר את החלקים בתמיסת חסימת פרוקסידאז אנדוגנית למשך 30 דקות, בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שלוש שטיפות של 10 דקות ב-0.1 PBS מולארי. לאחר הכביסה האחרונה דגרו את החלקים למשך 20 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס בשתי חומצה הידרוכלורית מולרית ואחריה שטיפה אחת של 10 דקות במאגר בוראט 0.1 מולרי.
לאחר שלוש שטיפות בקור קרח 0.1 PBS מולארי דוגר על הדגימות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר בתמיסת חסימת PBS+, ולאחר מכן דגירה של לילה עם נוגדן ראשוני נגד BrdU בעכבר ב-PBS+ בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שלוש שטיפות PBS מולארי של 0.1, דגרו את הדגימות למשך שעתיים עד ארבע שעות עם הנוגדן המשני הביוטיניל המתאים של העכבר ב-PBS+ בטמפרטורת החדר. לאחר הכביסה יש לטפל בחלקים בתמיסת ABC למשך שעה בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שלוש שטיפות PBS 0.1 טוחנות.
לאחר הכביסה האחרונה העבירו פרוסות לתמיסת מצע DAB-Peroxidase למשך 2 עד 10 דקות עד שהפרוסות הופכות לאפורות כהות. אם ניתן לדמיין תאים חיוביים, שטפו את הדגימות בשלוש שטיפות מי ברז של 15 דקות ואחריהם שלוש שטיפות PBS של 0.1 טוחנות. לאחר הכביסה האחרונה השתמש במברשת רכה כדי להרכיב בזהירות את הפרוסות על שקופיות ג'לטינות, לייבוש אוויר למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
למחרת בבוקר השתמש באמצעי הרכבה קבוע כדי להניח החלקות כיסוי מעל הדגימות. כדי לכמת את התאים החיוביים של BrdU, ראשית, השתמש בהגדלה פי 4, במיקרוסקופ, כדי לזהות את הבליטה המשוננת וחפש בזהירות בשכבת התא הגרגירי לאורך ציר Z אחר גרעינים המסומנים ב-BrdU. לאחר בחירת קטע מרווח לחיפוש תאים בכל הבליטה המשוננת, ספור את כל התאים החיוביים של BrdU.
המורפולוגיה של הגרעין המסומן יכולה להשתנות בהתאם לכמות BrdU שהתא שילב. עברו לאט על ציר Z כדי לכמת את כל הגרעינים מלפחות 10 חלקים לכל חיה ולפחות חמישה בעלי חיים לכל קבוצה המשלבים צביר. לביטול קונבולוציה של תמונה, פתח את התוסף התלת-ממדי של פונקציית הפריסה של נקודת העקיפה, מלא את כל הנתונים הדרושים, לחץ על אישור ושמור את הקובץ.
לאחר מכן, פתח את התוסף DeconvolutionLab2 וגרור את תמונת ה-Z-stack המתאימה ואת קובץ ה-PSF לחריץ החלון המתאים. בחרו באלגוריתם ביטול הקונבולוציה ובמספר האיטרציות ולחצו על 'הפעל'. כדי לשלב את התמונות המפותלות לתמונת אוסף Z אחת, בחר Image and Stacks ולחץ על פרויקט Z.
מתפריט סוג ההקרנה, בחר עוצמה מקסימלית. לחץ על אישור ושמור את הקובץ. ליצירת תמונת RGB, בחר Image and Color ולחץ על Merge Channels כדי להגדיר את התמונה המתאימה לערוץ הצבע הרצוי מהתפריט הנפתח.
לאחר מכן בטל את הסימון בתיבה צור ללא הפרדות צבע. לחץ על אישור ושמור את הקובץ. לאחר יצירת כל תמונות הערוץ, פתחו לפחות שניים מקובצי התמונה ובחרו ערוצי צבע שונים לכל קובץ תמונה ליצירת תמונת RBG.
בתמונות אלה ניתן להבחין בקטעי פיתול משוננים מייצגים עם תאים מסומנים BrdU. כפי שנצפה בתמונות המוגדלות הללו של הקטעים, התאים המסומנים מדגימים צביעה כהה עזה. שימו לב, ישנם הבדלים משמעותיים במספר התאים החיוביים ל-BrdU בין חולדות מבוקרות שלא ביצעו פעילות גופנית לבין קבוצת הניסוי שנחשפה לפעילות גופנית, בהתאם לתוצאות מדווחות אחרות שהוכיחו כי פעילות גופנית מגבירה את התפשטות התאים בבליטה המשוננת הבוגרת.
כאשר מנסים פרוטוקול זה השתמש בתמיסות טריות וטפל ברקמה בעדינות. ההיפוקמפוס רגיש להיפרד משאר המגלשות כאשר הוא מטופל דרכו ויכול להחמיץ. ניתן להתאים הליך זה להערכת תווית ואינדקס DNA של סינתזת DNA והכפלת מחקרי התפשטות תאים מכתימים.
אנו מקווים שהמאמץ הזה הועיל לקהילה המדעית ומקל על התשובה לשאלות חדשות בחקר התפשטות התאים, כאשר טכניקת אימונוהיסטוכימיה.
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בטכניקות להדמיה של תאים חיוביים ל-BrdU לצורך מדידת נוירוגנזה בבגרות בחולדות. המאמר מפרט פרוטוקולים להכנת ריאגנטים, מתן אנלוג של תימידין, עיבוד רקמות והדמיה במיקרוסקופ כדי להעריך פרוליפראציה תאית ב-dentate gyrus.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- נוירוגנזה במבוגרים
- שגשוג תאים
- אימונוהיסטוכימיה
רקע
- סימון המיזיגוטי של תאים מתחלקים הוא חשוב להבנת תהליכי הנוירוגנזה.
- פעילות גופנית משפיעה על מספר התאים החיוביים ל-BrdU בגירוס המשונן (dentate gyrus).
- סטנדרטיזציה של טכניקות צביעה מציבה אתגרים עבור מעבדות חדשות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הזרקה תוך-פריטונית של BrdU לסמימון תאים
- פרוטוקולים סטנדרטיים של אימונוהיסטוכימיה
- מיקרוסקופיה לניתוח תמונות ולכימות
תוצאים עיקריים
- הפרוטוקול מזהה ביעילות תאים חיוביים ל-BrdU ברקמת מוח.
- נרשמו הבדלים משמעותיים בשגשוג התאים בין קבוצת הביקורת לקבוצות הניסוי.
- ניתן להתאים את השיטות המתוארות למגוון מחקרים תאיים.
מסקנות
- המחקר מספק שיטה מהימנה להערכת נוירוגנזה במבוגרים.
- התוצאות מדגישות את חשיבותה של הפעילות הגופנית בקידום נוירוגנזה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות מדויק של התרבות תאים ונוירוגנזה חיוני לתיקוף מטרות בתהליך גילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS), שבו הפחתת סיכונים מכניסטית נסמכת על סמנים ביולוגיים הדירים של יכולת התחדשות. אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית של BrdU מאפשרת ביטחון חיזוי במודלים פרה-קליניים על ידי אספקת תוצאות כמותיות מבוססות היסטולוגיה, התומכות בהחלטות המשך (go/no-go) בשלבי הגילוי המוקדמים. טכניקה זו נותנת מענה לנקודת מפנה קריטית במיון הפורטפוליו על ידי קישור מעורבות תפקודית של המטרה לשינויים מדידים בנוירוגנזה של ההיפוקמפוס.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות למסלולים נוירוגניים ותיקוף פונקציונלי של מטרות במערכות רלוונטיות למחלה.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה ישירה של תאים מתחלקים, ובכך מפחית עמימות מכניסטית במחקרי מעורבות במטרה.
- ערך חיזוי: מייצר נתונים כמותיים על פעילות תאי אב המשמשים לבסיס עבור תיעוד סדר העדיפויות של פורטפוליו ואסטרטגיות לזיהוי מועמדים מובילים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מייצר חתכי רקמה סטנדרטיים וניתנים לשחזור המתאימים לתהליכי דימות בתוכן גבוה (high-content imaging) וספירת תאים אוטומטית.
- פלט כמותי: מספק ספירת תאים מדידה חיוביים ל-BrdU, המאפשרת ניתוח תגובה למינון וסריקת תרכובות במסלולים פרוליפרטיביים.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: מבסס פלטפורמה היסטולוגית ניתנת להעברה, הישימה במודלים של מכרסמים לצורך קמפיינים עקביים של תיקוף מטרות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מקשר בין ממצאים מכניסטיים ב-dentate gyrus של מכרסמים למסלולים נוירוגניים אנושיים הרלוונטיים להפרעות קוגניטיביות והפרעות במצב הרוח.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין מודולציה של מטרות בשלב הגילוי להערכת יעילות פרה-קלינית באמצעות ביומרקרים פרוליפרטיביים שמורים.
- קידום מותאם סיכון: מספק בסיס להחלטות go/no-go על ידי מתאם בין שינויים בתהליך הנוירוגנזה המתווכים על ידי המטרה לבין תוצאות פונקציונליות במודלים התנהגותיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות על מטרות ועד לאופטימיזציה של מולקולות מובילות (lead optimization), ומספקת תיקוף מבוסס היסטולוגיה התומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים לפני השקעה משמעותית במועמדים מובילים.
- ביולוגיה של גילוי: מסייעת בבירור מסלולים ובתיקוף מטרות על ידי מתן אפשרות לגילוי משותף של BrdU עם סמנים ספציפיים לסוג התא בנישות פרוליפרטיביות.
- סריקה: מספקת תוצרי אימונוהיסטוכימיה כמותיים וניתנים לשחזור התומכים בסטנדרטיזציה של הבדיקה לאורך קמפייני סריקה.
- אנליטיקה: מייצרת נתוני ספירת תאים ונתונים מורפומטריים סטנדרטיים המאפשרים השוואה סטטיסטית בין תנאי ניסוי והשפעות טיפוליות.
- מחקר תרגומי: תומכת בהלימה של סמנים ביולוגיים על ידי ביסוס קריאה נוירוגנית שמורה הניתנת לתרגום מפתולוגיה של מכרסמים לזו של בני אדם.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמת היסטולוגיה לשימוש חוזר שניתן להפוך לסטנדרטית בין אתרים ופרויקטים לצורך תיקוף עקבי של מטרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון ניבוי בתיקוף המטרה באמצעות מדידה כמותית ישירה של התרבות תאים באזורים נוירוגניים.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות וסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות שלבים מפורטים של עיבוד רקמה, שחזור אנטיגנים וזיהוי.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות נוירוגניות, ובכך מפחית שיעורי כישלון בשלבים מאוחרים יותר.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון על ידי קישור מודולציה של המטרה לשינויים מדידים בנוירוגנזה של ההיפוקמפוס.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהיסטולוגיה, אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופיה לצורך עיבוד רקמה וזיהוי אנטיגנים מוצלחים.
- תלוי בגישה אמינה למיקרוטומים של קריוסטט, מיקרוסקופי פלואורסצנציה ותוכנות לניתוח תמונות לצורך חיתוך וכמימות.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים לתיקוף נוגדנים, תנאי חסימה (blocking) ודנטורציה של DNA כדי להבטיח הדירות בין משתמשים שונים.
- דורש התאמה של זמני האינקובציה ושל שלבי השחזור של האנטיגנים בעת היישום על סוגי רקמות שונים או שיטות קיבוע שונות.
- מוגבל על ידי שבריריות הרקמה במהלך החיתוך וההטמעה, מה שמחייב טיפול זהיר כדי לשמר את שלמות ההיפוקמפוס.
שאלות נפוצות בנושאי ביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Thymidine Analog (5‐Bromo‐2'‐Deoxyuridine) BrdU Administration and Tissue Preparation
2:02
BrdU Detection
4:40
Cell Quantification
5:33
Image Deconvolution
6:59
Results: BrdU‐Labeled Cell Identification and Quantification in Representative DG Tissue Section
7:46
Conclusion
