Name: הכנת למימדי מיקרותאי מטריצה מטריצות להערכת Schwann מפרט Cell (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: חקור את השפעת קשיחות המצע והרכב החלבונים על תאי Schwann באמצעות פלטפורמת תרבית תאים מבוקרת. השיטה כוללת הדפסת מיקרו-מגע וסימון אימונופלואורסצנטי לניתוח מכני של ביולוגיית תאי עצב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים בהכרת התמיכה מאוניברסיטת סינסינטי. המחברים גם מודים לרון פלמוזיקן מתוך המעבדה לאפיון חומרים מתקדמים של אוניברסיטת סינסינטי לצורך תמיכה.

המחברים לא דיווחו על ניגוד אינטרסים פוטנציאלי.

ה scs יכול לקדם התחדשות העצב בשל הטרנספורמציה פנוטימית שלהם פוטנציאל התחדשות לאחר פגיעה בעצב. עם זאת, איך הרמזים ECM לווסת את יכולת ההתחדשות הזו נותרת בלתי ברורה ברובו, באופן פוטנציאלי לא רק את ההתפתחות של ביואטילים כי המטרה לקדם התחדשות עצבים, אלא גם את ההבנה של המנגנונים המעורבים התחדשות העצב. כדי להתחיל לבחון את הפעולה הזאת, מצעים של תרבות התא נוצרו כאשר ניתן לשלוט במקלות ECM כגון נוקשות, ציפוי חלבונים וטופוגרפיה דביקה. היכולת של מיקרותבנית הטופוגרפיה הדביקה היא תכונה מרכזית בפרוטוקול, תוך ניצול השיטה הנפוצה של הדפסת ...

מערכת העצבים ההיקפית (היקפית) פציעות להישאר אתגר קליני גדול בטיפול רפואי על ידי התפשרות על איכות החיים עבור חולים ויצירת השפעה משמעותית באמצעות המון גורמים סוציואקונומיים1,2. התאים schwann (SC), כמו תאים גליה העיקריים ב היקפית, לספק רמזים מולקולריים הדרושים כדי לגרום התחדשות היקפית וסיוע שחזורים תפקודית בפציעות פער קצר. זה בגלל היכולת המדהימה של ה scs להפריד לתוך "תיקון" תא מושגים מתוך מיאלואידית או מיפוי פניטיפ3. התיקון SC הוא התאים הייחודיים הפנוטיפ במספר דרכים. לאחר הפציעה, ה scs להגדיל את שיעור ההתפשטות שלהם על ידי הזנה מחדש של מחזור התא ולהתחיל ביטוי של מספר גורמים משתנים כדי להקל על שימור. גורמים אלה, כגון c-Jun ו p75 ntr, הם upregulated בעוד סמנים מיאלווניים, כמו חלבון מיאלין בסיסי (mbp), הם מוסדרות4,5. בנוסף, ה scs שינוי מורפולוגיה להיות מוארך ומיושר אחד עם השני כדי ליצור להקות Büngner על פני הפגיעה באתר6. הדבר מספק מנגנון הנחיה פיזי עבור האקסונים כדי להאריך את המטרה הנכונה7. עם זאת, למרות היכולת כי ה scs יש לקדם התחדשות העצב בפציעות פער קצר, התוצאה של התאוששות תפקודית נשאר עני בפציעות חמורות. זה נובע בחלקו לאובדן של מטריקס מטריצה (ECM) רמזים הדרכה, כמו גם את חוסר היכולת של ה scs לשמור על פניטיפים משובי על פרקי זמן ארוכים של זמן8.
התחדשות העצב ותהליך ההחלמה קשורים באופן אינטימי למצב של לינה הבסיס לאחר הפציעה. טרף הבסיס היא שכבה של ecm סביב העצב המקל הדרכה ומספק הרמזים ecm מאוגד עבור אקסונים ו ה scs במקרים שבהם הוא נשאר שלם לאחר הפציעה9. מצב ה-ecm והיכולת שלה לספק רמזים מאוגדים במטריקס לתאים הוא חיוני ובעבר בחנו במגוון הקשרים שונים10,11,12,13,14. לדוגמה, זה הוכח כי הנוקשות של ecm יכול להנחות פונקציות תא כגון התפשטות ובידול11,15,16. הרכב של ecm יכול גם להוביל לתגובה סלולרית ברורה לווסת התנהגויות תא כגון הגירה בידול באמצעות מסלולים מאותת תאיים17,18. יתר על כן, מורפולוגיה התא, כולל שטח התפשטות והתארכות הסלולר, לשחק תפקיד מרכזי בוויסות הפונקציה והוא יכול להיות נשלט על ידי הרמזים ecm19מאוגד 19,20. מחקרים קודמים רבים התמקדו בתאי גזע המבדילים לתוך ליננים מוגדרים, עדיין ה scs בעלי יכולת דומה לשנות פנוטיפ מן הומסטטי, מבוגר SC בתוך עצב בריא, כדי תיקון SC מסוגל הפרשה חלבונים וגורמי גדילה תוך שיפוץ של ecm פציעה העצבים הבאה5,21. לכן, זה חיוני במיוחד כדי לזהות מנגנונים הנמצאים בבסיס היחסים בין הקיבולת הטבועה של משובי SC ו ECM מאוגד רמזים עבור התובנה בסופו של דבר לרתום את היכולת הזו להתחדשות העצב.
כדי לענות על כך, פיתחנו מתודולוגיה מפורטת כדי לייצר מצע של תרבות התא שבו נוקשות מכנית, ליגנד סוג ניתן לכוונן בקלות בטווחים הרלוונטיים פיזיולוגית. Polydimethyl תיל siloxane (pdms) נבחרה כמצע בשל המכניקה שלה מאוד מאוד מאוד משלה לעומת polyאקרילאמיד ג'ל, שם מודולוס הצעיר המרבי הוא סביב 12 kpa בניגוד pdms בסביבות 1000 kpa22,23,24. זה מועיל לעבודה בהישג יד, כפי שמחקרים שנעשו לאחרונה הראו את מודולוס של הצעיר של עצב הארנב יכול לעלות על 50 kPa במהלך הפיתוח, ובכך מציע כי טווח הנוקשות של העצבים בתוך היקפית הוא רחב יותר מאשר נבדק בעבר. חלבונים שונים מסוגלים ספיחה על מצעים pdms לנתח את הרגולציה קומבינטורית של מכניקה וליגטים על התנהגות SC. זה מאפשר את החקירה של מספר רמזים מיקרו סביבתיים בתהליך התחדשות היקפית והשוואה של רמה גבוהה של היכולת לעבוד התמקדות אך ורק על נוקשות של מצע25. יתר על כן, אלה מהונדסים התרבות תאים מצעים תואמים עם ריבוי של שיטות ניתוח כמותי כגון אימונוהיסטוכימיה, כתם מערבי, ואת תגובת שרשרת פולימראז כמותי (q-PCR).
פלטפורמה זו של תרבות התא מהונדסים מתאים מאוד לניתוח מסלולים מכניסטיים עקב רמה גבוהה של מנהרה בודדים של כל אות ECM מאוגד. בנוסף לכך, ניתן להשיג שיטות נפוצות למיקרו-תאים, כולל הדפסת מיקרו-מגעים, על מנת לאפשר הדבקה תאית מבוקרת כדי לנתח את צורת התא ביחס לרמזים אחרים המאוגדים ב-ECM24. זה קריטי כי קו מצעים השורה, אשר לקדם התארכות באוכלוסיות תאים, לספק כלי לחקות וללמוד מוארך ומשובי ה scs בתוך להקות Büngner במהלך התחדשות העצב. יתרה מזאת, מורפולוגיה סלולרית היא מווסת חזק של פונקציות תא מרובות והוא עלול להחדיר תוצאות נסיוניות אם לא נשלט26,27. תשומת לב משמעותית מסופק כעת למנגנון המסדירים את משובי SC פנוטיפ מוסדר על ידי המקלות ecm28,29,30. זה חיוני כדי לספק תובנה לתוך העיצוב של ביואטילים כי ניתן להחיל כתעלות הדרכה עצבים לסיוע התחדשות העצב היקפית. אלה פרוטוקולים מפורטים יכול בסופו של דבר להיות מיושם ככלי פוטנציאלי כדי לפענח את המנגנונים של SC ותפקוד סוג תא אחר כפי מוסדר על ידי רמזים מאוגדים ECM.

<table><tbody><tr><td>אלבומין מסרום בקר (BSA), טקסס אדום מצומד</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A23017</td><td>צביעת BSA כדי להראות מיקרו-דפוסים</td></tr><tr><td>IgG נגד עכברים,</td><td>טכנולוגיית איתות תאי</td><td>נוגדנים מקושרים HRP 7076S</td><td>נוגדן המשמש לניתוח כתמים מערביים</td></tr><tr><td>IgG נגד ארנב,</td><td>טכנולוגיית איתות תאי</td> נוגדנים מקושרים HRP <td>7074S</td><td>המשמש לניתוח</td></tr> <tr><td>כתמים מערבייםBrdU</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B23151</td><td>מגיב המשמש למדידת התפשטות תאים</td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני BrdU מצומד עם Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B35130</td><td>משמש להמחשת BrdU במבחני התפשטות תאים</td></tr><tr><td>קולגן I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10483-01</td><td>חלבון המשמש לציפוי כיסויים</td></tr><tr><td>מכונת בדיקת כוח דחיסה</td><td>TestResources</td><td></td><td>מכשיר לכימות תכונות מכניות של פולימרים</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>מדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td>מדיום תרבית תאים משלים</td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33010-018</td><td>חלבון המשמש לציפוי כיסויים</td></tr><tr><td>פלואורסצנטי מיקרוסקופ</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti2</td><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>עצור קוקטייל מעכב פרוטאז ופוספטאז (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78440</td><td>מעכב פרוטאז ופוספטאז</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23017015</td><td>חלבון המשמש לציפוי כיסויים</td></tr><tr><td>מדיום הרכבה עם DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36971</td><td>Coverslip mountant ו צביעת גרעינים</td></tr><tr><td>עכבר c-Jun נוגדן ראשוני</td><td>תרמו פישר 711202</td><td></td><td>מדעי נוגדן ראשוני להדמיית חלבון c-Jun</td></tr><tr><td>עכבר ובטא;-אקטין נוגדן ראשוני</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>3700S</td><td>בקרת טעינה לניסויי כתם מערבי</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>15140122</td><td>מדיום תרבית תאים משלים</td></tr><tr><td>Photoresist SU 2010</td><td>KAYAKU</td><td>SU8-2010</td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-2443</td><td>בלוק קשירת חלבון לא ספציפי</td></tr><tr><td>Rabbit c-Jun נוגדן ראשוני</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>9165S</td><td>נוגדן ראשוני להדמיה של חלבון c-Jun</td></tr><tr><td>חלבון בסיסי חלבון ארנב נוגדן ראשוני</td><td>Abcam</td><td>ab40390</td><td>נוגדן ראשוני להדמיה של MBP</td></tr><tr><td>Rabbit p75NTR נוגדן ראשוני</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>8238S</td><td>נוגדן ראשוני להדמיה של p75NTR</td></tr><tr><td>רודמין פלואידין</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>R415</td><td>הדמיה של שלד תא</td></tr><tr><td>מאגר RIPA</td><td>Abcam</td><td>ab156034</td><td>מאגר ליזה תאים</td></tr><tr><td>RT4-D6P2T קו תאים שוואן</td><td>ATCC</td><td>CRL-2768</td><td>קו תאים בשימוש ב ניסויים</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 בסיס PDMS וחומר ריפוי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>761036</td><td>פולימר מתכוונן המשמש לציפוי כיסויים</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15090-046</td><td>מגיב דיסוציאציה של תאים</td></tr><tr><td>מנקה UV-Ozone</td><td>Novascan</td><td></td><td>הגברת ההידרופיציליות של PDMS</td></tr><tr><td>Versene (1x)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15040066</td><td>דיסוציאציה של תאים מגיב</td></tr></tbody></table>

הכנת למימדי מיקרותאי מטריצה מטריצות להערכת schwann מפרט cell

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

מערכת העצבים ההיקפית טראומטית (היקפית) פציעות כרגע חסר טיפולים מתאימים כדי להחזיר התאוששות תפקודית מלאה. תאים schwann (ה scs), כמו התאים העיקריים גליה של היקפית, לשחק תפקיד חיוני בקידום התחדשות היקפית על ידי הבחנה לתוך תא התחדשות פניטיפ לאחר הפציעה. עם זאת, המצב הה scs של המדינה מאתגרת לשמור דרך תקופת הזמן הדרושה להתחדשות והיא מושפע משינויים במטריצה שמסביב (ECM). לכן, קביעת הגומלין המורכבים בין ה scs לבין ECM שונות כדי לספק רמזים של פוטנציאל משובי של ה scs הוא חיוני. כדי להתייחס לכך, אסטרטגיה נוצרה כאשר חלבונים ecm שונים היו נספחת על המצע polydiמתיל siloxane (pdms) אשר סיפק פלטפורמה שבה נוקשות והרכב חלבון יכול להיות מאופנן. ה scs היו הנזרע על מצעים התאים הקריטיים פונקציות הסלולר המייצגים את הדינמיקה של SC פנוטיפים נמדדו. כדי להמחיש את הגומלין בין ביטוי חלבון SC לבין מורפולוגיה הסלולר, שונים צפיפות הזריעה של ה scs בנוסף מיקרומגע בודדים מודפס דפוסים סלולריים היו מנוצלים ומאופיין על ידי immunofluorescence כתמי והאבן המערבית אבן. תוצאות הראו כי תאים עם שטח התפשטות קטן יותר ובהיקף גבוה יותר של התארכות הסלולר לקדם רמות גבוהות יותר של סמנים משובי התחדשות של SC. מתודולוגיה זו לא רק מתחילה לפענח את הקשר המשמעותי בין הפונקציה ECM והסלולר של ה scs, אבל גם מספק הנחיות לאופטימיזציה עתידית של ביואטילים בתיקון עצבי היקפי.

כדי לנתח ולכמת את הגומלין בין קשיות המצע ואת הרכב החלבון ב-SC פניטיפ, המצע לתרבות תא PDMS של מנהרה פותחה (איור 1A). בדיקות דחיסה של פולימר בבסיס שונה: ריפוי יחסי הסוכן היה מנוצל לכמת את המודולריות של צעירים (E) של המצע (איור 1B). הטווח המתקבל של ערכי מודולוס מייצג תנאי מצע רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. לאחר הכנת מצעים, ה scs היו מאפיינים מתורבתים וסלולריים שנותחו בסביבת המיקרו-מיקרו. שיעורי ההפצה של ה scs על מצעים של הרכב חלבונים שונים נותחו לראשונה. מצעים מצופי ...

מתודולוגיה זו שואפת להמחיש את המנגנונים שבהם מדובר ברמזים של מטריקס כגון קשיות המצע, הרכב החלבון ומורפולוגיה התא ויסות התא Schwann (SC) פנוטיפים.

הכנת למימדי מיקרותאי מטריצה מטריצות להערכת Schwann מפרט Cell

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

פרוטוקול זה מספק פלטפורמת תרבות תאים שבה ניתן לשלוט במדויק במאפיינים של מטריצה חוץ-תאית כגון נוקשות, הרכב חלבונים ומורפולוגיה של תאים באופן חסכוני וחסכוני. השיטה חסכונית, אינה דורשת הכשרה או מתקנים מיוחדים. הוא תואם גם לשיטות כימות תאיות מרובות כגון כתמים immunofluorescent וכתם מערבי.טכניקה זו מספקת הבנה מכנית של ביולוגיה של התא שוואן. עם תובנה נוספת על עיצוב ביו-חומרי להתחדשות מערכת העצבים, ניתן להחיל אותו על כל תא תלוי עגן. החלק המאתגר ביותר בפרוטוקול זה הוא הדפסת מיקרו-קרטקט.לפני תחילת הפרוטוקול, הדפסת מיקרו-קונקט על מצע באמצעות פלורסנט כדי לתייג את החלבון כדי לאמת חזותית את ההדפסה הסופית לתבנית. התחל על ידי ערבוב נמרץ אלסטומר בסיס PDMS וסוכני ריפוי עם קצה פיפטה עד בועות מפוזרים הומוגנית בתוך התערובת. לאחר מכן להסיר את הבועות עם ייעוד ואקום.מניחים טיפה של תערובת PDMS מיובשת על כיסוי מרובע או עגול, ולסובב את כיסוי על מעיל ספין ב 2, 500 סל"ד במשך 30 שניות. הדגירה את הכיסויים בתנור ב 60 מעלות צלזיוס, במשך שעה עד שעתיים, או בטמפרטורת החדר לילה. כדי להכין מצע בדוגמת מיקרו, מניחים רקיק סיליקון בדוגמת בתוך קוטר מעגלי 150 מילימטר על ידי 15 מילימטר גובה צלחת פטרי ויוצקים PDMS de-gassed על הוופל.ביסס את ה-PDMS בתנור בטמפרטורה של 60 מעלות במהלך הלילה. אפשר ל-PDMS להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר מכן השתמש אזמל כירורגי לחתוך בולים של 30 על ידי 30 מילימטר ריבועים המכילים את הדפוסים הנכונים דואג לא לפגוע רקיק הסיליקון.יש לטשטש את חותמות ה-PDMS ואת תלושי הכיסוי הניתנים לכוונון על-ידי טבילתם ב-70%אתנול למשך 30 דקות. כדי לאשר את היעילות של המיקרופטרן, ייבש את פני השטח של חותמות PDMS באמצעות זרם אוויר מסונן ופתרון פיפטה 15 מיקרוגרם למיליליטר BSA כדי לכסות את כל הצד בדוגמת החותמת. הדגירה את הבולים עם פתרון BSA במשך שעה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר סחת חלבון, ולאחר מכן אוויר לייבש את הבולים כדי להסיר את פתרון BSA.השתמש בזרם האוויר המסונן כדי לייבש את פני השטח של תלושי הכיסוי הניתנים לכוונון. הביאו את הצד בדוגמת החותמת למגע קונפורמי עם הכיסוי הניתן לכוונון כדי לאפשר סגיפה של BSA על משטח הכיסוי, ולחץ בעדינות על החותמת כנגד הכיסוי במשך חמש דקות. בדוק את המיקרופטרן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן FITC.כדי להדפיס אזורי דבק של תאים במקום תבניות פלואורסצנטיות, יש להחליף למינין בחלבון BSA. מוציאים את הבולים מתלי הכיסוי ומעבירים את מחליקי הכיסוי לצלחת מעקרת של שש בארות. הוסיפו שני מיליליטר של תוסף F-127 פלואורוני 0.2% לכל באר כדי לכסות את פני השטח של תלוש הכיסוי ולהדגיר את הצלחת במשך שעה בטמפרטורת החדר.שאפו את פתרון ה-F-127 ושטפו את החלקות הכיסוי חמש פעמים עם PBS, פעם אחת עם מדיום תרבות התאים, ואז זרעו את תאי שוואן בצפיפות זריעה של 1000 תאים בריבוע של 1000 תאים. 45 דקות לאחר זריעת התא, להסיר את מדיום תרבות התא ולשטוף את הכיסוי מחליק פעמיים עם PBS כדי למנוע תאים מרובים לבקיע לאותה תבנית. שמור על תאים בסביבת תרבות התאים הרצויה במשך 48 שעות לפני הכימות.ליצירת מצעים של תרבות תאים בדוגמת קו לבחינת תאים מיושרים, הכינו את הבולים לפי כיווני כתב היד וחתכו אותם לממדים הרצויים. הכינו שתי מנות פטרי מצופות משטח PDMS ניתן לכוונון כפי שתואר קודם לכן, ובצעו הדפסת מיקרו-פונטקט להדפסת אזורי דבק תאים בדוגמת קו על אחת המנות. לאחר הסרת הבולים, מלאו את צלחת פטרי בארבעה מיליליטר של 0.2% פתרון F-127 פלורון והדגירה במשך שעה.שוטפים כל צד של חותמת PDMS שלוש פעמים עם 70% אתנול ומייבשים אותו באוויר. סובב את חותמות ה- PDMS והדפס את אזור דבק התא הלא מרוסן בצלחת פטרי השנייה כמתואר לעיל. לאחר הדגירה את הכלים עם פתרון F-127, להסיר את הפתרון ולשטוף את הכלים שלוש פעמים עם PBS ופעם אחת עם מדיום תרבות תאים טריים.לאחר מכן זרעים תאים על הכלים, ולשמור אותם בתנאים הרצויים במשך 48 שעות לפני הכנת lysates. כדי להכין ליזאטים, לשטוף את התאים עם PBS קר כקרח במשך שתי דקות, ולאחר מכן להוסיף 80 microliters של פתרון RIPA, מוכן על פי הוראות כתב היד, על כל אזור דבק התא, ו דגירה התאים על גוש קרח במשך 25 דקות. לגרד את התאים Schwann עם מגרד התא במשך חמש דקות ולאסוף את lysate לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה שכותרתו 1.5 מיליליטר.צנטריפוגה ליאזט במשך 15 דקות ב 12 אלפים G וארבע מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatant ולהעביר אותו צינור מיקרוצנטריפוג נקי. מצעים מצופים למינין גרמו לקצב התפשטות גבוה יותר בהשוואה למצעים מצופים קולגן ופיברונצין.תאי שוואן על מצעים עם ציפוי למין ומודולי שונה הראו כי מצעים רכים יחסית הפחיתו את שיעורי התפשטות התאים. התאים נותחו גם לביטוי חלבון. ביטוי גורם שעתוק c-יוני היה מוסדר כמו מצעים הפכו רכים יותר.עם זאת, זה היה מוסדר באופן משמעותי על המצע הרך ביותר. על מצעים נוקשים, מצעים מצופים קולגן הביאו לביטוי c-Jun הגבוה ביותר, כמו מצעים הפכו רכים יותר, למינין הראה את הרמות הגבוהות ביותר של c-יוני. התאים היו מוכתמים אז ברודאמין-פאלודין כדי לחקור את תפקיד התפשטות התאים ואת האזור בביטוי c-Jun.כאשר נוצרו קווי דבק תאים על מצעי תרבות התאים, יחס הגובה-רוחב הגרעיני של תאים הנזרעים על מצע התבנית גדל בהשוואה לזה של תאים על מצעים לא מגולפים. ביטוי של קולטן נוירוטרופין c-יוני ו p75 היו מוסדר בתאים צפופים עם אזור התפשטות קטן יותר. תאים בעלי תבנית קו גרמו גם לביטוי גבוה יותר הן של c-Jun והן של p75 NTR בהשוואה לתאים שאינם בעלי תבנית.גיאומטריות דבק תא מודפס Microcontact נוצרו כדי לשלוט במדויק באזור הפצת תאים והתאונה תוך ביטול אינטראקציות בין תאים לתאים. הגדלת יחס הגובה-רוחב התאי גרמה להגדלת התארכות גרעינית. הביטוי של c-Jun היה מוסדר הן על ידי התארכות הסלולר והן על ידי עיכוב הפצת תאים.כתמי שפעת חיסונית הן עבור גרעינים והן עבור actin אישרו כי אזור התפשטות התא וההת התא נשלטו במדויק באמצעות שיטת micropatterning זו. טכניקה זו סללה דרך להשתמש במצעים הניתנים לכוונון שלנו כשיטה לנתח באופן מכני את ביולוגיית התאים של שוואן ואת האיתות בהקשר של התחדשות וסרטן.

preparation-tunable-extracellular-matrix-microenvironments-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מדגימים כיצד לנתח ותרבות חומוס הגנגליון E4 statoacoustic ו E6 explants חוט השדרה. Explants הם תרבותי תחת בסרום ללא תנאים ג'ל קולגן 3D עבור 24 שעות. ההיענות Neurite נבדק עם המדיום גורם הגדילה, שיושלם עם חלבון מצופים חרוזים.

Dissection והתרבות של גנגליון צ&#39;יק Statoacoustic Explants ואת חוט השדרה ג&#39;ל קולגן עבור מבחני תוצאה Neurite

שיטת הקרנה פונקציונלית קומבינטורית לתובנה להשפעות של ההרכב המולקולרי של microenvironments על תפקודים תאיים מתוארת. השיטה מנצלת את הטכנולוגיות קיימות microarray מבוססים לייצר מערכים של microenvironments קומבינטורית מוגדר התומכים הידבקות תא וניתוח פונקציונלי.

ייצור ושימוש של microarrays Microenvironment (MEArrays)

סרטון זה מדגים שיטה להשגת תאים דמויי תאי Schwann מתאי סטרומה רב-פוטנטיים של מח עצם (BMSCs). בתחילה, BMSCs לעבור טיפול היפוקסיה, ואחריו התמיינות מכוונת לתוך תאי אב עצביים. לאחר מכן, נעשה שימוש בתנאי מדיה ותרבית ספציפיים כדי לגרום לטרנספורמציה של תאי אב אלה לתאים דמויי תאי Schwann.

יצירת תאים דמויי תאי Schwann מתאי סטרומה של מח עצם

הסרטון מדגים את ההתרבות המשותפת של נוירוני גנגליון שורש גבי (DRG) עם תאי Schwann. תאי עצב DRG גדלים תחילה על קרום מתוח מראש לצמיחה מיושרת של אקסונים. לאחר מכן מוצגים תאי Schwann, אשר נצמדים לאקסונים, מבודדים אותם ומקדמים הישרדות ותפקוד של תאי עצב.

תרבית משותפת של תאי Schwann עם נוירוני DRG על קרום מתוח מראש

הסרטון מתאר את הכנת המצע בתבנית מיקרו לחקר מפרט הפנוטיפ של התא. חותמת PDMS מצופה חלבון משמשת להעברת המיקרו-תבנית על גבי מכסה מצופה PDMS. לאחר מכן מטפלים בכיסוי עם חומר פעילי שטח כדי לעכב את הידבקות התאים במשטחים הלא רצויים. לאחר מכן מוסיפים תאים כדי להתיישב בתבנית ומודגרים לניתוח נוסף.

הכנת מצע מיקרו-דפוס לחקר פנוטיפים של תאי Schwann

כאן אנו מתארים תא שוואן (SC) assay הגירה שבSCS מסוגל לפתח לאורך האקסונים של הארכה.

ניתוח התפתחות תאי שוואן Murine לאורך האקסונים של גידול

מעבר אפיתל למזנכימלי (EMT) מאפשר לסרטן להפוך לפולשני. כדי לחקור EMT, מתואר מודל מבחנה מבוסס תאי גזע עצביים (NSC) נטול סרום ואנזימים. מערכת סטנדרטית זו מאפשרת הערכה כמותית ואיכותית של נדידת תאים, ביטוי גנים וחלבונים. המודל מתאים לגילוי תרופות.

Enzyme- ואת הסרום ללא דגם תרבית תאי גזע עצבי לחקירות EMT המתאימים גילוי תרופות

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של נוירונים של גנגליון שורש הגב (DRG) שבודדו מחולדות ואת התרבית של נוירוני DRG על מערכת תרבית תאים סטטית מתוחה מראש כדי לשפר את יישור האקסונים, עם תרבית משותפת של תאי שוואן (SCs) כדי לקדם מיאלינציה.

גישת שפר מערך myelination של נוירונים שורש הגבה גנגליון

תאים מוחיים סטרומליים (MSC) עם פוטנציאל עצבי קיימים בתוך מוח העצם. הפרוטוקול שלנו מעשיר אוכלוסייה זו של תאים באמצעות תנאים מוקדמים היפוקסי ולאחר מכן מפנה אותם להפוך לתאי Schwann בוגרת.

Hypoxic Preonditioning של תאים יליד מארו נגזר כמקור לדור של תאים שוואן בוגרת

מאמר זה מתאר את המתודולוגיה מפורט כדי להכין מערך מרובב מלאכותי תאית MicroEnvironment (MACME) עבור תפוקה גבוהה מניפולציה גופנית, כימית רמזים היה שווה ויוו הסלולר microenvironments וכדי זיהוי הסביבה התאית אופטימלית עבור תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs) עם פרופיל תא בודד.

ייצור של מערך מרובבת MicroEnvironment הסלולר מלאכותי

כאן, אנו מספקים שיטה לניתוח התנהגות של האקטונים הגדלים בתוך מטריצות תלת-ממד, מחקה את התפתחותם הטבעית.

דור של 3-D הידרוג'לים קולגן מבוססי לנתח צמיחה Axonal התנהגות במהלך פיתוח מערכת העצבים

חקור את השפעת קשיחות המצע והרכב החלבונים על תאי Schwann באמצעות פלטפורמת תרבית תאים מבוקרת. השיטה כוללת הדפסת מיקרו-מגע וסימון אימונופלואורסצנטי לניתוח מכני של ביולוגיית תאי עצב.

הכנת למימדי מיקרותאי מטריצה מטריצות להערכת Schwann מפרט Cell

גלה סרטונים נוספים