Name: השגת אוסטיאוציטים ראשוניים באמצעות שבר קלוואריאלי מוריני של אוסטיאוציטים המבטאים GFP (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: למד שיטה יעילה לבידוד אוסטיאוציטים ראשוניים המבטאים GFP מעכברי dmp1-topaz ניאונטליים באמצעות מיון תאים פלואורסצנטי. הפרוטוקול מקצר זמן טיפול ומגביר תפוקת תאים חיים עם מינימום זיהום.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק JSPS KAKENHI מהאגודה היפנית לקידום המדע (מס' 19K10397 ל- H.K. ומס' 18K09862 ל- I.M).

כל ההליכים והטיפול בבעלי חיים בוצעו בהתאם לכללים ולתקנות של אוניברסיטת טוהוקו.
1. דיסקציה של קלבריה עכבר dmp1-topaz שזה עתה נולד
<ol><li>עבור פרוטוקול זה, השתמש בגורים בני 6\u20127 של עכברי C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J. הרדימו עכברים עם שאיפת איזופלורן 5% ולאחר מכן העבירו את הגורים לאתנול 70%.</li>
	<li>העבירו את הגור שעבר המתת חסד לצלחת תרבית לא מטופלת.</li>
	<li>בעזרת מספריים ופינצטה, לתפוס את העור בבסיס הגולגולת ולעשות חתך.</li>
	<li>באמצעות החתך הראשון כנקודת מוצא, לחתוך משני הצדדים הרוחביים של הגולגולת מול האוזניים, להסיר את העור, ולחשוף את calvaria.</li>
	<li>החזיקו את הראש מגשר האף וחתכו את הקלבריה לאורך תפר הלמבדואיד. חותכים לאורך הקצוות הרוחביים של עצמות הקודקוד ומרחיבים אותו כך שיכלול את החלק הקדמי.</li>
	<li>להפריד את calvaria מרקמת המוח הבסיסית. הערה: כדי להבטיח קלבריה גרמית נקייה עם חיבור רקמות רכות מינימלי לא לחתוך עמוק לתוך העצם; לשם השוואה, אדם צריך להיות מסוגל לראות את הצל של המספריים מתחת לעצם.</li>
	<li>מעבירים את הקלבריה לתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS, pH 7.4 לאורך כל הפרוטוקול). ודא שהחלק הקעור פונה כלפי מעלה.</li>
</ol>2. שבירה של קלבריה עכבר שזה עתה נולד
<ol><li>מעבירים עד 5 קלבריה לצינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל 5 מ"ל של תמיסת קולגנאז 2 מ"ג/מ"ל. יש להשתמש בתמיסת collagenase טרייה שהוכנה ממש לפני השימוש.<ol><li>להכנת תמיסת collagenase טרייה, יש להוסיף אבקת collagenase למאגר בידוד (70 mM NaCl, 10 mM NaHCO 3, 60 mM סורביטול,3 mM K 2 HPO4, 1 mM CaCl 2, אלבומין בסרום בקר 1 מ"ג/מ"ל (BSA), 5 מ"ג/מ"ל גלוקוז ו-25 מ"מ HEPES) במינון2מ"ג/מ"ל. ממיסים את אבקת הקולגנאז על מערבל מגנטי.</li>
		<li>הפעל את תמיסת הקולגנאז דרך יחידת מסנן סטרילית של 0.22 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מ"ל ושמור אותה על קרח לאורך כל הפרוטוקול.</li>
	</ol></li>
	<li>לדגור את calvaria ב 37 ° C במשך 20 דקות על שייקר ב 300 סל"ד כדי לקבל חלק 1.</li>
	<li>השליכו את העיכול של חלק 1, שטפו את הקלבריה עם 5 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) והשליכו את השטיפה.</li>
	<li>לדגור את calvaria ב 5 מ"ל של 5 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) המכיל 1 מ"ג / מ"ל BSA ב PBS, PH 7.4 ב 37 ° C במשך 15 דקות על שייקר ב 300 סל"ד.</li>
	<li>לאסוף את digest בצינור חרוטי 50 מ"ל. לשטוף את calvaria עם 5 מ"ל של PBS ולהוסיף את פתרון לשטוף לעכל. הערה: בכל נקודה של איסוף העיכול והשטיפה, פיפטה של העצמות בתמיסה שלהם כדי לנתק את התאים מהעצם ולמנוע כפילויות וצברי תאים.</li>
	<li>כדי להשיג חלק 2, צנטריפוגה את העיכול ב 300 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות. יש להשליך את הסופרנטנט, להשהות מחדש את הגלולה ב-8 מ"ל של α-Minimum Essential Medium (MEM) המכיל 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), 100 IU/מ"ל פניצילין G ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין. זרעו על צלחת תרבית בקוטר 10 ס"מ. לדגור על חלק 2 ב 37 ° C תחת 5% CO2.</li>
	<li>לדגור את calvaria ב 5 מ"ל של תמיסת collagenase ב 37 ° C במשך 20 דקות על שייקר ב 300 סל"ד.</li>
	<li>כדי לאסוף את מקטע 3, חזור על שלבים 2.5\u20122.6. לדגור על חלק 3 ב 37 ° C תחת 5% CO2. הערה: בשלב זה, העצמות יהפכו קטנות יותר, והן יצטמצמו לרסיסים. כדי להבטיח שאף עצם לא יישאב בטעות לתוך העיכול, מה שמוביל לאובדן תאים בתהליך, השתמשו בפיפטת קצה קטנה לאיסוף העיכול (1000\u2012200 μL פיפטה קצוות).</li>
	<li>לדגור את calvaria ב 5 מ"ל של תמיסת collagenase ב 37 ° C במשך 20 דקות על שייקר ב 300 סל"ד.</li>
	<li>כדי לאסוף את מקטע 4, חזור על שלבים 2.5\u20122.6. לדגור על חלק 4 ב 37 ° C תחת 5% CO2.</li>
	<li>לדגור את calvaria ב 5 מ"ל של 5 mM EDTA המכיל 1 מ"ג / מ"ל BSA ב PBS (pH 7.4) ב 37 ° C במשך 15 דקות על שייקר ב 300 סל"ד.</li>
	<li>כדי לאסוף את מקטע 5, חזור על שלבים 2.5\u20122.6. לדגור על חלק 5 ב 37 ° C תחת 5% CO2. אוסטיאוציטים יכולים להיות מוכנים למיון באותו יום או בתרבית עד 24 שעות לפני המיון.</li>
</ol>3. הכנת אוסטיאוציטים למיון תאים מופעל פלואורסצנטי
<ol><li>שאפו את המדיום של כל חלק תא ושטפו בעדינות עם 10 מ"ל PBS פעמיים.</li>
	<li>הוסף 5 מ"ל של 0.5% טריפסין-EDTA ב- PBS ודגור על התאים במשך 5 דקות ב 37 ° C. הוסף 5 מ"ל של 10% FBS α-MEM ופיפטה כדי לנתק את התאים בעדינות. שלב את התאים בכל שבר על ידי סינון דרך מסננת תאים 40 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל.</li>
	<li>לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS ולאסוף על ידי סינון דרך מסננת תאים 40 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות.</li>
	<li>שאפו את הסופרנאטנט והוסיפו 10% FBS α-MEM לכדור. התאם את ריכוז התא לכ- 1 x 107 תאים/מ"ל.</li>
	<li>סנן את התאים בצינור רשת ניילון בגודל 35 מיקרומטר. התאים מוכנים כעת ל- FACS.</li>
	<li>עבור פרוטוקול זה, השתמש בפייה בגודל 100 מיקרומטר. נוזל האיסוף צריך להיות מורכב מ -10% FBS α-MEM. יש לשמור את הדגימה ממוינת בטמפרטורה של 4°C בכל המיון, במידת האפשר.</li>
	<li>לפני המיון, מטב את ה- gating להסרת לכלוכים ותאים על-ידי התאמת אזור הפיזור הצדדי (SSC) ואזור הפיזור הקדמי (FSC). בטל כפילויות על-ידי התאמת רוחב SSC לעומת גובה SSC ואזור FSC לעומת רוחב FSC. יש להשתמש באוסטיאוציטים שליליים של GFP כבקרה להתאמת הפרמטרים של מכשיר המיון.</li>
	<li>לאחר השלמת איסוף התאים, צנטריפוגו את התאים ב 300 x גרם ב 4 ° C במשך 10 דקות. לשטוף תאים עם PBS. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות.</li>
	<li>השעה מחדש את התאים והתאם את המספר לפי הצורך באמצעות 10% FBS α-MEM.</li>
</ol>

<ol><li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+and+death+of+bone+cells%3A+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensation+and+Transduction+in+Osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+osteovision%22%5BJournal%5D)">Mechanosensation and Transduction in Osteocytes.</a> BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).</li>
<li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li>
<li>Lane, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid-Treated+Mice+Have+Localized+Changes+in+Trabecular+Bone+Material+Properties+and+Osteocyte+Lacunar+Size+That+Are+Not+Observed+in+Placebo-Treated+or+Estrogen-Deficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).</li>
<li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Osteocyte%3A+An+Endocrine+Cell+...+and+More%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li>
<li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of osteocytes.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).</li>
<li>Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte-specific+monoclonal+antibody+MAb+OB7.3+is+directed+against+Phex+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).</li>
<li>Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).</li>
<li>Kramer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte+Wnt%2F%CE%B2-Catenin+Signaling+Is+Required+for+Normal+Bone+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Osteocyte Wnt/β-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis.</a> Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).</li>
<li>Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+Osteocyte-like+Cell+Line%2C+MLO-Y4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).</li>
<li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+osteoid+preosteocyte-like+cell+MLO-A5+that+spontaneously+mineralizes+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).</li>
<li>Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+Osteocytes+in+Their+3D+Native+Matrix+Versus+2D+In+Vitro+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Osteoporosis+Reports%22%5BJournal%5D)">Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).</li>
<li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li>
<li>Spatz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+Inhibitor+Sclerostin+Is+Up-regulated+by+Mechanical+Unloading+in+Osteocytes+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).</li>
<li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+relevance+of+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">The clinical relevance of cancer cell lines.</a> Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).</li>
<li>Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+tumor+characteristic+gene+expression+in+cell+lines+using+a+tissue+similarity+index+%28TSI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).</li>
<li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dentin+matrix+protein+1+expression+during+osteoblastic+differentiation%2C+generation+of+an+osteocyte+GFP-transgene%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene.</a> Bone. 35 (1), 74-82 (2004).</li>
<li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> Bone. 45 (4), 682-692 (2009).</li>
<li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+osteocyte+regulation+of+bone+homeostasis+through+RANKL+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).</li>
<li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology.</a> Bone. 54 (2), 296-306 (2013).</li>
<li>Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li>
<li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHalleux%2C+C+%22Bone+Research+Protocols%22">Bone Research Protocols</a>. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana Press. 55-66 (2012).</li>
<li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedizinische+Technik+%28Berlin%29%22%5BJournal%5D)">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

האוסטיאוציטים המבודדים הראשונים היו מקלבריה עוף7 שבודד באמצעות (OB7.3) או הגרסה העופית של PHEX; עם זאת, שיטה זו מוגבלת על ידי הזמינות של נוגדנים מעשיים, כמו נוגדנים ספציפיים אוסטיאוציטים כי הם גם ספציפיים specie צריך להיות מיוצר. החוקרים השתמשו בשינוי שונה של התהליך האנזימטי הרציף כדי לקבל אוסטיאוציטים מעצמות ארוכות של עכברים וחולדות; הטוהר המדווח של תרבויות אלה נקבע על כ-70%9. פיתוח מודל עכבר ה-cre איפשר הנדסת אוסטיאוציטים, המבטאים GFP על פני השטח שלהם. מודל עכבר זה, יחד ע...

אוסטיאוציטים הם תאים ממוינים סופניים מאבות אוסטאובלסטיים שהוטמעו במטריצה המופרשת שלהם1. הם התאים הנפוצים ביותר ומאריכי החיים ביותר בקרב אוכלוסיות תאי עצם. הם שוכנים בתוך לאקונה ויש להם מורפולוגיה סטלטלית אופיינית עם דנדריטים המשתרעים דרך ערוצים הנקראים canaliculi ויוצרים רשת נרחבת של תקשורת וחילופי חילוף חומרים עם סביבתם ומשטח העצם2. אוסטיאוציטים כוריאוגרפים הן אוסטאובלסטים והן אוסטאוקלסטים תפקידים בעיצוב מחדש של העצם, הם התאים המכנו-סנסוריים העיקריים המעניקים הסתגלות לעומס מכני3, מעורבים בהומאוסטזיס פוספט4 ובמינרליזציה של מטריצת עצם5, ויחד עם המערכת הלאקונקנאליקולרית, הם פועלים כאיבר אנדוקריני המאותת לרקמות מרוחקות6.
אוסטיאוציטים ממוקמים בתוך מטריצה מינרלית, המגבילה את הנגישות והופכת את בידודם למאתגר, ובכך מעכבת חקירה חוץ גופית. אחת משיטות הבידוד הראשונות תיארה אוסטיאוציטים מבודדים מקלבריה עוף באמצעות נוגדן חד-שבטי ספציפי לאוסטאוציטים (OB7.3)7 אשר מאוחר יותר נודע כגרסה העופות של PHEX (גן מווסת PHosphate עם הומולוגיה לאנדופפטידאזות על כרומוזום X)8. חוקרים אחרים השתמשו בעיכול רציף של חולדה 9 או עכבר 10 עצמות ארוכות כדי להשיג שברים עשירים באוסטיאוציטים שבהם דווח על טוהר אוסטיאוציטים בסביבות70%9. מגבלות הליך זה כוללות את הטוהר התת-אופטימלי של תרביות מזוהמות בסוגי תאים אחרים מלבד אוסטיאוציטים, וכי אוסטיאוציטים עלולים להיות מגודלים על ידי תאים אחרים בתרבית מכיוון שאוסטיאוציטים איבדו את היכולת להתחלק. אתגרים אלה מגבילים את השימושיות של תרבויות ארוכות טווח.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותחו קווי תאים אוסטיאוציטים שונים. קו התאים MLO-Y411 וקו התאים MLO-A512 הם בעיקר קווי התאים הנחקרים ביותר אשר שימושיים לחקר אוסטיאוציטים בשלב מוקדם; עם זאת, הם פחות שימושיים לחקר איתות אוסטיאוציטים בוגר מכיוון שהם מבטאים רמות נמוכות של סקלרוסטין ו- FGF2313, שניהם סמני אוסטיאוציטים בוגרים. קווי תאים אחרים, כולל IDG-SW3 14 ו- Ocy45415, מבטאים רמות גבוהות של סקלרוסטין ו- FGF23 ושימושיים בחקר שלב האוסטיאוציטים המאוחר. קווי תאים מתגלים ככלי מחקר שימושי; עם זאת, הם אינם באים ללא מגבלות מכיוון שהם אינם מייצגים באופן מלא את הביולוגיה של התא הראשוני. קווי תאים שונים מייצגים שלבים התפתחותיים שונים של ספקטרום הבשלות של אוסטיאוציטים, וקווי תאים אינם מייצגים את ההטרוגניות של אוסטיאוציטים ראשוניים16,17.
כדי להשיג תרביות טהורות של אוסטיאוציטים ראשוניים, החוקרים ניצלו את מודל עכבר CRE שבו מקדם dmp1 של 8-kb משמש להנעת ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) באוסטיאוציטים18,19. עכברים טרנסגניים כפולים (pOB-Col 2.3- GFP-cyan ו- DMP1-GFP-topaz) על ידי Paic et al.19 ועכברים טרנסגניים dmp1-topaz על ידי Nakashima et al.20 שימשו להשגת אוכלוסיות אוסטיאוציטים. שבו הם השתמשו בעיכול רציף ו- FACS של אוסטיאוציטים המבטאים GFP כדי לרכוש תרביות של אוסטיאוציטים ראשוניים 19,20. כיוון ה-cre בעכבר הכתב Ai9 של 10 קילו-בתים dmp1, המפעיל את חלבון tdTomato, הוכח כקיים באוסטיאוציטים, אוסטאובלסטים, שרירים ותאים בתוך מח העצם. למקדם dmp1 של 8 קילובייט הייתה תבנית ביטוי זהה, אך רק חלק מהאוסטאובלסטים ותאי מח העצם ביטאו את החלבון, מה שמצביע על כך שמקדם dmp1 של 8 קילובייט הוא ספציפי יותר21. למרות זאת, יש לפרש בזהירות את התוצאות המתקבלות באמצעות מקדם dmp1 8-kb, ופרופילי ביטוי גנים צריכים להתבצע באופן שגרתי באמצעות סמנים ספציפיים לאוסטאובלסטים לעומת אוסטאובלסטים כדי להבטיח שהאוכלוסייה המתקבלת היא בעלת טוהר גבוה מספיק.
סמני אוסטאוקלסט OSCAR ו- Dcstamp נמצאו באוכלוסיות אוסטיאוציטים לא מדולדלים לעומת אוכלוסיות אוסטיאוציטים מדולדלות, ממצא זה הוביל את המחברים למסקנה כי תקצירים המתקבלים משברים של 8-kb dmp1-topaz קלבריה יילודים ומיון GFP מזוהמים בתאים המטופויטיים. ניתן היה למתן את הזיהום בתאים המטופויטיים על ידי הידוק שער המיון של GFP, מאחר שלתאים המטופויטיים חיוביים ל-GFP הייתה עוצמת GFP נמוכה באופן סביר מאשר לתאים מזנכימליים חיוביים ל-GFP (אוסטיאוציטים)22.
השיטות לחקר אוסטיאוציטים במבחנה תרמו לעושר המידע האחרון על ביולוגיה של אוסטיאוציטים. עם זאת, בידוד אוסטיאוציטים נותר הליך עתיר עבודה וארוך עם תפוקת תאים נמוכה. השיטה המתוארת של עיכול עצם באמצעות collagenase ו EDTA לעתים קרובות עד חלק 823, לוקח כמה שעות שבהן כדאיות אוסטיאוציטים הוא מס. חוקרים דיווחו על שימוש בשברים (2\u20125) למיון תאים 20, והראו כי פרופיל הביטוי של גנים הקשורים לאוסטיאוציטים לעומת אלה של אוסטאובלסטים מאשר את ההצלחה של בידוד אוכלוסיות אוסטיאוציטים טהורים20. במאמר זה נתאר את תהליך קבלת השברים (2\u20125), ונשווה את תפוקת האוסטיאוציטים מכל שבר החל משבריב 1 עד 8 כדי לקבוע את חזרתם של אוסטיאוציטים בכל שבר. אנו מתארים גם את הדיסקציה של קלבריה עכבר dmp1-topaz שזה עתה נולד ועיכול קלווריאלי באמצעות collagenase וחומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA), כמו גם הכנת תאים עבור FACS.

<table><tbody><tr><td>BD FACSDiva תוכנה</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>רכישת נתונים וניתוח BD</td></tr><tr><td>Falcon Tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>צינור 12 x 75 מ"מ עם מכסה מסננת תאים, 35 &mu; M רשת ניילון.</td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>סיגמא-אולדריץ', מיזורי, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז</td><td>וואקו, אוסקה, יפן</td><td>034-22363</td><td>0.2% (w/v), תערובת קולגנאז גולמית שמקורה ב-C. histolyticum.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Dojindo, קומאמוטו, יפן</td><td></td><td>5mM EDTA מוכן עם 0.1% BSA</td></tr><tr><td>FACSAriaTM II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Biowest, Nuaill&eacute;, צרפת</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> בידוד <td>70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM סורביטול, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) גלוקוז ו-25 מ"מ יחידת מסנן סטרילית HEPES</td></tr><tr><td>Millex</td><td>Merck Millipore, אירלנד</td><td>SLGV033RS</td><td>0.22&mu; m</td></tr><tr><td>מסננת תאי ניילון</td><td>FALCON, NY, USA</td><td></td><td>40&mu; m</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies, ניו יורק, ארה"ב</td><td></td><td>0.5% x10. מדולל ל-x1 ב-PBS</td></tr> <tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Wako, אוסקה, יפן</td><td></td><td>מכיל 10% סרום בקר עוברי, 100 IU/ml פניצילין G ו-100 &mu; גרם/מ"ל סטרפטומיצין</td></tr></tbody></table>

השגת אוסטיאוציטים ראשוניים באמצעות שבר קלוואריאלי מוריני של אוסטיאוציטים המבטאים gfp

Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

האוסטאוציט, שבעבר נחשב לתושב פסיבי של העצם בהתחשב בתפקוד מאחורי הקלעים של חישת עומס מכני, מובא כעת לאור הזרקורים והוכח שיש לו פונקציות עיקריות רבות כמו שינוי פעיל של המטריצה החוץ תאית ויצירת איבר אנדוקריני עם המערכת הלאקונקנאליקולרית התוחמת אותו ושולח הודעות לאתרים מרוחקים. הודות לשיטות שאפשרו לבחון את האוסטיאוציטים במבחנה מבידוד אוסטיאוציטים ראשוניים לשורות תאים דמויי אוסטיאוציטים, אוסטיאוציטים חווים כעת עניין מהדהד ונחשול של ידע על מבנה ותפקוד. היבטים רבים של הביולוגיה של אוסטיאוציטים ואינטראקציה עם רכיבים מולקולריים אחרים עדיין לא התגלו. בפרוטוקול זה, אנו מתארים בפירוט את הבידוד היעיל של אוסטיאוציטים ראשוניים מקלבריה של עכבר ילודים dmp1-topaz, המבטאים את החלבון הפלואורסצנטי הירוק באוסטיאוציטים, באמצעות שבירת תאים ולאחר מכן רכישת תרביות של אוסטיאוציטים ראשוניים על ידי FACS.

מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את התהליך של קבלת תרביות של אוסטיאוציטים ראשוניים מקלבריה של עכבר ילודים dmp1-topaz באמצעות תהליך שבר באמצעות collagenase כדי לפרק את מטריצת הקולגן ו- EDTA עבור כלציית סידן, ולאחר מכן תאים מוכנים ל- FACS כדי להפריד אוסטיאוציטים מאוכלוסיות תאים אחרות.
שיטות להשגת אוסטיאוציטים ראשוניים מקלבריה עכברית ילודים מתארות לעתים קרובות את השימוש בשברים (1\u20128) למיון23. כדי לבחון את יעילותה של שיטה זו, השווינו את תפוקת האוסטיאוציטים שהתקבלו מקלבריה אח...

פרוטוקול זה מתאר דיסקציה של קלבריה עכברית dmp1-topaz בילוד ובידוד של אוסטיאוציטים המבטאים את החלבון הפלואורסצנטי הירוק באמצעות עיכול ושבירה של תאים, בנוסף להכנת אוסטיאוציטים למיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS).

השגת אוסטיאוציטים ראשוניים באמצעות שבר קלוואריאלי מוריני של אוסטיאוציטים המבטאים GFP

The osteocyte, once thought to be a passive resident of the bone given the backstage function of sensing mechanical loading, is now brought to the ...

בידוד אוסטאוציטים ראשוני הוא הליך ממושך שלעתים קרובות משאיר באזורי תאים נמוכים. פרוטוקול זה מספק שיטות יעילות לבידוד מספרים גבוהים של אוסטאוציטים ראשוניים המבטאים GFP. פרוטוקול זה מפחית את זמן הטיפול ומאפשר להשיג מספר גבוה יותר של אוסטאוציטים בהליך יחיד עם זיהום מינימלי מתאים המטופויאטיים או מזנכימליים.לבידוד אוסטאוציטים המבטאים GFP, הכניסו גורי עכברים טרנסגניים לאחר הלידה לתוך צלחת תרבית לא מטופלת, והשתמשו במספריים ובפינצטה כדי לתפוס את העור בבסיס הגולגולת. השתמש במספריים כדי לבצע חתך ראשוני בעור המורם, ואחריו חתכים משני צידי הגולגולת מול האוזניים. הסר את העור כדי לחשוף את הקלווריה והחזק את הראש מגשר האף, חתוך את הקלווריה לאורך תפר הלמבואיד ולאורך שולי העצמות הקודקודיות לחלק הקדמי של הרקמה.הפרד את הקלווריה מרקמת המוח הבסיסית והנח את הצד הקעור של העצמות כלפי מעלה ב-PBS. כדי להשיג את השבריר הראשון, יש לאסוף עד חמש קלווריות לכל שפופרת של 50 מיליליטר בחמישה מיליליטר של שני מיליגרם טריים למיליליטר קולגנאז, ולדגור על הרקמות ב-37 מעלות צלזיוס ו-300 סיבובים לדקה למשך 20 דקות. בתום הדגירה יש להשליך את העיכול מהשבר הראשון ולשטוף את הקלווריה עם חמישה מיליליטר PBS.החלף את הכביסה בחמישה מיליליטר של EDTA של חמישה מילי-מולרית בתוספת מיליגרם אחד למיליליטר של אלבומין בסרום בקר ב-PBS למשך 15 דקות ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור. בתום הדגירה מעבירים את העיכול לצינור חרוטי של 50 מיליליטר ושוטפים את הקלבריה בחמישה מיליליטר PBS. ואז העבירו את תמיסת הכביסה לעיכול.כדי להשיג את החלק השני, הניחו את העיכול לצנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה בשמונה מיליליטר של מדיום חיוני אלפא מינימום המכיל סרום בקר עוברי 10%, או FBS, ואנטיביוטיקה, וזרעו את התאים על צלחת תרבית של 10 סנטימטרים. לאחר מכן הנח את השבר שני תאים לתוך חממת תרבית התאים.לאחר איסוף וטיפוח שברים שלוש וארבע כפי שהודגם זה עתה. דגרו על הקלבריה בחמישה מיליליטר של EDTA של חמישה מילי-מולרי בתוספת מיליגרם אחד למיליליטר של אלבומין בסרום בקר ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול. בתום הדגירה, אספו ותרבו את שבר חמש כפי שהודגם עבור שברים שתיים, שלוש וארבע.מיד לאחר הפיצול, אספו את התאים למיון. לחלופין, יש לאסוף את התאים לאחר 24 שעות של תרבית על ידי שאיבת המדיום ולשטוף בעדינות את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר PBS למנה לכל שטיפה. לאחר הכביסה השנייה, יש לטפל בתאים בחמישה מיליליטר של 0.5% טריפסין EDTA ב- PBS לצלחת.לאחר חמש דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס, הוסף חמישה מיליליטר של מדיום אלפא מינימלי חיוני שלם לכל צלחת ונתק בעדינות את התאים בעזרת פיפטינג. כדי לשלב את התאים בכל שבר, סנן את מתלי התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרון לצינור צנטריפוגה חרוטי יחיד של 50 מיליליטר. לאחר שטיפת התאים עם 10 מיליליטר PBS, הוסף אותם לצינור.מסננים את התאים דרך מסננת ואוספים את התאים באמצעות צנטריפוגה. לאחר שהתאים מגולגלים, השעו מחדש את הגלולה במדיום חיוני מינימלי מלא לאחד כפול 10 עד שביעי תאים למיליליטר של ריכוז בינוני וסנן את התאים דרך צינור מכוסה רשת ניילון 35 מיקרון. כדי לבחון את היעילות של שיטה זו, שברים מוינו בנפרד ותרבו במשך 24 שעות כדי לקבוע את האחוז והתפוקה של אוסטאוציטים מכל שבר.צפיפות האוסטאוציטים בשברים שניים עד חמישה הייתה גבוהה מזו שנצפתה בשבר הראשון וירדה באופן ניכר בשברים שש, שבע ושמונה. למרות שאחוז האוסטאוציטים המתקבל בין כל השברים אינו מובהק סטטיסטית, צפיפות האוסטאוציטים שונה באופן דרמטי בין השברים. כאן מוצגת אסטרטגיית השער לבידוד אוסטאוציטים חיוביים ל-GFP מעמיתיהם השליליים ל-GFP על ידי מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות.לאחר המיון ניתן לנתח אוסטאוציטים לביטוי סמני אוסטאוציטים מעניינים. בניתוח זה, הגנים של סמני האוסטאוציטים באו לידי ביטוי ברמות גבוהות יותר באוסטאוציטים המבודדים החיוביים ל-GFP בהשוואה לשבר ה-presort השני, הידוע כמקטע אוסטאובלסטים גבוה. כאן ניתן לראות את המורפולוגיה של אוסטאוציט חיובי ל-GFP השומר על צורת כוכב עם דנדריטים המשתרעים מגוף התא לאחר 24 שעות של תרבית על צלחת תרבית פלסטית, לאחר מיון.שימו לב בעת שאיבת העיכול מכיוון שהקלבריה תצטמצם לכדורים זעירים. זכור להשתמש בשואב קצה קטן כדי למנוע אובדן תאים. אוסטאוציטים היו אניגמטיים מכיוון שהם קבורים בעצם.טכניקה זו סללה את הדרך לחקר אינטראקציות מולקולריות של אוסטאוציטים ושליטתם על אוסטאוקלסטים ואוסטאובלסטים.

obtaining-primary-osteocytes-through-murine-calvarial-fractionation

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מדידת כמותית של פונקצית אב עצם בריפוי שבר דורשת טכנולוגיית הדמיה סידורי ברזולוציה גבוהה. הנה, פרוטוקולים ניתנים לשימוש במיקרוסקופיה intravital ומעקב osteo שושלת ברצף תמונה ולכמת את ההגירה, השגשוג והתמיינות של תאי גזע / אב osteogenic אנדוגני בתהליך של תיקון שברים בעצמות.

עוקב<em&gt; בvivo</em&gt; הדמיה של תאי גזע / אב osteogenic במהלך תיקון שבר

טיפול בosteoblasts עכבר העיקרי עם חומצה רטינואית מייצר אוכלוסייה הומוגנית של תאים מסועפים הנושאים תכונות מורפולוגיות ומולקולרית של osteocytes. השיטה מתגברת על הקושי בהשגה ושמירה על osteocytes העיקרי בתרבות, ויכולה להיות יתרון ללמוד תאים הנגזרים ממודלים מהונדסים.

יישום של חומצה הרטינואית לקבל תרבויות Osteocytes מOsteoblasts העכבר העיקרי

הטבע של האינטראקציות בין תאי גזע hematopoietic ואב (HSPCs) ונישות מח עצם הוא הבין היטב. שינויי חומרה מותאם אישית ופרוטוקול רכישה רב שלבים לאפשר את השימוש בשני הפוטונים ומיקרוסקופיה confocal לתמונת vivo לשעבר HSPCs שכותרתו התביית בתוך אזורי מוח עצם, אינטראקציות מעקב ותנועה.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Osteoclasts הוא תא resorbing-עצם העיקרי בגוף. יכולת לבודד osteoclasts במספרים גדולים הביאה התקדמות משמעותית בהבנה של ביולוגיה האוסטאוקלסטים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לבידוד, טיפוח וכימות פעילות האוסטאוקלסטים במבחנה.

גזירה האוסטאוקלסטים מעכבר מח עצם

במאמר זה, נציג שיטות כדי לבודד, להבדיל תאי סטרומה מח עצם של תאי גזע hematopoietic עצמות ארוכות העכבר. שני פרוטוקולים שונים מוצגים מניב אוכלוסיות תאים שונים עבור הרחבת ובידול לתוך תאי העצם, adipocytes ו osteoclasts.

בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

אוסטאופנוקיים הם מקרופאג polykaryons רקמות שמקורם השושלת המונציט מקרופאג של תאי גזע המטפאות. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד את התאים מח עצם כך כמויות גדולות של אוסטאוקלמות מתקבלים תוך צמצום הסיכון של תאונות שנמצאו בשיטות מסורתיות.

בידוד, טיהור, והבידול של אוסטאוקלסט מקדים של מח עצם חולדה

פרוטוקול זה מתאר את הזיהוי של נדידת תאי גזע שלד periosteal בתיווך CCL5 בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה תוך-וינטלית חיה של בעלי חיים.

הדמיה בזמן אמת של הגירה הנגרמת על ידי CCL5 של תאי גזע שלד Periosteal בעכברים

אנו מתארים כאן את השיטה להדמיית מגהקריוציטים ופרופלטלטים במח העצם הגולגולתית של עכברים חיים באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית.

ב-Vivo הדמיה דו-פוטונית של מגהקריוציטים ופרופלטלטים במח העצם של גולגולת העכבר

המאמר הנוכחי מתאר ביצוע גישת הדמיה תוך-חיונית כדי לצפות באיתות סידן המושרה מכנית של אוסטאוציטים משובצים in vivo בזמן אמת בתגובה לעומס מכני ברמת הרקמה של המטטרסל השלישי של העכבר.

גישת הדמיה תוך-חיונית פלואורסצנטית לחקר דינמיקת איתות סידן הנגרמת על ידי עומס באוסטאוציטים של עכברים

מחקר זה מתאר את השיטה לדמיין ולפתח מודלים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) של אוסטיאוציטים בתוך הרשת הלאקונרית-קנאליקולרית (LCN) לניתוח דינמיקת נוזלים חישובית (CFD). המודלים שנוצרו בשיטה זו מסייעים להבין אוסטיאוציטים mechanosensation בעצמות בריאות או חולות.

ניתוח והדמיה של אוסטיאוציטים

מיקרוסקופיה תוך-ויטלית מאפשרת לחקור תהליכים ביולוגיים דינמיים כגון התחדשות רקמות והתפתחות גידולים. מח העצם הגולריאלי, רקמה דינמית ביותר, מציע תובנות לגבי המטופואיזיס ותפקוד כלי הדם. שימוש בשתל קיבוע ראש מודפס בתלת מימד תואם ביולוגית מאפשר הדמיה אורכית חוזרת, ומשפר את ההבנה שלנו לגבי דינמיקת הרקמות ומיקרו-סביבת הגידול.

הדמיה אורכית תוך-חיונית של דינמיקת כלי הדם במח העצם הגולגולתי

למד שיטה יעילה לבידוד אוסטיאוציטים ראשוניים המבטאים GFP מעכברי dmp1-topaz ניאונטליים באמצעות מיון תאים פלואורסצנטי. הפרוטוקול מקצר זמן טיפול ומגביר תפוקת תאים חיים עם מינימום זיהום.

השגת אוסטיאוציטים ראשוניים באמצעות שבר קלוואריאלי מוריני של אוסטיאוציטים המבטאים GFP

גלה סרטונים נוספים