לכידת לייזר מיקרודיסציה RNA-רצף לניתוח ביטוי גנים ספציפי רקמה מרחבית וזמנית בצמחים

פרוטוקול זה משתמש במיקרו-דיסקטמנט לכידת לייזר יחד עם רצף RNA כדי להשיג תעתיקים מרחביים ותעתיקים זמניים מתאים ספציפיים בצמחים בעלי תחומי עניין, תוך שימוש בכמויות קטנות של חומרים ביולוגיים. היתרון העיקרי של טכניקת הלייזר הוא שהיא מקלה על הדמיה ישירה של תאים בהקשר של רקמות נורמליות, ומאפשרת לתאים הדיסקרטיים להיות מבודדים במדויק באופן חופשי ממגע. למרות פרוטוקול זה ממוטב לבידוד של תאי צמח, זה יכול להיות מיושם על רוב התאים שניתן לזהות stologically.

הכנת מדגם טובה היא קריטית. לכן, אחד ביצוע טכניקה זו בפעם הראשונה, אופטימיזציה של קיבוע הרקמה ואת הטבעה חשוב לפני לייזר לכידת מיקרודיסקציה. לפני איסוף דגימת הרקמה, להכין תיקון מתאים למינים וסוג הרקמה להיות שנקטפו.

עבור זרעי שעורה, לחתוך את דגימות הזרעים לשניים לפני שקוע הדגימות לתוך לפחות 10 X נפח של קרח קר תיקון. השתמש חדירת ואקום כדי להאיץ את החדירה של התיקון. הרקמה צריכה לשקוע עד סוף החדירה, ואז לרענן את התיקון עבור דגירה לילה ולהעביר את הדגימות לתוך קלטות לעיבוד רקמות.

מניחים את קלטות טעונה רקמה לתוך סל המתכת של מעבד אוטומטי ולחבר את סל המתכת למחזיק שלה מעל התא אחד. הגדר את התוכנית בלוחות הבקרה של מעבד הרקמות ולחץ להתחיל את תוכנית העיבוד האוטומטי. המערכת תייבש את הדגימות על ידי טבילת הקלטות לתוך סדרה הדרגתית של אתנול במשך 90 דקות לכל ריכוז כפי שצוין.

לאחר טבילת האתנול האחרונה, המערכת תטביע את הדגימות בשיפוע קסילן למשך 90 דקות לכל פתרון כמצוין. ואחריו טבילה של 290 דקות בפרפין מותך ב-55 עד 60 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, להסיר את הקלטות הסתנן פרפין ממעבד הרקמות ולהמשיך להטמיע פרפין.

למחרת בבוקר, השתמש במטסים עדין כדי להעביר את דגימות התהליך לתבניות בגודל מתאים ולהוסיף פרפין מותך על כל מדגם. עבור זרעי שעורה, לכוון את הדגימות בפרפין longitudinally לכיוון החיתוך כדי להקל על רכישת סעיפים אורך. מניחים קלטת נקייה על התבנית ומבטיחים כי הקלטת כולה מכוסה במלואה עם נפח מספיק של פרפין כדי לאבטח את הדגימה לקלטת.

לאחר מכן מניחים את התבנית על צלחת קרה במשך 10 עד 20 דקות עד הפרפין מוגדר לפני שחרור הבלוק מן התבנית. כדי להכין שקופיות ממברנה PEN, להטביע את השקופיות ב פתרון השבתת RNS במשך שלוש שניות ואחריו שתי שטיפות קצרות ומים מטופלים DEPC. ואז לנהוג במגלשות באינקובטור 370 מעלות צלזיוס כדי להסיר כל פתרון שאריות UV לטפל שקופיות ארון זרימה למינאר במשך 30 דקות כדי לשפר את הפרפין שלהם לא אגוזי לוז.

עבור רקמה מדגם ניתוב מקום גושי פרפין על הצלחת הקרה ולמלא את אמבט המים עם מים מטופלים DEPC, ולאחר מכן חם עד 42 מעלות צלזיוס. חותכים בלוקים לעומק אזור העניין וחותכים את גושי הפרפין לעובי של 6 עד 10 מיקרון. בלוק חתוך היטב יהיה ליצור סרט בקצה הלהב.

השתמש פינצטה בסדר להעביר בעדינות סרטים מן microtome לאמבט המים, דואג כי הסרט שוכב שטוח על פני המים. כדי לאסוף את החלקים, מחזיק שקופית בזווית של 45 מעלות, השתמש בתנועה כלפי מעלה כדי להרים סרט מהמים אל המגלשה ולהשתמש ברקמה חופשית מוך כדי להסיר בזהירות את המים העודפים. כאשר כל החלקים נאספו, לשטוף את השקופיות עם 320 שטיפות השני קסילן ואחריו 230 שניות שוטף ב 100% אתנול ו 230 שטיפות השני ב 70%אתנול.

כדי מיקרודיסקט תאים מעניינים מן מקטעי רקמות deparraffinized ויבש, לטעון שקופיות על שלושת חריצי מיקרוסקופ LCM וצינור איסוף עומס לתוך החריצים הזמינים. להזיז את הבמה כדי לאתר את האזור של המדגם כי צריך להיות חתוך לחתוך קטע ריק ללא רקמה על שקופית הממברנה. כדי לייעל את מהירות החיתוך ואת החיתוך בלחץ לייזר מעוט אנרגיה ומיקוד.

השתמש בכלי הציור כדי לתאר את אזור העניין ברקמה ולהשתמש בפרמטרים הממוטבים ובפונקציה Robo LPC כדי להזניק תאים לתוך מכסות דבק. בחר דגל מרשימת הרכיבים כדי להשתמש בכלי הדגל כדי לסמן את אזורי העניין. בדוק את כפתור בדיקת המכסה כדי לבדוק את מכסה דבק, כדי לוודא כי הדגימות נלכדו.

בדרך כלל 10 עד 15 חלקים לכל כובע נדרשים עבור מיצוי RNA. מיד לאחר כל הדגימות נרכשו, להמשיך מיד מיצוי RNA, כדי למנוע השפלה RNA. לאחר מיצוי RNA והגברה RNA להשתמש במערכת אלקטרופורזה אוטומטית, על פי הוראות היצרן לכמת ולהעפיל RNA antisense.

במחקר זה, LCM, ריצוף RNA הוחל על מספר קטן של תאים משלושה איברי עובר, כל שמונה שעות על פני קורס זמן של 48 שעות במהלך הנביטה. חשוב להתאים את פרמטרי החיתוך בצורה נכונה כדי לאפשר לרקמת העניין להיחתך ולפרוק במדויק מהרקמות שמסביב מבלי לשרוף את קצה האזור הנבחר. ההשלכות של RNA הכולל לפני הגברה RNA מאפשר זיהוי של להקות אלקטרופורטיות ברורות פסגות פלואורסצנטיות של 18 ו 28S תת-יוניות ריבוזומליות בדגימות RNA באיכות טובה.

RNA אנטיסנס מסונתז בהצלחה יציג התפלגות גודל סימטרי unimodal מ 100 כדי 1000 נוקלאוטידים עם שיא סביב 300 נוקלאוטידים לאחר שני סיבובים של הגברה. התוויית סולם רב מימדי של גנים לידי ביטוי ברקמות השונות מעל 48 שעות של נביטה, ממחישה דמיון גדול יותר בין דגימות של רקמה אחת מאשר בין דגימות מאותה נקודת זמן, אבל רקמות שונות. מספר הגנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי עולה בהדרגה במהלך הנביטה בכל רקמה ביחס לנקודת הזמן של שעת האפס של הרקמה.

בניתוח מייצג זה, 25% של פלומול, 34% של radicle ו 41% של scutellum גנים מבוטאים באופן דיפרנציאלי נמצאו לידי ביטוי באופן בלעדי בתוך כל רקמה. חשוב להתאים כראוי את פרמטרי החיתוך עבור כריתה מדויקת ופריקת אזור הבורר מהרקמות שמסביב מבלי לשרוף את קצה האזור הנבחר. עם שיטות משופרות לטיהור כרומטין וחלבונים, ולשפר את מכשיר ספקטרומטריית המסה, LCM יכול לשמש עבור סוג התא ספציפי אפיגנומי ופרוטאומיקה מחקרים שתלים.