Name: תסא של העברת שריטות חסכונית ותואמה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: למדו שיטה חסכונית וניתנת להתאמה לביצוע תס"א העברת שריטות בפיברובלסטים לבביים. שיטה זו מאפשרת ניתוח מדויק של נדידת תאים ומספקת כלי נגיש למחקר ביולוגי בסיסי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי פרס המחקר הרפואי של צבא ארה"ב #81XWH-16-1-0710, בית הספר לרוקחות של אוניברסיטת מיסיסיפי והמחלקה למדעים ביו-מולקולריים.

1. תרבות תאים כללית
<ol><li>פיברובלסטים לבביים תרבותיים במדיום הנשרים המותאם (DMEM) של דולבקו המכילים 1 גרם/ל גלוקוז, נתרן פירובלט, L-גלוטמין, בתוספת עם 14.2 mM NaHCO3, 14.9 mM HEPES, 15% סרום חום לא פעיל של צופר עוברי (FBS), 2% L-גלוטמין, ו 0.02% מיקרוגנט מיקרוביאלי (ראה טבלת חומרים)ומתוחזק בחממה CO2 ב 37 °C.</li>
	<li>פיברובלסט לב תרבות עד 90-95% confluency הוא הגיע במעבר 0 (P0). בשלב זה הפיברובלסטים מוכנים להתחלק לצלחת של 48 בארות, המשמשת להעברה.</li>
</ol>2. הכנת לוחית ההעברה
<ol><li>הכן לוח תרבות תא 48 באר על ידי ציור קו, באמצעות סמן קבוע צהוב או בהיר, במורד מרכז הבאר. לאחר מכן, צייר שלושה סימני Hash המפרקים את הבאר לשלושה תחומי עניין נפרדים. מקטעים אלה ישמשו להדמיה. הערה: שימוש בסמן קבוע בצבע בהיר יאפשר הדמיה קלה של תאים נודדים. סמנים כהים כגון שחור או כחול ימנעו הדמיה חזותית של תאים נודדים.</li>
	<li>אם בוחנים הגירה בצוללת (לדוגמה, קולגן), תחפו את הבאר בשלב זה בעקבות הוראות וריכוזים המשמשים לצוע הספציפי.</li>
	<li>צלחת ~ 15,000-20,000 פיברובלסטים לב, P1, לתוך כל באר ותאי תרבות, בתנאי culturing נורמליים (תנאים המפורטים בסעיף הקודם), עד שהם מגיעים 90-95% confluency. יש להגיע לשלב בין השעות 24-48. הערה: בעת הגדרת לוח ההעברה הקפד לכלול פקד חיובי (תא העברה ידוע, כגון תאי 3T318), פקד שלילי (תאים לא מרוטים) ובאר ריקה.</li>
</ol>3. העברה לגרד העברה & קיבעון
<ol><li>ברגע שהתאים מגיעים ל-90-95% קונפלואנציות, הסר את המדיה וגרד לאורך הקו המצויר באמצעות קצה פיפט P200 סטרילי. הערה: קצה פיפטה P200 הוא קצה פיפטה נפוץ בגודל בשימוש עם אחסוןהשריטה 10,14,19. כמו כן, לבצע רק מעבר אחד עם קצה P200 כמו יותר מניסיון אחד עלול לגרום קווי שריטה מרובים.</li>
	<li>לשטוף את הבאר עם מדיית סרום נמוכה (1.5% FBS) כדי להסיר את כל פיברובלסט לב לא מחובר.</li>
	<li>הוסף 500 μL של מדיית סרום נמוכה לכל באר. אם משתמשים בחומרים תרופתיים כלשהם, הוסיפו אותם כעת. הערה: נעשה שימוש למדיית סרום נמוכה מכיוון שהיא מאפשרת/מקדמת העברת תאים ומונעת פיברובלסטים מהתרבות אשר עלול להטות את התוצאות של העברה assay20. עבור פרוטוקול זה, נעשה שימוש ב- 1.5% FBS.</li>
	<li>צלם תמונות של 0 שעות לפני דגירה של הפיברובלסטים ב-5% אינקובטור CO2 ב-37°C למשך 24 שעות.<ol>
<li>צלם תמונות של 0 שעות באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם מטרה של 20x. קח שתי תמונות של 0 שעות לבאר. פעולה זו תאפשר כיסוי מלא יותר של קו ההעברה.</li>
		<li>באמצעות הסימונים (קו ומקפים), מקם את הבאר כדי ללכוד את החצי העליון של קו השריטה. הימנע מהדמיה של המקף האמצעי כדי להבטיח שאותו אזור העברה לא יצוין פעמיים, דבר שיכול להטות את התוצאות.</li>
		<li>השתמש תוכנת הדמיה (טבלת חומרים) כדי ללכוד 0 שעות #1. לאחר מכן הזז את הלוח כדי למקם את החצי התחתון של באר / קו שריטה מול המצלמה. שוב, הימנע מלכידת המקף האמצעי. לאחר המקום, ללכוד 0 שעות תמונה #2 (איור 1). הערה: הימנעות מקף האמצע בשתי תמונות 0 שעות תמנע לכידת אזורי העברה פעמיים אשר אם נעשה יכול לייצר תוצאות חוזרות ולהטות את הנתונים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר הדגירה במשך 24 שעות, הסר את המדיה מהבאר, ושטוף את הבאר עם PBS לא סטרילי אחד (מעתה ואילך כל 1x PBS בשימוש אינו סטרילי).</li>
	<li>בכסה המנוע אדים, להוסיף 500 μL של 4% paraformaldehyde לבאר דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>הסר את paraformaldehyde ושטוף פי 3 עם PBS אחד למשך 5 דקות כל אחד ב-RT.</li>
	<li>לאחר שטיפה של תאים, המשך ללכידת תמונות של 24 שעות או הוסף PBS אחד לכל באר והמקם ב-4°C עד לשעה מאוחרת יותר. תאים יכולים להישאר ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שבועות עד מוכן לתמונה.<ol>
<li>לחלחל את התאים על ידי הוספת 300 μL של פתרון permeabilizing (1 x PBS ו 0.01% triton X-100) לכל באר. דגירה תאים / צלחת עם עדין, נדנדה מתמשכת במשך 30 דקות ב RT.</li>
		<li>הסר פתרון permeabilizing ולהוסיף 1% כתם כחול מבריק Coomassie (3% Coomassie כחול מבריק, 10% חומצה אצטית, 45% מתנול, ו 45% dH2O) במשך 10 דקות עם עדין, נדנדה מתמדת ב RT. הערה: אם לוחות מצופים במצע מטריצה חוץ-תאי, הקפד לבדוק צלחת מצופה עם כתמי Coomassie לפני ביצוע אסימת הגירה. איור 2 מדגים שניתן להשתמש במטע מטריצה עם תרגום זה ולא להשפיע על הדמיה של תאים.</li>
		<li>לשטוף בארות 3x עם 1 pBS ב RT עם נדנדה מתמדת במשך 5 דקות כל אחד.</li>
		<li>לאחר שטיפה, הוסיף 300 μL של 1x PBS וללכוד 24 שעות תמונות.</li>
		<li>ללכוד תמונות 24 שעות על-ידי יישור הבאר לאותה מיקום ששימש ללכידת תמונות 0 שעות. כדי להשיג זאת, פתח את התמונות שנלכדו בעבר 0 שעות ובשימוש בסימון שנעשה עם הסמן הקבוע, יישר את הבאר לאותה תנוחה. הקו במהלך האמצע וסימנים נוספים של מקף אמורים לאפשר יישור קרוב בין התמונה של 24 שעות לתמונה של 0 שעות(איור 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הכנת תמונות של 0 שעות ו-24 שעות
<ol><li>פתח 0 שעות ו-24 שעות שצולמו באותה באר ומיקום בתוכנה להדמיה(טבלת חומרים).</li>
	<li>צור שכבה חדשה בתמונה של 0 שעות. לאחר מכן, לחצו על השכבה החדשה ושנו את שם השכבה ל"שכבת קו" על-ידי לחיצה כפולה על הטקסט. הערה: שכבה זו תיקרא שכבת קו מנקודות אלה ואילך.</li>
	<li>לחצו על הכלי מברשת (סמל מברשת) והגדירו את הגודל ב- 10 px ואת הצבע לאדום.</li>
	<li>כאשר שכבת הקו נבחרת, צייר שני קווים נפרדים המתארים את אזור השריטה. הקווים אינם אמורים לגעת בתאים עקב שורות אלה המציינות את אזור ההעברה.</li>
	<li>לחץ על הכלי הזזה (סמל חץ) ולאחר מכן לחץ על לחצן Ctrl לחוץ ולחץ הן על שכבות הקו והן על שכבות הרקע.</li>
	<li>לחצו במרכז התמונה של 0 שעות וגררו את שתי השכבות הללו לאמצע התמונה של 24 שעות.</li>
	<li>כעת, באמצעות התמונה 24 שעות, לחץ על שכבת הרקע של 0 שעות ושנה את האטימות ל- 50%.</li>
	<li>החזקת לחצן Ctrl, לחץ על שניהם 0 h רקע שכבת קו ולאחר מכן חינם להפוך את השכבות (עריכה>שינוי צורה חינם). באמצעות שינוי צורה חופשי, ישר את הרקע 0 שעות ותדמית הקו לתדמית הרקע של 24 שעות. שלב זה תוצאה של שכבת-על של התמונה 0 h ו- 24 h, אשר יש צורך למקם את הקווים הסמן את אזור ההעברה במיקום הנכון בתמונה 24 שעות.</li>
	<li>לאחר שכבת-על מוצלחת של שכבות הרקע והקו של 0 שעות על תמונת הרקע של 24 שעות, מחק את שכבת הרקע של 0 שעות. מחק על-ידי לחיצה על שכבת הרקע של 0 שעות ולאחר מכן לחץ לחיצה ימנית ולחץ על מחק שכבה.</li>
	<li>מחיקת תמונת הרקע של 0 שעות תשאיר רק את הקו ואת שכבת הרקע של 24 שעות (המכונה כעת תמונת העברה). שכבת הקו תציין את אזור ההעברה/שריטה בתמונה של 24 שעות ותו לא תאפק לקביעת מספר התאים הנודדים.</li>
	<li>שמור כתדמית ההעברה החדשה הן כקובץ photoshop והן כתוכת TIFF/JPEG. הערה: דמות מייצגת המתארת תהליך זה מוצגת באות 3.</li>
</ol>5. ספירת מספר התאים הנודדים
<ol><li>פתח את תמונת ההעברה. ניתן לעשות זאת בתוכנית המקבלת קבצי TIFF/JPEG (טבלת חומרים).</li>
	<li>ספור את מספר התאים הממוקמים בין לבין ולגעת בשני הקווים האדומים.</li>
	<li>רמת מספר התאים הנודדים לכל תמונה. יהיו שתי תמונות נודדות לבאר, ואין לשלב ערכים אלה עד לאחר תיקון הערכים עבור אזור ההעברה (מפורט בסעיף הבא).</li>
</ol>6. קביעת אזור ההעברה
<ol><li>פתח את התמונה 24 שעות המכילה את שורות ההעברה בתוכנית ההדמיה בסעיף 5(טבלת חומרים).</li>
	<li>שמור כתמונה זו כ"תמונת אזור העברה".</li>
	<li>לאחר השמירה, לחצו על שכבת הרקע, לחצו לחיצה ימנית ולחצו על 'מחק שכבה'. פעולה זו אמורה להשאיר רק את קווי השריטה בתמונה (איור 3).</li>
	<li>בעזרת הכלי מברשת (סמל מברשת) למלא את האזור בין קווי השריטה. התאם את צבע המברשת לצבע המשמש לצימורה של הקווים להעברה.</li>
	<li>שנה את התמונה לגווני אפור כדי ליצור תמונה בשחור-לבן (תמונה>מצב>גווני אפור)ולאחר מכן שמור את התמונה (איור 4).</li>
	<li>הפעל את תוכנת הניתוח (טבלת חומרים) ולאחר מכן פתח את הקובץ "אזור ההעברה" בתוכנת ניתוח.</li>
	<li>כדי לקבוע את אזור קו ההעברה, לחץ על תמונה>כוונן>סף. אזור ההעברה השחור יהפוך לאדום ואזור האחוזים יצוין בתיבה סף. האזור ידווח כעוצב שטח שקו הנדידה מכסה בהשוואה לאזור כולו שנלכד בתמונה.</li>
	<li>רשם את אזור האחוזים עבור שורת ההעברה וודא שערך זה מזווג למספר התאים הנודדים עבור אותה תמונה.</li>
</ol>7. ניתוח נתונים
<ol><li>נרמל את מספר התאים הנודדים לאזור האחוזים של השריטה. חלק את מספר התאים ההעברה לפי אחוז ים של קו ההעברה (# תאים שהועברו % אזור ההעברה). עשה זאת לכל תמונה ולא ממוצע המבוסס על העברה לבאר.</li>
	<li>לאחר נרמול ערכים לכל תמונה, הוסף את הערכים של שתי התמונות, המייצגות באר בודדת. ערך זה ישמש לניתוח גרפי וסטטיסטי. אם העיצוב הניסיוני הכיל העתקים מרובים. שכפול ערכים ממוצע לפני ניתוח סטטיסטי.</li>
</ol>

<ol><li>Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGilbert%2C+SF+%22Developmental+biology%22">Developmental biology</a>. , Sinauer Associates, Incorporated. (1997).</li>
<li>Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+migration+in+inflammation%3A+present+and+future+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nature Immunology. 6, (2005).</li>
<li>Yahata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Function+of+Angiotensin+II+in+Skin+Wound+Healing+Induction+of+Fibroblast+and+Keratinocyte+Migration+by+Angiotensin+II+via+Heparin-Binding+Epidermal+Growth+Factor+%28EGF%29-like+Growth+Factor-Mediated+EGF+Receptor+Transactivation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (19), 13209-13216 (2006).</li>
<li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Migration+Single-Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell Migration Single-Cell Migration.</a> Comprehensive Physiology. 2 (4), (2012).</li>
<li>Brand, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-22+is+increased+in+active+Crohn%27s+disease+and+promotes+proinflammatory+gene+expression+and+intestinal+epithelial+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration.</a> American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).</li>
<li>Chi, Z., Melendez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Cell+Adhesion+Molecules+and+Immune-Cell+Migration+in+the+Initiation%2C+Onset+and+Development+of+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis.</a> Cell Adhesion & Migration. 1 (4), 171-175 (2007).</li>
<li>Chen, H., Nalbantoglu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ring+cell+migration+assay+identifies+distinct+effects+of+extracellular+matrix+proteins+on+cancer+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration.</a> BMC Research Notes. 7 (183), 1-9 (2014).</li>
<li>Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+alterations+in+cardiac+fibroblast+function+following+induction+of+pressure+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+tissue+research%22%5BJournal%5D)">Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload.</a> Cell and tissue research. 340 (1), 117-126 (2010).</li>
<li>Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+and+myofibroblasts+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical%2C+Cosmetic+and+Investigational+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing.</a> Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. , 7(2014).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Reviews+in+Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).</li>
<li>Even-Ram, S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+in+3D+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell migration in 3D matrix.</a> Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).</li>
<li>Valster, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cell migration and invasion assays.</a> Methods. 37, 208-215 (2005).</li>
<li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration%2C+invasion%2C+and+adhesion+assays%3A+From+cell+imaging+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).</li>
<li>Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-conditioned+medium+accelerates+skin+wound+healing%3A+An+in+vitro+study+of+fibroblast+and+keratinocyte+scratch+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays.</a> Experimental Cell Research. 316 (7), 1271-1281 (2010).</li>
<li>Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honey+dilution+impact+on+in+vitro+wound+healing%3A+Normoxic+and+hypoxic+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition.</a> Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 412-422 (2015).</li>
<li>Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+Mouse+3T3+Fibroblasts+in+Response+to+a+Serum+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (11), (1971).</li>
<li>Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+quantify+the+wound+closure+dynamic%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A novel approach to quantify the wound closure dynamic.</a> Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).</li>
<li>Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Diabetic+Conditions+and+AGE%2FRAGE+Signaling+on+Cardiac+Fibroblast+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).</li>
<li>Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+of+Cell+Migration+by+Substrate+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension.</a> Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+microenvironment+regulates+collective+migration+and+local+dissemination+in+normal+and+malignant+mammary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), 2595-2604 (2012).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

גישה חדשה זו לבחינת העברת השריטות מספקת שיטה נגישה יותר לחוקרים לבחון שינויים בהדברת תאים. בעוד הודעה זו פועלת על פי אותו הליך לניהול שריטה דומה למאגרים אחרים של שריטה, היא מספקת שיטה חדשה להדמיה וניתוח מדויק של העברת תאים10. במקום להשתמש בשיטות עתירות ציוד של מיקרוסקופית זמן-לשגות ותאי הדמיה של תאים חיים, שיטה זו מפרטת את השימוש בציוד מעבדה זמין בדרך כלל. תוך שימוש במיקרוסקופ ומצלמה הפוכים כלליים, ניתן ללכוד תמונות הגירה בו-זמנית תוך שמירה על תנאי תרבות עקביים. בנוסף, שיטה זו מספקת הדמיה מדויקת ש...

העברת תאים היא חיונית עבור אירועים פיזיולוגיים רבים, כמו גם פתולוגיים. הוא נדרש במהלך הפיתוח, להרכבת תגובה חיסונית, ולריפויפצעים נאותים 1,2,3. רבים מאירועי העברת תאים אלה יכולים להיות מופעלים על ידי אותות פיזיקליים או כימיים. לדוגמה, במהלך תגובה חיסונית, leukocytes לנדדו לעבר אתר של פציעה בתגובה כימותרפיה2. בנוסף, leukocytes גם לשחרר ציטוקינות כדי לגרום הגירה של תאים חיסוניים נוספים, כמו גם סוגי תאים אחרים, כגון פיברובלסטים, אשר מעורבים בתהליך ריפוי הפצע, ובכך, ייזום תגובה רבתאית 4. היכולת של תאים לנדוד חיונית לתפקוד פיזיולוגי תקין; עם זאת, כאשר נדידת תאים עוברת ללא בדיקה, זה יכול להיות תגובה שלילית ולתרום לאירועים פתולוגיים, כגון דלקת כרונית, מחלת כלי דם, גרורות סרטן, וריפוי פצעלקוי 2,3,4,5,6,7. ריפוי פצעים לקויים הוא סבל נפוץ של חולי סוכרת עקב פגמים בנדידה לתאים, ואם פגמים אלה אינם מטופלים, זה יכול להוביל לסיבוכים נוספים (למשל,קטיעה 8,9). מחקר זה, כמו גם אחרים, הצביעו על הצורך להבין עוד יותר את התהליך שבו מתרחשת נדידת תאים, בתנאים פיזיולוגיים או פתולוגיים רגילים, והוא חיוני גם להם לאורך תחום מחקר זה. כדי להשיג זאת, צריך להיות הגירה זמין כי הם נגישים ובמחיר סביר עבור אותם חוקרים, מי לא יכול להיות בעל הציוד הדרוש כדי לנהל את ההתאסות האלה.
נכון לכך, קיימים מגוון של העברות הזמינות לבחינת מגוון רחב של נושאים הנוגעים להעברה של תאים. פותחו מודלים של העברה תלת-מיתית ותלת-מיוד, שכל אחד מהם מתמקד באזורים ספציפיים המשפיעים על העברת תאים. מודלים נדידת 3D קשורים בדרך כלל מחקרים פלישת תאים ולהעריך את ההשפעה של מטריצהחוץ תאיתעל נדידת תאים 10,11,12, בעוד 2D הגירה יש מגוון גדול יותר של יישום והם משמשים בעיקר כדי ללמוד הגירה chemotactic, ריפוי פצעים, ושינויים פונקציונלייםבמהלך נדידת תאים 13,14,15,16. חלק מהאסמים הללו דורשים ציוד נוסף, כגון תאי ביידן או טבעות הדרה, מה שיכול להפחית את הזמינות של בדיקות אלה לחוקרים מסוימים. אחד האברים חסכוניים יותר הוא אחסון השריטות, המשמש בדרך כלל להערכת ריפוי פצעים ושינויים כללייםבהדחת תאים 14,17. בעוד רוב המעבדות מצוידות לנהל אחסון שריטה, הציוד המשמש למעקב אחר העברת תאים נוטים להיות גם לא זמין או יקר מדי לרכישה. זה כולל מיקרוסקופ זמן לשגות, אשר דורש מיקרוסקופ הפוך ומערכת הדמיה חיה. פריטי ציוד יקרים אלה אינם נגישים בדרך כלל לכל מעבדה. לכן, תצפית זו מדגישה את הצורך בפרוטוקול חדש המאפשר הערכה של העברת תאים עם ציוד זמין יותר.
הפרוטוקול המוצג כאן מספק דרך חדשה ובמחיר סביר להעריך את העברת התאים. שיטה זו פועלת על פי אותו הליך המשויך לבדיקות שריטה אך שונה בניתוח של בדיקת העברת תאים על-ידי שימוש בציוד הזמין בדרך כלל בהגדרת מעבדה בסיסית במדעים. פרוטוקול זה באמצעות ציוד משותף מאפשר קביעה מדויקת יותר של העברת תאים ללא שימוש במיקרוסקופ זמן-לשגות. בנוסף לקביעת ההעברה, שיטה זו מהווה גם גורמים משתנים באזור השריטה אשר הונו להשפיע מאוד על העברת תאים. בסך הכל, פרוטוקול חדש זה לניתוח העברת תאים מספק הזדמנות למעבדות נוספות לחקור ולתרום לתחום העברת התאים.

<table><tbody><tr><td>Adobe כל היישומים</td><td>Adobe</td><td></td><td>זה כולל את Adobe photoshop שהיא תוכנת ההדמיה המשמשת עם פרוטוקול זה</td></tr><tr><td>Avant Pipette Tips 200ul Binding לא סטרילי</td><td>MIDSCI</td><td>AVR1</td><td>טיפים עוברים חיטוי לעיקור</td></tr><tr><td>AxioCam Erc 5s Camera</td><td>Zeiss</td><td>426540-9901-000</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP101-25</td><td></td></tr><tr><td>Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-86</td><td></td></tr><tr><td>DMEM עם L-גלוטמין, 1 גרם/ליטר גלוקוז ונתרן פירובט</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10014CM</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>זוהי תוכנה חינמית המוצעת על ידי ממשלת ארה"ב והיא תוכנת הניתוח המשמשת עם פרוטוקול</td></tr><tr><td>זה Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC416785000</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי פרימיום ממוצא ארה"</td>ב <td>מחקר חדשני</td><td>IFBS-HU</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGEN</td><td>ant-pm-2</td><td>זהו האניט מיקרוביאלי המשמש עם פרוקוטול זה לתרבית פיברובלסטים לבביים</td></tr><tr><td>Zeiss Primovert מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td>491206-0002-000</td><td></td></tr><tr><td>Zen Blue Edition 2.3 תוכנת</td><td>Zeiss</td><td></td><td>מגיעה עם רכישת מצלמה</td></tr></tbody></table>

תס"א של העברת שריטות חסכונית ותואמה

A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay

העברת תאים היא מרכיב מרכזי הן באירועים פיזיולוגיים והן באירועים פתולוגיים. העברת תאים רגילה נדרשת עבור פונקציות חיוניות כגון פיתוח והרכבה של תגובה חיסונית. כאשר מתרחש פגם או שינוי עם תהליך העברת התא, זה יכול להיות תוצאות מזיקות (כלומר, גרורות סרטן, ריפוי הפצע, היווצרות צלקת). בשל החשיבות של העברת תאים, יש צורך בגישה להעברה סלולרית, הניתנת להתאמה ותוכלית לחזרה. תוך שימוש בהגידת השריטות הנפוצה, פיתחנו גישה חדשה לניתוח נדידת תאים המשתמשת בציוד מעבדה כללי. השיטה המתוארת משתמשת בסמנים חזותיים המאפשרים לכידת אזורים מסוימים בעלי עניין ללא שימוש במיקרוסקופ זמן-לשגות. בנוסף, היא מספקת גמישות בעיצוב הניסיוני, החל משינוי המטריצת הנדידה ועד לתוספת של משנה תרופתי. יתר על כן, פרוטוקול זה מתאר דרך לתת דין וחשבון על האזור של העברת תאים, אשר אינו נחשב על-ידי מספר שיטות בעת בדיקת העברת תאים. גישה חדשה זו מציעה אסיא הגירה שריטה לקהל גדול יותר ותספק הזדמנות גדולה יותר לחוקרים לבחון את ההשפעה הפיזיולוגית והפתופיזיולוגית של העברת תאים.

הליך זה מתעד גישה חדשה לחקר העברת תאים שהיא גם חסכונית וגם ניתנת להתאמה עבור רוב המעבדות. מחקרים רבים השתמשו במיקרוסקופ זמן לשגות כדי להעריך את העברת תאים, אבל הציוד הדרוש לשיטה זו אינו זמין בקלות למעבדות רבות. בעוד ניצול קווים ומקפים לתיכור מאפשר את היכולת ללכוד מחדש תחומי עניין ספציפיים בנקודות זמן שונות ללא שימוש בציוד יקר(איור 1 &amp; איור 3). בעוד השימוש בתימרים חיוני לגישה חדשה זו, ישנם תחומים רבים בשיטה זו שניתן להתאים לצרכי החוקר הפרט. הפרוטוקול הצביע על...

אנו מציגים שיטה חסכונית לגיירת השריטות המספקת גישה חדשה לקביעת העברת תאים ללא שימוש בשיטות עתירות ציוד. בעוד פיברובלסטים שימשו בפרוטוקול זה, זה יכול להיות מותאם ומנוצל כדי ללמוד סוגי תאים נוספים והשפעות על העברת תאים.

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as ...

פרוטוקול זה מספק שיטה חדשה לטכניקה ישנה, והוא יספק גישה חדשה עבור מספר רב של חוקרי מדע בסיסיים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם הטבע חסכוני שלה, כמו גם הסתגלות שלה כדי לשמש קהל מדעי רחב יותר. כדי להכין צלחת הגירה, השתמש בסמן קבוע בצבע בהיר כדי למתוח קו לאורך מרכז החלק האחורי של כל באר של צלחת 48 באר ולצייר שלושה סימני Hash לחלק כל באר לשלושה תחומי עניין נפרדים.ואז צלחת 1.5 עד פעמיים 10 למעבר הרביעי fibroblasts לב לתוך כל באר ותרבות התאים בתנאי תרבות נורמלית במשך 24 עד 48 שעות עד שהם מגיעים 90 עד 95% confluency. כאשר התאים מוכנים, להסיר את supernatant מכל באר ולהשתמש קצה פיפטה P200 סטרילי כדי להפוך אחד לעבור שריטה לאורך הקווים המצויר. לשטוף את בארות עם מדיום סרום נמוך כדי להסיר את כל fibroblasts לב מחובר ולהוסיף 500 microliters של בינוני סרום נמוך לכל באר.אם נעשה שימוש בסוכנים תרופתיים, הוסף את הסוכנים ל בארות המתאימות. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ הפוך עם מטרה של 20x כדי ללכוד שתי תמונות של אפס שעות ל הבאר באמצעות הסימונים כדי למקם כל באר כדי לאפשר הדמיה של החצי העליון של הקו שרוט. לאחר מכן להזיז את הצלחת כדי למקם את החצי התחתון של הקו שרוט לתוך התצוגה כדי לאסוף את התמונה השנייה ולמקם את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך 24 שעות.בסוף הדגירה, לשטוף כל באר עם PVS לא סטרילי ולהוסיף 500 microliters של 4% paraformaldehyde לכל באר במכסה המנוע אדים. לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף כל טוב שלוש פעמים PBS טרי במשך חמש דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, לחלחל את התאים עם 300 microliters של פתרון permeabilizing לגם נדנדה עדינה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, החליפו את הפתרון המחלחל בכתם כחול מבריק של 1% קומאסי למשך 10 דקות דגירה עם נדנדה עדינה בטמפרטורת החדר. ואחריו שלוש, חמש דקות שוטף PBS עם נדנדה. לאחר הכביסה האחרונה, להוסיף 300 microliters של PBS לכל באר בזהירות למקם את הצלחת באותו מיקום כמו עבור תמונת שעת האפס לפני לכידת שתי תמונות 24 שעות ביממה לכל גם הפגינו.בסוף הניסוי, פתח את התמונות ותוכנת ניתוח הדמיה מתאימה וצור שכבה חדשה על תמונת שעת האפס. לחצו פעמיים לשינוי שם שכבת קו השכבה החדשה ובחרו בכלי המברשת. שנה את גודל הפיקסל ל- 10 ואת הצבע לאדום וצייר שני קווים נפרדים כדי לחלק את הטיוטה לרמות.הקווים אינם יכולים לגעת בתאים כלשהם. פתחו את התמונה 24 שעות ביממה בתוכנת ההדמיה ובחרו בכלי ההזזה. החזקת לחצן הבקרה לחוץ, לחץ הן על הקווים והן על שכבות הרקע, לחץ במרכז תמונת שעת האפס וגרור את שתי השכבות לאמצע התמונה של 24 שעות.בתדמית של 24 שעות, לחץ על שכבת הרקע של אפס שעות ושנה את האטימות ל- 50%החזקת לחצן הבקרה, לחץ הן על רקע שעת האפס והן על שכבות הקו ולחץ על עריכה ושינוי צורה חופשי כדי לשנות את השכבות באמצעות המרה חופשית, ישר את רקע אפס השעה ותמונות קו לתדמית הרקע של 24 שעות כך שקווי העברת האזור ימקמו כראוי בתדמית של 24 שעות. כששכבת הקו מכוסה בהצלחה, לחצו לחיצה ימנית למחיקת שכבת הרקע של שעת האפס. ניתן להשתמש בשכבת השורה הנותרת כדי לקבוע את מספר התאים שהועברו לאזור האחסון הטיוטה במשך 24 שעות.לאחר מכן שמרו את תמונת ההעברה החדשה הן כ- Photoshop והן כקובץ TIFF או JPEG. כדי לכמת את מספר התאים הנודדים, פתח את תמונת ההעברה ואת התוכנית המקבלת קבצי TIFF או JPEG וספירה ידנית של מספר התאים הממוקמים בין לבין ונוגע בשני הקווים האדומים עבור שתי התמונות עבור כל באר. לאחר מכן רשום את מספר התאים הנודדים לתמונה.כדי לקבוע את אזור ההעברה, פתח את התמונה 24 שעות ביממה המכילה את קווי ההעברה בתוכנת ההדמיה ושמור את התמונה כתדמית אזור העברה. לאחר השמירה, לחצו על שכבת הרקע ולחצו לחיצה ימנית למחיקת השכבה. השתמש בכלי המברשת כדי למלא את האזור שבין קווי האחסון, באותו צבע ששימש את הקווים ולחץ על סרגל תמונה, מצב ואפור כדי לשנות את התמונה לשחור-לבן.שמור את התמונה ופתח את תמונת אזור ההעברה ותוכנית מתאימה לניתוח תמונה. לחץ על ערוך והתהפך. כדי לקבוע את אזור קו ההעברה, לחץ על תמונה, התאם סף.אזור ההעברה השחורה יהפוך לאדום ואזור האחוזים יצוין בתיבת הסף. לאחר מכן רשום את אזור האחוזים עבור שורת ההעברה ואשר שערך זה משויך למספר התאים הנודדים עבור אותה תמונה. בניתוח זה, 46 פיברובלסטים מלבבות שאינם סוכרתיים ו -129 פיברובלסטים מלבבות סוכרתיים היגרו במהלך תקופת הזמן הניסיונית של 24 שעות.מדידת אזור ההגירה כפי שהוכח, העלתה כי אזור השריטה הלא סוכרתי היווה 24.78% מכלל השטח שנמדד, בעוד שאזור השריטה של ההגירה הסוכרתית היווה 16.77% מכלל השטח שנמדד. נרמול לתחום ההגירה מספק הערכה טובה וקפדנית יותר של הגירת תאים ושלל טעות אנוש פוטנציאלית. לדוגמה, אם רק מושווים מספר הפיברובלסטים שהועברו, נראה בניתוח זה שמספר התאים שהיגרו באר זו היה כפול מזה של התאים שהועברו באר השנייה.עם זאת, כאשר נעשה שימוש באזור השריטה כדי לנרמל את הנתונים, היחס בין הפיברובלסטים לאזור הנדידה נצפה כמעט זהה בשתי בארות. הקפד ללכוד מחדש את אזור ההעברה בתמונה של 24 שעות, כפי שלכדת בתדמית של שעת האפס. בעקבות הליך זה, אימונוהיסטוכימיה יכולה להתבצע כדי לבחון ביטוי חלבון בתוך התאים.אנו מאמינים כי גישה חדשה יותר זו להעברת השריטות תאפשר לפתוח אפיקים נוספים של מחקר מדעי שלא היו זמינים בעבר.

a-cost-effective-and-adaptable-scratch-migration-assay

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

היכולת לנדוד היא פונקציה מרכזית של סוגי תאים רבים ושונים, כולל תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs). עם זאת, כימות שינויים ביכולת הנדידה לאחר נזק הוא מאתגר. פרוטוקול זה מתאר בדיקת הגירה הניתנת להתאמה בקלות המשתמשת בסטטיסטיקה קפדנית כדי לכמת שינויים ביכולת הנדידה של MSC לאחר נזק.

אופטימיזציה של assay Scratch הפצע כדי לזהות שינויים בנדידת תאי Murine mesenchymal סטרומה לאחר נזק על ידי תמצית עשן סיגריות מסיס

המחקר מדווח על שתי שיטות שונות לניתוח של הפלישה תא והעברה: וזמינותו קאמרית בוידן, במבחנה וידאו מבוסס-מיקרוסקופ ריפוי פצע וזמינותו. הפרוטוקולים עבור שני ניסויים אלה מתוארים, היתרונות והחסרונות שלהם מושווים.

הערכה של הפלישה התא, תהליך ההעברה: השוואה של השריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו פצע Assay ואת וזמינותו קאמרית בוידן

נדידת תאים הוא חיוני עבור פיתוח, רקמות תחזוקה ותיקון, ו tumorigenesis, מוסדר על ידי גורמי גדילה, נוגדנים, ציטוקינים. פרוטוקול זה מתאר נקודה וזמינותו, העברה דו מימדי, ולמשחקי הנועד להעריך את פנוטיפ הנדידה של גיליונות המצורפת, מלוכדת תא בתגובה רמזים microenvironmental.

באמצעות וזמינותו נקודה כדי לנתח את ההעברה של גיליונות תא

כאן נתאר הליך כדי לבחון את התא ההעברה במבחנה עם מיקרוסקופ אופטי מצלמה אוטומטית. וזמינותו מאפס כבר בשימוש נרחב שבו הסגר על השריטה מלווה קצוב. מיקרוסקופ אופטי מאפשר זיהוי אמין וזול של נדידת תאים.

אופטימיזציה Assay מאפס במבחנה בדיקה של נדידת תאים עם מצלמה אופטית אוטומטית

מחקר זה מתמקד מודל במבחנה של הפצע הריפוי (גירוד assay) בתור מנגנון לקביעת מזהמים סביבתיים איך כגון ארסן השפעה הסלולר ההעברה. התוצאות מדגימים כי assay חוץ גופית בתוך זה מספק אינדיקציות מהיר ולא מוקדם של שינויים ההעברה הסלולר לפני ניסויים ויוו .

במבחנה לגרד Assay כדי להדגים את השפעת הרעל על נדידת תאים בעור

בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה משולבת חוקרים נדידת תאים סרטן ופלישה על פלטפורמה אחת בזמן אמת, מתן אפשרות היעילה הדירים בקלות ללמוד ניידות תא ו מורפולוגיה.

זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור התיקון שריטות מבחנה באמצעות הפיברוכדורים העיקריים עבור vivo העור הפצע הריפוי הטיפול בעכברים. שניהם מספר שיטות ברורות כדי להעריך בתוך מבחנה וריפוי פצעים vivo.

שיטת העברת שריטות וחדר מתקפל לחלל מתורבת בניתוח Vivo של ריפוי פצעים

באמצעות שילוב של עיצוב חוויית אינטראקציה וניתוח דרישות משתמש, אנו מציגים מגרד תאים חדשני המשפר את מבחני ריפוי הפצעים התאיים במונחים של שחזור, אמינות, מעשיות, שלמות התא וחוויית המשתמש.

כלי ליצירת רווחים יציבים וניתנים לשחזור ללא תאים לשיפור האמינות של בדיקת ריפוי פצעים בתאים

מחקר זה מציג את בדיקת נדידת פצעי השריטה הדו-ממדית (2D) ואת בדיקת הנבטת הספרואידים התלת-ממדית (3D), יחד עם שיטות הניתוח שלהם במורד הזרם, כולל מיצוי RNA ואימונוציטוכימיה, כבדיקות מתאימות לחקר אנגיוגנזה במבחנה.

חקירת אנגיוגנזה ברמה תפקודית ומולקולרית על ידי מינוף בדיקת נדידת פצע השריטה ובדיקת הנבטת הספרואיד

שיטה זו מאפשרת ניטור של תאים בזמן אמת מדידות כמותיות של פרמטרים שונים הגירה סלולריים כגון מהירות, תזוזה, ומהירות. שלא כמו שיטות מסורתיות, גישה זו בזמן אמת אינה מבוססת על מדידות כמותיות נקודות קצה הגירה, אלא היא מאפשרת ניטור חישוב פרמטרים שונים ברציפות.

ניתוח כמותי של הגירה אקראית של תאים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו

למדו שיטה חסכונית וניתנת להתאמה לביצוע תס"א העברת שריטות בפיברובלסטים לבביים. שיטה זו מאפשרת ניתוח מדויק של נדידת תאים ומספקת כלי נגיש למחקר ביולוגי בסיסי.

תס"א של העברת שריטות חסכונית ותואמה

גלה סרטונים נוספים