Name: בידוד של עכבר כליות תושב CD8+ תאי T לניתוח ציטומטריה זרימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: למדו שיטה לבידוד תאי T CD8+ תושבי כליות בעכברים לניתוח ציטומטריה זרימה. שיטה זו מאפשרת חקר תאי זיכרון ומענה חיסוני אוטואימוני בבעלי חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי NIH מעניק AI125701 ו AI139721, תוכנית CLIP המכון לחקר הסרטן האגודה האמריקנית לסרטן להעניק RSG-18-222-01-LIB כדי N.Z. אנו מודים לקרלה גורנה וסבסטיאן מונטנינו ממתקן Flow Cytometry. נתונים שנוצרו במתקן המשאבים המשותפים של Cytometry זרימה נתמכו על ידי המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו (UTHSCSA), NIH / NCI מענק P30 CA054174-20 (מרכז מחקר קליני ותרגום [CTRC] ב UTHSCSA), ו UL1 TR001120 (פרס מדע קליני ותרגום).

כל הניסויים בבעלי חיים המבוצעים על פי פרוטוקול זה חייבים להיות מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC). כל ההליכים המתוארים כאן אושרו על ידי IACUC UT בריאות סן אנטוניו.
1. העברה מאמצת של תאי P14 T לנמעני C57BL/6 וזיהום LCMV
<ol><li>השתמש בעכברים P14 בגיל 6-12 שבועות. ודא כי המין של עכבר טרנסגני P14 TCR התורם צריך להתאים את המין של עכברים נמען C57BL/6. אחרת, תאים כגון תאי T זכרים המעבירים לעכברים נקביים יגרמו לדחייה מתווכו של תאי T תורמים במחזור בסביבות 12 ימים14.</li>
	<li>לטהר תאים נאיביים CD8+ T מן הטחול ואת בלוטות הלימפה של עכבר מהונדס P14 TCR באמצעות עכבר CD8+ T ערכת טיהור תאים בעקבות פרוטוקול היצרן.<ol>
<li>בקצרה, לנתח טחול ובלוטות הלימפה, לרסק את הדגימות כדי ליצור השעיה תא יחיד.</li>
		<li>כדי להעשיר לתאי T נאיביים, הוסיפו נוגדן ביוטין-אנטי-CD44 במהלך שלב הדגירה הראשון של הנוגדנים13. הערה: ערכת בחירה מסחרית שלילית המשמשת בשלב זה מכילה שני מרכיבים עיקריים לשני שלבים של דגירה (כלומר, דגירה של תערובת ביוטין-נוגדנים ודגירה של חרוזים סטרפטוודין-מגנטי).</li>
	</ol>
</li>
	<li>השתמש hemocytometer לספור את התאים ולהזריק 1,000 כדי 10,000 תאי P14 T מטוהרים ב 200 μL של PBS לתוך כל מין תואם C57BL/6 נמען דרך וריד הזנב. הערה: פרוטוקול הזרקת וריד הזנב מפורט מתואר בשלב 2.</li>
	<li>ביום שלמחרת, כל מקבלי C57BL/6 מקבלים 2 x10 5 pfu LCMV ארמסטרונג מדולל ב 200 μL של PBS באמצעות מסלול תוך-פרטי.</li>
</ol>2. תיוג תוך-וסקולרי של תאי CD8+ T
הערה: בהתאם לאינטרסים המחקריים, ניתן לבחור נקודות זמן שונות לאחר ההדבקה. דוגמה של יום 30 לאחר זיהום (יום 30 לאחר שלב 1.4) הוא הפגין, אשר נחשב לעתים קרובות כנקודת זמן זיכרון מוקדם עבור תגובת תא CD8 T.
<ol><li>לדלל נוגדן ביוטין נגד CD8α ל 15 מיקרוגרם / מ"ל ב PBS. ודא שכל עכבר מקבל 200 μL של PBS המכיל נוגדן 3 מיקרוגרם. הערה: נוגדן ביוטין נגד CD8 משמש כאן, כך שהוא יהיה גמיש יותר לעצב את לוח הכתמים הסופי FACS. ניתן להשתמש ישירות בנוגדן המסוי בצבע פלואורסצנטי. עם זאת, חשוב להשתמש בשכפולים שונים של נוגדנים חד שבטיים לתיוג תוך ורידי לעומת כתמי FACS.</li>
	<li>מחממים כראוי את וריד הזנב של עכברים עם מנורת חום תקורה במשך 5-10 דקות כדי להפוך את הוורידים. הערה: יש לנקוט בזהירות נוספת כדי למנוע התחממות יתר של בעלי החיים. להפחית את החום או להסיר את מנורת החום אם העכברים הפסיקו לנוע.</li>
	<li>צייר 200 μL של תערובת נוגדנים נגד CD8α prediluted לתוך מזרק אינסולין 100 U (28G) ולהסיר את כל בועות האוויר על ידי הזזת הבוכנה למעלה ולמטה. לכופף את המחט כדי ליצור זווית 150 ° בין המחט למזרק, משופע, כך המחט תהיה מקבילה לווריד.</li>
	<li>לרסן את העכבר עם מרסן מכרסמים בגודל המתאים לרסס את הזנב עם 70% אתנול כדי להפוך את הווריד גלוי בבירור. הערה: יש לשמור על משך הריסון למינימום.</li>
	<li>החזק את הזנב בקצה הדיסטלי באגודל ובאצבעות האמצעיות של היד הלא דומיננטית. מניחים את האצבע המורה מתחת לאתר שבו המחט תוכנס.</li>
	<li>החזק את המזרק ביד הדומיננטית והכנס את המחט לווריד במקביל לכיוון הלב. הערה: בעת הצבת כראוי, המחט צריכה לנוע בצורה חלקה לתוך וריד.</li>
	<li>להזריק לאט 200 μL של נוגדן נגד CD8α דרך וריד הזנב. הערה: אם יש התנגדות או אזור לבן נראה מעל המחט על הזנב, המחט אינה בתוך וריד. התחל את הזריקה הראשונית קרוב לקצה הזנב. בעת הצורך, להתקדם לכיוון החלק התחתון של הזנב עבור זריקות הבאות.</li>
	<li>הסר את המחט בעדינות להחיל דחיסה עד הדימום מפסיק.</li>
	<li>להחזיר את העכבר לכלוב, ולהרים את העכבר לאחר 3-5 דקות. הערה: יש להמות את העכברים באמצעות תא isoflurane ואחריו נקע בצוואר הרחם. שיטות אחרות, כגון שאיפת CO2 ייקח עד 5 דקות ועשויות להציג וריאציה מיותרת של זמן תיוג נוגדנים תוך ורידי.</li>
	<li>לנתח את הכליה באמצעות מספריים, להעביר את הכליה כולה 1.5 מ"ל של צינורות microcentrifuge ולהשאיר את הדגימות על הקרח עד עיבוד נוסף. הערה: כליה שלמה שלמה שלמה יכולה להיות מאוחסנת בבטחה על קרח במשך כמה שעות לפני העיבוד והעיכול הבאים.</li>
</ol>3. עיכול אנזימטי של הכליה
<ol><li>הכינו 6 צלחות היטב המכילות 3 מ"ל של תמיסת העיכול (RPMI/2% FCS/1 מ"ג/מ"ל קולגנס B) לכל עכבר, אחסנו על קרח. הערה: ניתן להכין ולאחסן את פתרון קולגנס B בריכוז גבוה יותר (למשל, 20x) ב-20°C או מתחתיו. פתרון עבודה צריך להיות מוכן טרי. נא עיין בטבלה 1 לקבלת המתכונים עבור כל הפתרון/המאגר המשמשים בפרוטוקול הנוכחי.</li>
	<li>הוסף 300 μL של פתרון העיכול לתוך צינורות מדגם מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל טחון דגימות הכליה עם מספריים באביב ישר. הערה: רקמת הכליה צריכה להיות טחון לחתיכות אפילו עם גדלים לא יותר מ 1.5 מ"מ קטרים. אין צורך בשלב עריפת ראש.</li>
	<li>מעבירים את דגימות הכליות הטחון ל-6 צלחות היטב המכילות את פתרון העיכול הערה: 6 צלחות באר משמשות לנוחות רק כאשר יש דוגמאות מרובות לעיבוד.</li>
	<li>הדגירה את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה (סביב 60 סל"ד) במשך 45 דקות.</li>
	<li>לאחר העיכול, מועכים את הרקמה עם אוגן הבוכנה של מזרק 3 מ"ל ישירות בתוך המנה, ומעבירים לתוך צינורות חרוט 15 מ"ל. הערה: בדרך כלל סינון באמצעות מסננת תאים אינו נדרש בשלב זה, כי צנטריפוגה שיפוע צפיפות מבוצעת ליד לטהר לימפוציטים חיים.</li>
	<li>לסובב את הדגימות ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (69 °F).</li>
	<li>תן שימוש חוזר את גלולה ב 3 מ"ל של RPMI/10% FCS.</li>
</ol>4. צנטריפוגה הדרגתית צפיפות להעשרת לימפוציטים מהכליות המתעכלות
<ol><li>לסובב את המדגם ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (69 °F).</li>
	<li>הסר את supernatant ו resuspend גלולת התא עם 5 מ"ל של 44% פרקול / RPMI לערבב (44% פרקול + 56% RPMI ללא FBS).</li>
	<li>שים את הקצה של פיפטה 3 מ"ל המכיל 3 מ"ל של 67% פרקול / PBS (67% פרקול + 33% PBS) ישירות לתחתית של כל צינור, ולאט לאט לשחרר את הפתרון, כך הפתרון הכבד (67% פרקול / PBS) מהווה שכבה ברורה בתחתית פתרון האור (44% Percoll / RPMI) הוא הרים למעלה. יחד, שכבות קוקטייל ייווצור. הערה: עבור אמצעי הדרגתי צפיפות שהגיע לאחרונה מהספק, להוסיף 1/10 נפח של PBS סטרילי 10x לבקבוק, לערבב היטב ולשקול את המדיום שיפוע צפיפות מאוזנת PBS כמו 100% פתרון.</li>
	<li>סובב את הדגימות ב- 900 x g במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר עם האצה מופחתת והגדרת בלמים. הערה: עבור צנטריפוגות עם הגדרות מאיץ ובלמים (בסולם 1-9 (1 פירושו מינימום ו-9 פירושו מקסימום)), השתמש ב- 6 עבור מאיץ ו- 4 לבלמים.</li>
	<li>בזהירות להסיר את הצינורות מן הצנטריפוגה מבלי להפריע את השכבות; הערה: שכבת לימפוציטים ברורה מזוהה בין שכבת RPMI בצבע ורוד לשכבת PBS חסרת צבע.</li>
	<li>הסר את השכבה העליונה עם פיפטה העברה מבלי לגעת בשכבת הלימפוציטים.</li>
	<li>מעבירים את שכבת הלימפוציטים לצינור חדש של 15 מ"ל, ממלאים את הצינור ב- PBS/5% FCS ומערבבים על ידי היפוך הצינור 4-6x לאט כדי להבטיח ערבוב מספיק. הערה: שלב זה חשוב לשטוף את כל שאריות פרקול.</li>
	<li>לסובב את הדגימות ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (69 °F).</li>
	<li>הסר את supernatant מחדש להשעות את גלולת התא עם 500 μL של מדיום RPMI מלא. התאים מוכנים להכתמת ציטומטריית זרימה.</li>
</ol>5. כתמי ציטומטריה זרימה וניתוח
הערה: נא לפעול בהתאם לפרוטוקול הכתמת ציטומיית זרימה סטנדרטית עבור לימפוציטים T.
<ol><li>קח בערך 1 x 106 תאים עבור כל כתמי FACS. הערה: השתמש בצלחת באר U-bottom 96 עבור כתמי FACS. עם זאת, אם רק מספר מוגבל של דגימות מעורבים, 5 צינורות FACS mL ניתן להשתמש גם.</li>
	<li>לסובב את התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (69 °F). השלך את העל-טבעי.</li>
	<li>תן מחדש כל מדגם ב 50 μL של מאגר FACS המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל של חוסם FCR 2.4G2 (נוגדן חד שבטי נגד CD16/32 כדי לחסום את האינטראקציה בין נוגדן FACS הוסיף עם FcR). דגירה על קרח במשך 15 דקות.</li>
	<li>ללא צנטריפוגה נוספת, להוסיף 50 μL של תערובת נוגדנים מכתים פני השטח עבור כל מדגם, כך נפח הכתמים הסופי הוא 100 μL / כל מדגם. דגירה על קרח במשך 30 דקות בחושך. הערה: כלול סטרפטבידין עם תווית פלואורסצנטית (2 מיקרוגרם/מ"ל או בהתאם להמלצת היצרן) בתערובת הנוגדנים כדי לסמן CD8α+ תאי CD8 + Tתוך וסקולריים ולהשתמש בנוגדן פלואורסצנטי שכותרתו אנטי CD8β כדי לסמן את כל תאי CD8 T. תערובת הנוגדנים מיוצרת על ידי הוספת כמויות רצויות של נוגדנים מעוניינים למאגר FACS.</li>
	<li>לשטוף את הדגימות עם PBS פעמיים. עבור כל לשטוף, למלא את בארות של 96 צלחת גם עם PBS קר, להסתובב ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (69 °F) ולהשליך את העל טבעי.</li>
	<li>תן שימוש חוזר בתאים ב 100 μL / גם של צבע חיים / מוות מדולל. דגירה על קרח במשך 30 דקות בחושך. הערה: אפילו עם ספין בינוני שיפוע צפיפות, שלב עיכול אנזימטי לעתים קרובות גורם למוות תאי משמעותי בתאי T תושב רקמות עקב ARTC2.2/P2RX7איתות 15. כתמי צבע חיים / מוות מומלץ מאוד לפני קיבעון. ננו-בודי Anti-ARTC2 יכול להיות administrated לתוך העכברים לפני המתת חסד כדי למנוע מוות תאי הנגרמת על ידי בידוד התא.</li>
	<li>שטפו את הדגימות עם מאגר FACS פעמיים. עבור כל לשטוף, למלא את הבארים של צלחת 96 גם עם חיץ FACS קר, להסתובב ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (69 °F) ולהשליך את העל טבעי.</li>
	<li>תן שימוש חוזר בתאים במאגר תיקון μL/well של 100 μL. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הערה: חיץ תיקון נעשה טרי על ידי דילול פורמלדהיד עם PBS לריכוז סופי של 2% פורמלדהיד.</li>
	<li>שטפו את הדגימות עם מאגר FACS פעמיים. עבור כל לשטוף, למלא את הבארים של 96 צלחת גם עם חיץ FACS קר, ספין ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (69 °F) ולהשליך את העל-טבעי.</li>
	<li>תן שימוש חוזר בתאים במאגר FACS של 250 μL/well. לאטום את הצלחת, לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס ולהגן מפני אור עד ניתוח FACS. הערה: לפני ניתוח FACS, לסנן את הדגימות דרך רשת שינוי ניילון 70 μM כדי להסיר אשכולות תאים אפשריים שעלולים לסתום את מכונת FACS.</li>
</ol>

<ol><li>Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cell+subsets%2C+migration+patterns%2C+and+tissue+residence%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence.</a> Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).</li>
<li>Mueller, S. N., Mackay, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+memory+T+cells%3A+local+specialists+in+immune+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence.</a> Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).</li>
<li>Park, C. O., Kupper, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+resident+memory+T+cells+in+protective+immunity+and+inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease.</a> Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).</li>
<li>Schenkel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+memory.+Resident+memory+CD8+T+cells+trigger+protective+innate+and+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses.</a> Science. 346, 98-101 (2014).</li>
<li>Thome, J. J., Farber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+tissue-resident+T+cells%3A+lessons+from+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans.</a> Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).</li>
<li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hobit+and+Blimp1+instruct+a+universal+transcriptional+program+of+tissue+residency+in+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes.</a> Science. 352, 459-463 (2016).</li>
<li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-box+Transcription+Factors+Combine+with+the+Cytokines+TGF-beta+and+IL-15+to+Control+Tissue-Resident+Memory+T+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate.</a> Immunity. 43, 1101-1111 (2015).</li>
<li>Milner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx3+programs+CD8%28%2B%29+T+cell+residency+in+non-lymphoid+tissues+and+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours.</a> Nature. 552, 253-257 (2017).</li>
<li>Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Specific+Control+of+Tissue-Resident+Memory+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells.</a> Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).</li>
<li>Steinert, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Memory+CD8+T+Cells+Reveals+Regionalization+of+Immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance.</a> Cell. 161, 737-749 (2015).</li>
<li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281(2018).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).</li>
<li>Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+Controls+the+Formation+of+Kidney-Resident+T+Cells+via+Promoting+Effector+T+Cell+Extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation.</a> Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).</li>
<li>Gebhardt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+patterns+of+peripheral+migration+by+memory+CD4%2B+and+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells.</a> Nature. 477, 216-219 (2011).</li>
<li>Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARTC2.2%2FP2RX7+Signaling+during+Cell+Isolation+Distorts+Function+and+Quantification+of+Tissue-Resident+CD8%28%2B%29+T+Cell+and+Invariant+NKT+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets.</a> Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).</li>
<li>Fernandez-Ruiz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-Resident+Memory+CD8%28%2B%29+T+Cells+Form+a+Front-Line+Defense+against+Malaria+Liver-Stage+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection.</a> Immunity. 45, 889-902 (2016).</li>
<li>Beura, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalizing+the+environment+recapitulates+adult+human+immune+traits+in+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice.</a> Nature. 532, 512-516 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין גילויים פיננסיים רלוונטיים.

כמו חסינות ספציפית לרקמות הוא אזור מתרחב במהירות של מחקר, הצטברות ראיות עולה כי תאים חיסוניים, במיוחד אוכלוסיית לימפוציטים ניתן לזהות כמעט בכל האיברים בעכברים אנושיים או נגועים או מחוסנים. מודל זיהום עכבר LCMV הוא מודל מבוסס היטב ללמוד תגובת תאי T ספציפיים אנטיגן, מחולל ובידול תאי T זיכרון כולל ביולוגיה T RM על פנירקמות מרובות. כאן תיארנו פרוטוקול לניתוח תאי CD8+ T בכליה. פרוטוקול זה מותאם במידה רבה מפרסומים המתמקדים ב- TRM12. ככל הנראה בשל ביטוי P2RX7 ברמה גבוהה ו...

זיכרון תושב רקמות (TRM) תאי T מייצגים את אחת מאוכלוסיות תאי T הנפוצות ביותר בעכברים אנושיים ונדבקים בוגרים. תאיT RM מספקים את הקו הראשון של ההגנה החיסונית ומעורבים באופן קריטי בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגייםשונים 1,2,3,4,5. בהשוואה לתאי T במחזור, תאי T RM נושאיםסמני משטח ברורים עם תוכניות שעתוקייחודיות 6,7,8. הרחבת הידע שלנו בביולוגיה של TRM היא המפתח להבנת תגובות תאי T החיוניים לפיתוח עתידי של חיסונים ואימונותרפיות מבוססי תאי T.
בנוסף סמנים מולקולריים משותפים נפוצים של TRMs על פני כל הרקמות שאינן לימפואידיות, הצטברות ראיות עולה כי תכונות ספציפיותלרקמות הם מרכיב מרכזי של ביולוגיה T RM9. הכליות מחסה תאים חיסוניים רביםכולל תאי T RM לאחר ההדבקה ומציע הזדמנותמצוינת ללמוד ביולוגיה של תאי T RM ברקמה שאינה ריר. LCMV חריפה (וירוס choriomeningitis לימפוציטית) זיהום באמצעות מסלול תוך-פרטית הוא מודל זיהום מערכתי מבוסס היטב ללמוד תגובות תאי T ספציפיים אנטיגן בעכברים. הזיהום נפתר בדרך כלל ב 7-10 ימים בעכברים מסוג בר ולהשאיר מספר רב של תאי T זיכרון ספציפי LCMV במגוון של רקמות, כוללהכליה 10. P14 TCR (קולטן תא T) עכברים מהודקים לשאת CD8+ תאי T לזהות את אחד האפיטופים הדומיננטיים במערכת החיסון של LCMV שהוצגו על ידי MHC-I (סוג I מורכב היסטו-תאימות) מולקולה H2-Db בעכברים C57BL/6. שילוב של העברה מאמצת תא P14 T מסומן באופן מולד וזיהום LCMV בעכברים, CD8+ אפקט ותאי T זיכרון נמצאים במעקב, כוללהתביור T RM והומלוסטזיס.
ברקמות מחסום מסוימות, כגון תא לימפוציטים intraepithelial מעיים (IEL) ובלוטות הרוק, הליך בידוד לימפוציטים הוקמה מניב אחוז גבוה של תאי TRM עם זיהום תאי T נשא דם מינימלי בעכבר LCMVמודל 11. עם זאת, ברקמות שאינן מחסום, כגון הכליה, רשת כלי דם צפופה מכילה מספר רב של תאים CD8+ T במחזור. זה כבר מתועד היטב כי אפילו חיסון מוצלח לא יכול להסיר ביעילות את כל תאי CD8+ T במחזור. כדי להתגבר על משוכה טכנית זו, כתמי נוגדנים תוך וסקולריים הוקמה כ אחת הטכניקות הנפוצות ביותר במעבדות TRM 12. בקצרה, 3-5 דקות לפני המתת חסד, 3 מיקרוגרם / עכבר נוגדן נגד CD8 (כדי לסמן CD8+ תאי T) מועבר דרך הווריד. קיר כלי דם שלם מונע דיפוזיה מהירה של הנוגדן בתוך פרק זמן קצר זה (כלומר, 3-5 דקות) ורק תאים תוך-וסקולריים מסומנים. בעקבות פרוטוקול בידוד לימפוציטים סטנדרטי, תאים תוך וסקולריים לעומת חוץ וסקולריים ניתן להבדיל בקלות באמצעות ציטומטריית זרימה.
כאן, נתאר פרוטוקולסטנדרטי נפוץ במעבדות T RM לביצוע תיוג תוך וסקולרי, בידוד לימפוציטים וניתוח ציטומטריה זרימה של תאי CD8+ T בכליות באמצעות עכבר C57BL/6 שקיבל CD45.1+ תאי P14 T וזיהום LCMV 30 יוםלפני 13. ניתן להשתמש באותו פרוטוקול כדי ללמוד הן את תאי T משפיעים והן זיכרון T בכליה.

<table><tbody><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>פישרברנד</td><td>05-408-130</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>קורנינג</td><td>431470</td><td></td></tr><tr><td>3 מ"ל מזרק</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>37C אינקובטור</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדן ביוטין a-CD8a (שיבוט 53-6.7)</td> <td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0081-U025</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל</td><td>GE Healthcare Life מדעים</td><td>SH30073.03</td><td></td></tr><tr><td>Collegenase B</td><td>Millipore Sigma</td><td>11088807001</td><td></td></tr><tr><td>חד פעמי בוגר העברה פיפטות</td><td>פישרברנד</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>מזרק אינסולין</td><td>BD</td><td>329424</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו חיתוך מספריים קפיציים</td><td>Roboz כירורגי</td><td>RS 5692</td><td></td></tr><tr><td>Mojosort עכבר CD8 Na&iuml; ve T Cells בידוד ערכת</td><td>Biolegend</td><td>480043</td><td></td></tr><tr><td>מנורת חום עילית</td><td>אמזון</td><td>B00333PZZG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17089101</td><td></td></tr><tr><td>נדנדה</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30096.01</td><td></td></tr><tr><td>עכבר פליז מוצק מסנן</td><td>Braintree Scientific, Inc</td><td>SAI-MBR</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה דלי נדנדה עם מקרר</td><td>תרמו-פישר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>רקמות תרבית 6 בארות</td><td>צלחת קורנינג</td><td>3516</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של עכבר כליות תושב cd8+ תאי t לניתוח ציטומטריה זרימה

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

תא T זיכרון תושב רקמות (TRM)הוא תחום המתרחב במהירות של מחקר אימונולוגיה. בידוד תאי T מרקמות שונות שאינן לימפואידיות הוא אחד השלבים העיקריים לחקור TRMs. ישנן וריאציות קלות בפרוטוקולי בידוד לימפוציטים עבור איברים שונים. הכליה היא איבר חיוני שאינו לימפואידים עם חדירת תאים חיסוניים רבים במיוחד לאחר חשיפה לפתוגן או הפעלה אוטואימונית. בשנים האחרונות, מעבדות מרובות כולל שלנו החלו לאפיין תאי CD8+ T תושבי כליות במסגרות פיזיולוגיות ופתולוגיות שונות הן בעכבר והן בבני אדם. בשל שפע של לימפוציטים T, הכליה מייצגת איבר מודל אטרקטיבי ללמוד TRMs ברקמות שאינן ריר או לא מחסום. כאן, נתאר פרוטוקול נפוץ במעבדות ממוקדות TRMכדי לבודד תאי CD8+ T מכליות עכבר בעקבות זיהום ויראלי מערכתי. בקצרה, באמצעות מודל זיהום וירוס דלקת לימפוציטית חריפה (LCMV) בעכברים C57BL/6, אנו מדגימים CD8תוך וסקולרי + תיוג תא T, עיכול אנזימטי, צנטריפוגה שיפוע צפיפות לבודד ולהעשיר לימפוציטים מכליות העכבר כדי להפוך דגימות מוכנות לניתוח ציטומטריה זרימה הבאים.

הפרוטוקול המתואר כאן מסוכם בתרשים זרימה (איור 1A). ביום 30 לאחר זיהום LCMV, ביצענו תיוג תוך וסקולרי של תאי CD8+ T. 5 דקות לאחר מכן, שתי הכליות של החיה נותו, טחנו ונפלטו לעיכול קולגנס. לימפוציטים טוהרו עוד יותר מהדגימות המתעכלות באמצעות צנטריפוגה פרקול ונותחו על ידי ציטומטריית זרימה. כפי שמוצג איור 1B, גם לאחר העשרת לימפוציטים בתתיווך צנטריפוגה בצפיפות, היה נפוץ מאוד לראות חלק גדול מהלימפוציטים שאינם לימפוציטים במוצר הסופי. עם זאת, לאחר gating על לימפו...

בעקבות זיהום ויראלי, הכליות מטפחות מספר גדול יחסית של תאי CD8+ T ומציעות הזדמנות לחקור תאי TRM שאינם ריר. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבודד לימפוציטים כליות העכבר לניתוח ציטומטריה זרימה.

בידוד של עכבר כליות תושב CD8+ תאי T לניתוח ציטומטריה זרימה

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

תאי CD8+T נושאים תכונות שונות ברקמה שונה, כדוגמה קריטית לרקמות לא ריר ולא לימפה. זה חיוני כדי לאפיין ישירות תאים תושבי כליות כדי להבין באופן מלא ביולוגיה של תאי T. כאן נדגים את השיטה הנוחה שלנו לבודד תאי CD8+T תושבי הכליות המתאימים לניתוח ציטומטריית זרימה עוקבת.שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך המחקרים של תאים CD8 + T אפקטר וזיכרון שנוצר לאחר זיהומים, כמו גם תגובות אוטואימוניות. ההליך יתבצע על ידי ד"ר צ'אויו מא, מדען מחקר במעבדה שלי. התחל בדילול נוגדן אלפא נגד CD8 ביוטין ל-15 מיקרוגרם למיליליטר ב-PBS, וודא שיש מספיק כדי לנהל 200 מיקרוליטר לכל עכבר.לפני ההזרקה, מחממים את וריד הזנב של העכבר עם מנורת חום תקורה במשך חמש עד 10 דקות כדי להפוך אותו. ציירו 200 מיקרוליטרים של תערובת הנוגדנים המדוללים מראש למזרק אינסולין של 28 מדים והסירו את כל בועות האוויר על ידי הזזת הבוכנה מעלה ומטה. לכופף את המחט כדי ליצור זווית של 150 מעלות בין המחט לבין המזרק, משופע, כך המחט מקבילה לווריד הזנב.לרסן את העכבר עם מרסן מכרסמים לרסס את הזנב עם 70% אתנול כדי להפוך את הווריד גלוי בבירור. החזק את הזנב בקצה הדיסטלי עם האגודל והאצבעות האמצעיות של היד הלא דומיננטית, ולאחר מכן מקם את האצבע המורה מתחת לאתר ההזרקה. עם היד הדומיננטית להכניס את המחט לתוך וריד במקביל לכיוון הלב לאט להזריק 200 microliters של הנוגדן.הסר את ה

isolation-mouse-kidney-resident-cd8-t-cells-for-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

תאי DNabT הם נדירים בין תאי T היקפיים; עם זאת, הם נמצאים בשפע ברקמות שאינן הלימפה מסוימות. קושי של בידוד תאי T DN מרקמות שאינן הלימפה מעכב אנליזה הפונקציונלית שלהם למרות במיוחד גדל הבחין במשמעות pathophysiologic. אנו מתארים פרוטוקול חדשני לבידוד של תאי T DN נקיים במיוחד מכליות עכבריות.

בידוד של תאי T αβ כפול שליליים מהכליות

פרוטוקול זה מתאר עיכול אנזימטי של עור עכבר במדיום עשיר בחומרים מזינים ואחריו הפרדת שיפוע לבידוד לויקוציטים.  תאים הנגזרים כך יכולים לשמש ליישומים מגוונים במורד הזרם. זוהי אלטרנטיבה יעילה, חסכונית ומשופרת למכונות דיסוציאציה של רקמות ופרוטוקולי עיכול רקמות קשים יותר וטריפסין מבוססי דיספאז.

בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

דלקת ממלאת תפקיד מרכזי בפתוגנזה של שבץ איסכמי. עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שהוא פועל כחרב פיפיות המחמירה פגיעה מוחית מוקדמת, אך גם תורמת לתיקון מאוחר יותר. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאי חיסון מהמוח האיסכמי ואת הפנוטיפ הציטומטרי הזרימה שלהם לאחר מכן.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

תת-קבוצות תאים דנדריטיות נפרדות קיימות כאוכלוסיות נדירות באיברי לימפה, ולכן הן מאתגרות לבידוד במספרים ובטוהר מספיקים לניסויים אימונולוגיים. כאן אנו מתארים שיטת יעילות גבוהה ותפוקה גבוהה לבידוד של כל תת-הקבוצות העיקריות הידועות כיום של תאים דנדריטיים של טחול עכבר.

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

מקרופאגים הם תאי פלסטיק של מערכת hematopoietic כי יש תפקיד מכריע בחסינות מגן הומיאוסטזיס. בדו"ח זה, אנו מתארים אופטימיזציה של טכניקות חוץ גופית כדי phenotypically ופונקציונלית לאפיין להשתלשלים מסתננים מקרופאגים תקינה המצטברים באיבר המושתל בתנאים סובלני.

אפיון פונקציונלי של מקרופאגים רגולטוריים המעכבים חסינות-תגובתי חסינות

טכניקות אמינות ויעילות לבידוד תאי חיסון כליות נחוצות ליישומים במורד הזרם. זה דורש תיוג נוגדנים על פני השטח של מספר קטן של תאי חיסון כליות. כאן אנו מתארים שיטה תמציתית לבידוד תאי חיסון בכליות שלכאורה משיגה מטרה זו.

הפקת יעילות אמינה גבוהה של תאים מכליות חיסון

מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורט לזהות ולכמת תת T לימפוציטים תפקודית נוכח בתוך הכליה בעכברים, אבי העורקים ובלוטות לימפה על ידי מכתים תאיים cytometry הזרימה. המודל של יתר לחץ דם הנגרמת אנגיוטנסין II נבחר להסביר, צעד אחר צעד, את הנהלים ואת עקרונות יסוד של cytometry זרימה מכתים תאי.

תאיים מכתים cytometry זרימה לזהות לימפוציטים קבוצות משנה בתוך Murine אבי העורקים, כליות בלוטות לימפה מודל של יתר לחץ דם

מיליוני אנשים סובלים ממחלות ניוונית של הרשתית הגורמות עיוורון בלתי הפיך. מרכיב נפוץ של רבים ממחלות אלה הוא אובדן תאי הגנגליון ברשתית (RGCs). פרוטוקול מפורט זה מתאר את הבידוד של RGCs Murine העיקרי על ידי בחירה חיובית ושלילית עם cytometry הזרימה.

בידוד של תאים ראשיים Murine הרשתית גנגליון (RGCs) על ידי זרימת cytometry

במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול להכנת תאים בודדים של בלוטת התימוס מאתר הלבלב ניקוז הלימפה והטחול ללימוד נוסף תאים אלה באמצעות cytometry זרימה. בנוסף, פרוטוקול זה שימש לקביעת תת-קבוצות של הרגולציה ותאי T באמצעות cytometry זרימה.

קביעת קבוצות משנה תא T רגולטורי ב מאתר התימוס, הלבלב ניקוז הלימפה והטחול באמצעות Cytometry זרימה

זרם סידן, מדד לאיתות תאי T, הוא דרך יעילה לנתח תגובות לגירוי קולטן תאי T. פרוטוקול זה לריבוב Indo-1 עם לוחות נוגדנים המכוונים למולקולות פני התא מנצל את היכולות הגמישות ביותר של ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא.

ניתוח של זרימת סידן המושרה על ידי קולטן תאי T בתאי T מורין ראשוניים על ידי ציטומטריית זרימה ספקטרום מלא

פרוטוקול זה מפרט את הבידוד של אוכלוסיות חיסוניות ולא מחוסנות מריאות העכבר במצב יציב ובעקבות זיהום בשפעת. הוא גם מספק אסטרטגיות שער לזיהוי תת-קבוצות של תאים אפיתל ומיאלואידים.

בידוד אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיתל חיים מריאת העכבר

למדו שיטה לבידוד תאי T CD8+ תושבי כליות בעכברים לניתוח ציטומטריה זרימה. שיטה זו מאפשרת חקר תאי זיכרון ומענה חיסוני אוטואימוני בבעלי חיים.

בידוד של עכבר כליות תושב CD8⁺ תאי T לניתוח ציטומטריה זרימה

גלה סרטונים נוספים