מודל לולאה המודינמית במבחנה כדי לחקור את תאימות Hemocyto והפעלת תא מארח של מכשירים רפואיים כלי דם

מודל לולאה המודינמי זה מאפשר לחוקרים לבדוק את תאימות המו במבחנה של התקני כלי דם כגון צינורות תדלוק או סטנטים. בתנאים סטנדרטיים. אז טכניקה זו אינה מפעילה כל השפעה על הדם על ידי כוח מכני ובכך למנוע את התוצאות המטעות על ידי הפעלה פנימית של רכיבי הדם.

לפני שתנסה ניסוי, יש לתרגל הרכבה נכונה של חלק מכני, בניית מערכת סגירת לולאה מושלמת וטעינת דם איטית ללולאות. כדי להכין את הרכבה לולאה, להשתמש חותך צינור לחתוך 250 ס"מ ארוך, חמישה מילימטרים קוטר פנימי חתיכות של צינורות על משטח שטוח. ולחבר את הפתחים הפתוחים של הצינורות לחתיכה קצרה של צינור סיליקון שמתאימה לקוטר החיצוני של צינור החקירה כדי ליצור צורת לולאה.

הדקו בזהירות את בורג הנעילה של מחבר רצועת המתח והתאיימו את כוח הסגירה כך שלא יישאר רווח בין שני הכיפופים. אם בורג הנעילה מתהדק במלואו והמתח של רצועת הפוליקרבונט נראה נמוך מכדי לסגור את הפער בין שני הכיפופים, פתח את מערכת הנעילה וגזור כמה מילימטרים של רצועת המתח. כדי להכין הרכבה לולאה סטנט, לפתוח שתיים לולאות ולה להוציא את הצינור מתוך מערכת רצועת המתח.

לאחר מכן הכנס את הסטנט לאמצע הצינור כפי שהורה היצרן. כאשר מספר לולאות המתאים לניסוי נוצרו לאבטח את לולאות העריסה לולאה של יחידת הסיבוב, מחוץ לאמבט מים 37 מעלות ולצרף את ערש הלולאה ליחידת הסיבוב בתוך אמבט המים. לאחר מכן, מלא מזרק אחד 10 מיליליטר עבור כל שתי לולאות של דם להיאסף עם 150 microliters או פתרון מלאי הפרין מוכן טרי ולהשתמש פרפר 21 מד בעדינות לאסוף דם לתוך המזרקים, דואג למנוע הומוליזה או הפעלת תא עקב ואקום מוגזם.

כאשר כל הדם נאסף להעביר את הדם ל זכוכית ולהשתמש פיפטה סרולוגית חמישה מיליליטר, בעדינות לערבב את הדם ואת הפרין. כאשר פתרון הומוגני הושג עם קצה פיפטה לא מוכנס במלואו לתוך הצינור, בזהירות, למלא כל לולאה עם חמישה מיליליטר של דם. סגור כל לולאה לאחר מילויה ואשר שהלולאה, רצועת המתח ומדף התקשורת מאובטחים כראוי.

ואז לסובב את הלולאות במשך שלוש שעות ב 30 מהפכות לדקה. בסוף הסיבוב, לאפשר ללולאות לעמוד במדף במשך שתי דקות כדי לאפשר לדם להצטבר בתחתית הלולאה לפני פתיחת המחברים בזהירות ומושך את הדם מכפילויות לתוך זכוכית בודדת 10 מיליליטר. כאשר כל הדם נאסף לשטוף כל צינור עם 10 מיליליטר של PBS ולהשתמש אזמל לחתוך בזהירות מדגם סנטימטר אחד מקצה כל צינור.

הדגירה את הדגימות לילה ב 2% glutaraldehyde בארבע מעלות צלזיוס, ואחריו דגירה 15 דקות ו 1% אוסמיניום tetroxide בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה osmium tetroxide, לייבש את הדגימות בסדרה אתנול עולה במשך 20 דקות לריכוז, ואחריו התייבשות 30 דקות ב 100% אתנול. בסוף הדגירה 100%אתנול, לתת את הדגימות להתייבש לילה בטמפרטורת החדר לפני הדמיה הדגימות על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים במתח האצה של חמישה קילו-וולט, באמצעות סורק מיקרו CT רנטגן.

לניתוח ציטומטרי זרימה של דגימות הדם. העבר 100 מיקרוליטרים של דם מכל דגימה לכל אחד מתשעה צינורות FACS חמישה מיליליטר ולתקן את הדגימות עם תוספת של 100 microliters של 4% כוח פורמלדהיד לכל צינור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. לאחר הכביסה, להשעות מחדש כל גלולה במיליליטר אחד של חיץ תמוגה תא דם אדום לכל צינור, עבור דגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.

בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות על ידי צנטריפוגה במיליליטר אחד של PBS לצינור ולמקום את הדגימות ללא supernatants שלהם על הקרח. כדי להכין חרוזים פיצוי כתם יחיד להוסיף ארבע טיפות של חיובי וארבע טיפות של חרוזים שליליים בודדים נפח אחד מיליליטר של חיץ FACS, ומערבולת הפתרונות כדי להשיג השעיות חרוז הומוגני. הוסף 100 מיקרוליטרים של כל פתרון לכל אחד מארבעה או חמישה צינורות FACS מיליליטר המסומנים כמצוין ולשטוף את חרוזים עם מיליליטר אחד של חיץ FACS לכל צינור.

לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של קוקטייל נוגדני המערבולת המתאים לכל ניסוי ונורסצנטיות מינוס צינור אחד עם ערבוב עדין. עבור דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות עם מיליליטר אחד של חיץ FACS טרי לכל מדגם כדורי resuspend ב 250 microliters של חיץ FACS לכל צינור.

לפני ניתוח חרוזים על דגימות תאים על ידי cytometry זרימה, על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. ניתן לדמיין הפצות תאי דם על פני השטח כולו של שני bloops שידוך על ידי מיקרו CT וסריקת הדמיה מיקרוסקופ אלקטרונים בעוד לא קרישי נצפו בלולאות סגורות ללא פערים. ניתוח של ספירת תאי הדם כולה, אינו מראה הבדלים משמעותיים במספרי אריתרוציט בין כל התנאים שנבדקו, טסיות דם ומספרי לויקוציטים עם זאת, מופחתים באופן דרסטי בקבוצת לולאת לטקס ומספרי המוגלובין חינם גדלים באופן דרמטי, המציין תאימות ביולוגית ירודה מאוד של לטקס.

בעוד כל מכשירי כלי הדם שנבדקו לגרום להפעלה מוגברת של מערכת קרישה מרכיב מחמאה. לולאות PVC מצופות הפרין מציגות מגמה של ירידה ברמות של שני סוגי ההפעלה בהשוואה ללולאות PVC מצופות פולימר. לולאות לטקס מציגות את הרמות הגבוהות ביותר של TNF IL-6 ו- PMN elastase, המדגישות את ההפעלה החזקה של לויוציטים על ידי לטקס.

טסיות דם חיוביות CD41 התאושש צינורות לטקס, להפגין עוצמת פלואורסצנטיות חציונית גבוהה מאוד עבור CD62P, בעוד ביטוי משולב מופחת באופן דרסטי על גרנולוציטים ולימפוציטים. עניין, רמות אינטגרליות גבוהות יותר מונוציטים מצינורות לטקס, מה שמרמז על אינטראקציות טסיות דם המופעלות על ידי מונוציטים. אכן כתמים עבור אגרגטים טסיות מונוציטים מגלה נטייה מוגברת לצבירה לולאות לטקס סטנט.

למרות התדירות המונוציטים המופחתת בתוך לולאות לטקס. כדי למנוע הפעלת רכיב דם מהותי חשוב להבטיח סגירת לולאה נכונה ולטפל בדם בזהירות. אז בעקבות הליך זה, ניתן לנתח את האינטראקציה בין חלבונים allogeneic או TRUCKs ורכיבי דם המשמשים דלקת או מחקר התרופות.