כימות של DNA ספציפי חזיר במחזור בדם של מודל xenotransplantation

Xenotransplantation היא שיטה אפשרית לטיפול עם זאת, ניטור יעיל של הדחייה החיסונית של xenotransplantation היא בעיה עבור רופאים החוקרים. פרוטוקול זה הוא שיטה פשוטה, נוחה, בעלות נמוכה ופחות פולשנית כדי לפקח על הדחייה החיסונית של xenotransmutation. טכניקה זו יכולה לשמש בתחום xenotransplantation, כולל השתלת איון חזיר לאדם, השתלת כליה, השתלת כבד והשתלת לב.

התחל בהעברת 500 מיקרוליטרים של דגימות דם לצינורות מיקרו צנטריפוגה שונים. הוסף 20 microliters של פרוטאז K ו 500 microliters של מאגר תזה לתוך הצינורות. ואז ביסודיות לנער אותם לערבב.

שים את הצינורות באמבט מים ב 56 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, מנער אותם פעמיים עד שלוש פעמים במהלך הדגירה עד הפתרון הופך ברור צנטריפוגה אותם בקצרה כדי להסיר את חרוזים נוזלי מן הקיר הפנימי של כיסויי הצינור. לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטרים של אלכוהול נטול מים, אתיל, ורעידות ביסודיות. מעבירים את התערובת לעמודת ההסתח.

ואז צנטריפוגה העמוד במשך שתי דקות להשליך את נוזל הפסולת. הוסף 800 מיקרוליטרים של פתרון שטיפה לכל עמודת סגיפה, וצנטריפוגה למשך דקה אחת. השאירו את העמודים בטמפרטורת החדר למשך מספר דקות כדי לייבש את תותר השטיפת הנותר.

מעבירים את עמודי הספיגה לצינור צנטריפוגלי נקי. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של חיץ אלוטיון לאמצע סרטי ההסחתה וממקמים אותם בטמפרטורת החדר למשך שתיים עד חמש דקות, ואז צנטריפוגה אותם לדקה אחת. הכינו את תערובת המאסטר של PCR בהתאם לכיווני כתב היד, ולאחר מכן הוסיפו 23 מיקרוליטרים של התערובת לכל צינור מיקרו צנטריפוגה 0.6 מיליליטר.

מוסיפים שני מיקרוליטרים של דנ"א גנומי לכל צינור ובזהירות קאבוט. ואז לערבב בקצרה צנטריפוגה. מניחים את הצינורות במחזור PCR ולהתחיל את ההגברה.

כאשר התגובה היא סיימה לבצע אלקטרופורזה אגרוז. מוסיפים 1.2 גרם של אגרוז לתוך בקבוקון המכיל מאה מילימטרים של TAE ומרתיחים אותו במשך חמש דקות במיקרוגל. לאחר אגרוז התקרר כ 70 מעלות צלזיוס, להוסיף חמישה microliters של צבע חומצת גרעין לתוך הבקבוק, לאט, לשפוך אותו לתוך הצלחת ולהשאיר אותו בטמפרטורת החדר עד שהוא מתמצק לתוך ג'ל.

הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של כל דגימה וסולם דנ"א 2-Log או סמן דנ"א 1, לתוך הבארות של ג'ל אגרוז ואלקטרופורזה במזח של 120 מיליון עד שהרצועות מופרדות. דמיינו את הג'ל עם תמונה אולטרה סגולה. לאחר ביצוע טרנספורמציה כמתואר בכתב היד של הטקסט, אמת את הפלסמידים על ידי עיכול אנזימים של הגבלה כפולה עם EcoR I ו- Bam HI. הפרד את המוצרים המתעכלים עם אלקטרופורזה אגרוז 1% וחשוף את הג'ל לאור UV.

מדללים את הפלסמיד המרוכז עם שבר ה-DNA של החזירים לפי שניים מ-10 עד ה-11 למיליליטר עבור הפתרון הסטנדרטי ההתחלתי, תוך שימוש במים מזוקקים כפולים. כדי ליצור עקומה סטנדרטית, הכינו תמהיל מאסטר qPCR, כמתואר בכתב היד של הטקסט והוסיפו 40 מיקרוליטרים של התערובת לכל צינור של רצועת שמונה צינורות. מוסיפים 10 מיקרוליטרים של דנ"א סטנדרטי של ריכוזים שונים, מכסים את הצינורות ואז מערבבים אותם בקצרה וצנטריפוגים אותם.

מניחים את הצינורות במכונת qPCR ולבצע את ההגברה. השתמש צינורות EDTA כדי לאסוף דגימות דם של כ 400 microliters ממודלים תיקון עורק חזיר-לקוף, או 100 microliters ממודלים השתלת תא חזיר לעכבר. ואז להעביר את הדגימות ל 1.5 צינורות צנטריפוגה מיליליטר.

הסר את תאי הדם מדגימות הדם על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה נמוכה ומהירות גבוהה. העבר את supernatant לצינור צנטריפוגה חדש 1.5 מיליליטר ולהסיר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב 16, 000 פעמים G במשך 10 דקות. מעבירים את העל-טבעי לצינור צנטריפוגה חדש באורך 1.5 מיליליטר ומוציאים את הדנ"א המסתובב באמצעות סרום מסחרי תוך כדי הפצת ערכת מיצוי דנ"א.

לדחוס את נפח ה-DNA במחזור ל 40 microliters ולאחסן אותו ב 20 מעלות צלזיוס שלילי. בצע qPCR לכמת את ה-DNA ספציפי חזיר במחזור. פריימרים ספציפיים לפורצ'ין תוכננו והשתמשו בהם כדי לכמת דנ"א ספציפי לחזיר במחזור על ידי qPCR, במודלים להשתלת תאי חזיר-עכבר ותיקון עורק חזיר-לקוף, מודלים להשתלה.

אלקטרופורזה אגרוז שימשה לבידוד שברי דנ"א מוגברים. באמצעות PCR זוהו פריימרים ספציפיים לדנ"א גנומי מוגבר של פורצ'ין. לאחר מכן, מינים ספציפיים של פריימרים אלה בקבוצה של קוף או DNA גנומי אנושי או בקבוצה של DNA גנומי העכבר, אושרו.

לבסוף, שני פריימרים ספציפיים למינים, שימשו להגברת הדנ"א של חזירים במדבקת העורק של חזיר-לקוף וחזיר לעכבר, מודלים להשתלת תאים. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ניסיון פרוטוקול זה, הוא כי זיהום מכל הסוגים יש למנוע. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים לחקור שאלות חדשות בתוך xenotransplantation כי זה פשוט בעלות נמוכה ולא פולשנית שיטה כדי לפקח על הדחייה החיסונית של xenotransplantation.