הדמיה של דינמיקה דיפוזיונית של ננו-ירדס זהב על קרום התא באמצעות מיקרוסקופיה אחת של ננו-חלקיקים בדארקפילד

הפרוטוקול שלנו משתמש בניתוח בדיקת חלקיקים יחיד כדי לפקח על הדינמיקה של המיקום והכיוון ומאפיין את הדיפוזיה של ננו-רודים זהובים על קרום התא. בשיטה זו ניתן להשיג הן את התרגום והן את הדינמיקה הסיבובית של ננורודים זהובים ואת הדינמיקה ניתן לנתח באופן מקיף את המוצג. לפרוטוקול זה יש פוטנציאל לשמש לחקר סוגים אחרים של מערכות ביולוגיות מורכבות.

התחל על ידי שריפת כיסויי זכוכית טבול אתנול על הלהבה והנחת כיסוי בצלחת 35 על ידי 10 מילימטר תרבות התא המכיל שני מיליליטר של מדיום תרבות התא ללא פנול אדום. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של השעיית התא של עניין על כריכה בעדינות לנער את המנה קדימה ואחורה שמאלה וימינה כדי להפיץ את התאים באופן שווה. מניחים את המנה לתוך החממה תרבות התא במשך כ 12 שעות עד התאים להגיע 20 עד 40% מפגש לפני הוספת 20 microliters של nanorods זהב מצופה CTAB למנה.

לאחר טלטול עדין כדי לפזר את nanorods באופן שווה על פני המנה, מניחים את המנה באווירה לחה במשך חמש דקות. בסוף הדגירה, מעבירים באיטיות 100 מיקרוליטרים של על-טבעיים מהתבשיל לתוך הגרוב של מגלשת זכוכית ומניחים בזהירות את צד תא הכיסוי כלפי מטה על גרוב השקופית, ואז אוטמים את קצה הכיסוי בלק ציפורניים ומניחים את לק הציפורן יבש לפני הנחת השקופית על במת המיקרוסקופ של שדה אפל. למעקב אחר חלקיקים בודדים על ידי מיקרוסקופיה של שדה אפל, הניחו טיפת שמן על מייצב שדה החשוך טבילה בשמן וסובבו את הידית עד שהמעבה יוצר קשר עם מגלשת הזכוכית.

מניחים טיפת שמן על החלק העליון של זכוכית הכיסוי ולהפוך את הידית התמקדות עד המטרה טבילה שמן 60X נוגע בשמן. הפעל את מקור האור וסובב מעט את ידית המיקוד כדי למקד את מישור ההדמיה. לאחר מכן לחצו על סמל המצלמה בתוכנת המיקרוסקופ כדי להקליט סדרת זמן תמונה קלה לפיזור לדוגמה באמצעות מצלמת CMOS הצבעונית ולשמור את התמונה בתבנית TIFF.

לחילוץ מסלול ארוך טווח יחיד, פתחו את התמונה ב- ImageJ ולחצו על תמונה, כתב ו- 8 סיביות להמרת התמונה ממצב RGB למצב 8 סיביות. להתאמת החדות, לחצו על 'תמונה', 'כוונן', 'ניגודיות בהירות' וקבעו את הפרמטרים. בחר חלקיק יעד והשתמש בפקד X כדי לחתוך את רקע סידרת הזמן.

לחץ על תוספים, גשש חלקיקים קלאסי וגשש חלקיקים כדי לפתוח את חלון זיהוי החלקיקים וקישור החלקיקים ולהגדיר את הרדיוס לשישה, את החיתוך לאפס ואת האחוזון ל- 0.01%הגדר את טווח הקישור ל- 10 ואת ההעתקה ל- 10 ולחץ על אישור כדי לפתוח את חלון התוצאות של עוקב החלקיקים כדי לראות את התוצאות. לחץ על דמיין את כל המסלולים כדי לבדוק את המסלולים שנוצרו. אם התוכנה שנוצרה מסלול ואת המסלול הנע של nanorods זהב תואמים, לחץ על שמור את הדו"ח המלא כדי לשמור את התוצאות.

אם מסלול התוכנה שנוצר אינו תואם את המסלול הנע של nanorods זהב, לחץ על לקשר מחדש חלקיקים כדי לקשר מחדש את החלקיקים שזוהו עם טווח קישור שונה פרמטרים אחוזון. כדי למצוא את קואורדינטת הפיקסלים המרכזית של ננו-הקורוד המוזהב בכל מסגרת בהתאם לקואורדינטות XY, השתמש בקסיקורדיניזציה. פונקציית m.

כדי לתחום מטריצת שלושה על שלושה פיקסלים, חלץ את תשעת ערכי עוצמת הפיזור של הערוצים האדומים או הירוקים וחשב ערך ממוצע, השתמש ב- rgextraction. פונקציית m. אז תשתמש בקוטב.

m פונקציה לחישוב זוויות הקוטב בשיטת הדיפרנציאל של הערוץ הכפול. כדי לחשב פרמטרים דינאמיים באמצעות הנוסחאות בטבלה, הפעל את שני קבצי ה- Script של הניתוח. לניתוח חזותי של המסלול, הגדר את קואורדינטת X כ- X, את קואורדינטת Y כ- Y ואת השעה כ- Y ולאחר מכן לחץ על התוויה, פיזור ומפת צבע, הגדר את פרמטרי הגרף והוסף את סרגל הצבע.

כדי ליצור נתוני מרווח זמן של התזוזה המרובעת הממוצעת, הגדר את מרווח הזמן כ- X ואת ההעתקה הריבועית הממוצעת כ- Y.Click התוויה, פיזור, ניתוח, התאמה, התאמת עקומה לא ליניארית ודיאלוג פתוח והגדר את פרמטרי הגרף. לניתוח סטטיסטי מרובה חלקיקים, הגדר את הפרמטרים הדינמיים של עניין כ- Y ולחץ על התוויה והיסטוגרמה. לחץ פעמיים על ההיסטוגרמה כדי להגדיר את גודל החטיבה או את מספר החטיבות ולחץ על החל.

לאחר מכן הוסף עמודה והגדר את פרמטרי הגרף. עבור ניתוח סידרת זמנים, הגדר את השעה כ- X ואת הפרמטרים של סידרת הזמן כ- Y.Click התוויה, חלונית מרובה ומחסנית. בחלון המוקפץ, בחר קו ובסדר. לאחר מכן הגדר את הפרמטרים עבור הגרף.

מקסימום פלסמוני אורך של 40 על ידי 85 ננומטר זהב מצופה CTAB הוא כ 650 ננומטר ואת התהודה הרוחבית היא 520 ננומטר. עוצמת הפיזור של nanorods זהב מצופה CTAB על קרום התא U87 מדגים התפלגות גאוסיאנית טיפוסית עם רוחב צר עולה בקנה אחד עם זה של NANORODs זהב מצופה CTAB על זכוכית המציין כי NANORODs זהב מצופה CTAB במעקב בניסוי זה הם מונודיספרסים היטב. כפי שמודגם, יותר מ 500 מסלולי nanorod זהב מצופה CTAB ניתן לעקוב אחר על ידי מיקרוסקופיה שדה כהה ניתן לחלק למסלולי דיפוזיה לטווח ארוך מסלולי דיפוזיה מוגבלים.

הרדיוס של gyration של כל 500 מסלולים בניתוח מייצג זה הראה התפלגות ערך קטנה עם רדיוס ממוצע של gyration של 0.5 מיקרומטר ואת התזוזה המרבית היה מופץ יותר בערכים קטנים. כפי שהוכח בניתוח זה זמן ממוצע ממוצע תזוזה מרובעת, nanorods זהב מצופה CTAB בדרך כלל מפוזרים עם אלפא של אחד בערך. התפלגות הצפיפות של מקדם הדיפוזיה והאלפא המתקבל מכל המסלולים, עם זאת, מגלה כי הדינמיקה של nanorods זהב מציגה התפלגות הטרוגנית עם superdiffusion, בראוניאן, תנועות subdiffusion.

בנוסף, ניתן להשתמש בניתוח סטטיסטי של חלקיק יחיד וניתוח פרמטרי סדרות זמן כדי לאפיין שני מסלולים מייצגים ארוכי טווח מוגבלים ונעים. יש צורך לסכם ולחלץ פרשנות רומן יחיד של נתונים על קריאת ניתוח מעקב חלקיקים יחיד כמו בדרך כלל יש כמה עסקאות קשות לעשות.