ניתוח רשת α-Actinin בקרדיומיוציטים אנושיים הנגזרים מ-iPSC באמצעות מיקרוסקופיה לתיאום מולקולה אחת
3 בנובמבר 2020
היווצרות של רשת sarcomere נכונה חשובה להתבגרות של cardiomyocytes נגזר iPSC. אנו מציגים גישה מבוססת רזולוציה סופר המאפשרת הערכה כמותית של התבגרות מבנית של תאי גזע נגזר cardiomyocytes, כדי לשפר את תנאי התרבות קידום התפתחות הלב.
שיטה זו יכולה לשמש להערכה כמותית של התבגרות סרקומר בקרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSC. באמצעות גישה זו מבוססת רזולוציה סופר, ניתן לזהות אפילו שינויים עדינים בארגון sarcomere, אשר אינו אפשרי עם הדמיה קונפוקל קונבנציונאלי. לפחות שלוש שעות לפני השימוש, להפעיל את המיקרוסקופ ולהביא את המדגם לטמפרטורת החדר.
כאשר המיקרוסקופ מוכן, הוסף 300 מיקרוליטרים של מאגר הדמיית PALM ל הבאר של תאים מסומנים והכנס את שקופית התא למחזיק הבמה של המיקרוסקופ. בחר את המטרה 1.57 NA 100X שמן ולהשתמש במצב PALM בתוכנת ההדמיה ולהפעיל את הגדרות TIRF. הגדר את מספר המסגרות ל- 5, 000 עד 10, 000, את כוח הלייזר של UV ל- 0.1% ואת הלייזר 647 ל- 0.2% ואת רמת הרווח ל- 50 עד 100.
לאחר הגדרת כל פרמטרי הרכישה, הפעל את תאורת הלייזר ובחר תא יעד. כדי להשיג תמונה, הגדל את כוח הלייזר של 647 ל- 100% והפחת את הרווח לאפס. להלבין את תא היעד במשך כחמש שניות, ולאחר מכן להגדיל את הרווח ל 50 וליזום את רכישת תמונת PALM.
לשחזור נתוני PALM, בסוף הרכישה, לפתוח את הנתונים ב ImageJ ולפתוח את תוסף סופת רעמים. בחר ניתוח הפעלה בתוסף ופתח את תפריט הגדרת המצלמה. הזן את גודל הפיקסל ואת הרווח האלקטרומגנטי.
בתפריט ניתוח הריצה, הגדר את סדר ה- B-spline לשלושה, את קנה המידה של B-spline לשניים, את סף עוצמת השיא ל- stfwave. f1, רדיוס ההתאמה לשלוש, הסיגמא הראשוני ל-1.6, ההגדלה לחמש, תדירות העדכון ל-50 והשינויים הצדדיים לשניים, ולחצו על הלחצן 'אשר'. לאחר השחזור, בחרו סיגמא בתפריט היסטוגרמת העלילה ולהשתמש בכלי המלבן לבחירת אזור מעניין, למעט ממצאים אפשריים. הוסף את אזור העניין למסנן והוסף ואי-ודאות הנמוכה מ- 25 לאזור ערכי הריבית.
בכרטיסיה הסרת כפילויות, הזן סף מרחק של 10 ננומטר. בכרטיסיה מיזוג, הגדר את המרחק המרבי ל- 20, את המסגרות המרביות לכל מולקולה לאפס ואת המסגרות המרביות כבויות לאחת. בכרטיסייה תיקון להיסחף, בחר מתאם צולב והגדר את מספר הפחים וההגדלה לחמישה, ולאחר מכן שמור את תמונת PALM הסופית וייצא את הנתונים שלאחר התהליך.
כדי לנתח את אורך הסרקומר, יבא את תמונת PALM המשוחזרת המשוחזרת של עניין ל- ImageJ ולהשתמש בכלי הקו כדי למתוח קו בין מבני הסרקומר שנבחרו בניצב לדיסק Z כדי למדוד את המרחק הקצר ביותר בין תריסי actin. בתפריט הניתוח, בחר פרופיל התוויה והרכוש את האורך בין שתי הפסגות. כדי לנתח את עובי דיסק Z, המר את תמונת PALM המשוחזרת לתמונה במצב שמונה סיביות ופתח את תוסף זיהוי הרכס.
הגדר את רוחב הקו ל- 20, את החדות הגבוהה ל- 230, את החדות הנמוכה ל- 10, את הסיגמא ל- 0.79, את הסף התחתון ל- 25.84 ואת אורך השורה המינימלי ל- 20. בחר רוחב הערכה, הרחב קו והצג תוצאות ולאחר מכן לחץ על אישור ולהשתמש ברוחב הקו הממוצע מטבלת התוצאות לצורך ניתוח נוסף. תאי קרדיומיוציט יילודים שמקורם ב-iPSC מפגינים תבנית אלפא אקטינין דומה עם מבני סרקומרים לא סדירים שאינם מנומקים.
הערכה כמותית מראה כי האורך והעובי של תווי אלפא actinin הם כמעט זהים בין שתי קבוצות של תאים המציין מצב התפתחותי מוקדם של cardiomyocytes נגזר iPSC. לעומת זאת, קרדיומיוציטים בוגרים מציגים רשת סרקומרים רגילה עם אורך סרקומר מעט מוגבר ועובי Z-דיסק מופחת. השוואה של הדמיה קונפוקל קונבנציונלי PALM מגלה שום הבדל משמעותי באורך sarcomere.
עם זאת, עובי עמוק מופחת Z-דיסק מזוהה כאשר קרדיומיוציטים iPSC כפופים הדמיה PALM. רווח ברזולוציה נצפית בעת החלת PALM, הנתמכת על-ידי החלקות העוצמה המתאימות. יש לציין כי מבני סרקומר שנרכשו באמצעות מאגר באיכות נמוכה נראים עבים יותר בהשוואה למבנים שנתפסו בתנאי הדמיה אופטימליים.
חוסר דיוק נתונים זה נובע מהמאפיינים המהבהבים המופחתים של הפלואורופור, וכתוצאה מכך פחות פוטונים שזוהו לכל אירוע לוקליזציה. יתר על כן, דיוק לוקליזציה הוא ירד, הפחתת הרזולוציה הכוללת של תמונת PALM משוחזר. בנוסף, סחף מדגם יכול להשפיע על לוקליזציה מדויקת של מולקולות פלואורסצנטי וכתוצאה מכך תמונות מטושטשות.
כדי לרכוש תמונות PALM נאותה, חשוב מאוד לאפשר שיווי משקל תרמי של מערכת ההדמיה כולה, כדי למנוע סחף מדגם מוגזם במהלך הדמיה. בעקבות הליך זה, מבנים תאיים אחרים כגון המיטוכונדריה ניתן לדמיין על ידי PALM לרכוש פרמטרים נוספים של התבגרות cardiomyocyte.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מחקר זה מתמקד בהתבגרות רשתות סרקומר בתאי שריר לב המופקים מתאי גזע, שהוא קריטי להתפתחות הלב. גישת הדמיה מבוססת על סופר-רזולוציה מוצגת כדי להעריך באופן כמותי את מבנה הסרקומר, ומאפשרת זיהוי שינויים ארגוניים עדינים שלא ניתן לזהות באמצעים קונבנציונליים.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום מחקר
- התבגרות תאי שריר לב
- מודלים תאיים שמקורם בתאי גזע
- מיקרוסקופיה בעלת רזולוציה עליונה
רקע
- היווצרות הסרקומרים חיונית לתפקוד תאי שריר הלב.
- תאי שריר לב המופקים מתאי גזע רב-עוצמיים מראים לעתים קרובות מאפיינים לא בוגרים בהשוואה לתאי שריר לב בוגרים.
- טכניקות הדמיה קיימות עשויות שלא ללכוד באופן אדקווטי פרטים מבניים.
שיטות בשימוש
- נעשה שימוש בטכניקות הדמיה מבוססות סופר-רזולוציה, במיוחד PALM.
- תאי שריר לב המופקים מתאי גזע רב-עוצמיים שימשו כמודל מערכת ביולוגי.
- עיבוד וניתוח תמונות בוצעו באמצעות ImageJ ותוספים שלה.
תוצאות עיקריות
- הדמיה באמצעות PALM חשפה הבדלים מפורטים באורך הסרקומר ועובי הדיסק Z.
- מצב ההתבגרות של תאי שריר לב המופקים מתאי גזע רב-עוצמיים זוהה כמוקדם.
- השוואה עם תאי שריר לב בוגרים הדגימה רשת סרקומרים מובנית.
מסקנות
- מחקר זה מציג את האפקטיביות של הדמיה בעלת רזולוציה עליונה בהערכת התפתחות תאי שריר הלב.
- הממצאים יש להם השלכות משמעותיות לפיתוח תנאי תרבות משופרים ולהערכת בריאות הלב.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of sarcomere organization in iPSC-derived cardiomyocytes is essential for advancing predictive cardiac models in drug discovery and disease modeling. Single molecule localization microscopy enables detection of subtle structural maturation differences, directly impacting the reliability of preclinical cardiac assays. This capability supports translational continuity and de-risks early-stage cardiac target validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of sarcomere maturation as a functional biomarker for cardiomyocyte development.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing premature from mature cardiac phenotypes at nanoscale resolution.
- Improves predictive confidence in iPSC-derived cardiac models for target validation workflows.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of structurally validated cardiomyocyte systems for downstream compound screening.
- Enables reproducible, quantitative measurement of sarcomere length and Z-disc thickness for assay standardization.
- Supports high-resolution imaging outputs that inform assay readiness and platform scalability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural maturity metrics with disease-relevant cardiac phenotypes for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery-stage cellular models to preclinical cardiac validation studies.
- Reduces biological risk by enabling early detection of maturation deficits in engineered cardiac tissues.
Pipeline & Workflow Integration
This super resolution imaging method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing quantitative structural readouts for cardiac model qualification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cardiomyocyte maturation and pathway analysis of sarcomere assembly.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides high-resolution measurements of sarcomere length and Z-disc thickness for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro cardiac model characterization with preclinical biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis workflow for cardiac structural assessment across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac model systems.
- Operational Value: Standardizes imaging protocols and ensures reproducibility of quantitative outputs.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of cardiac assets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cardiac models and translational candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super resolution microscopy and quantitative image analysis.
- Demands access to advanced imaging instrumentation and analytical software (e.g., ImageJ with plugins).
- Necessitates rigorous cross-team standardization of imaging conditions and buffer quality.
- May require adaptation of imaging parameters for different cellular or tissue models.
- Imaging accuracy is sensitive to sample drift, buffer composition, and thermal equilibration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:27
Photoactivated Localization Microscopy (PALM) Image Acquisition Setup
1:27
PALM Image Acquisition
1:50
PALM Data Reconstruction
2:39
Reconstructed PALM Image Post Processing
3:34
Sarcomere Filament Analysis
4:41
Results: Representative Human Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC)-Derived Cardiomyocyte alpha-Actinin Network Analysis
6:23
Conclusion
