Name: יצירת ספריות הכנסה Transposon בחיידקים גראם שלילי עבור רצף בתפוקה גבוהה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: למד ליצור ספריות טרנספוזון רוויות בחיידקים גראם שליליים כמו Acinetobacter baumannii. השיטה מאפשרת זיהוי גנים חיוניים וגורמי עמידות לאנטיביוטיקה לפיתוח טיפולים חדשים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהמכון הלאומי לבריאות (גרנט AI146829 לג'יי.אם.בי) והיא מוכרת בהכרת תודה.

לסופרים אין מה לחשוף.

א. באומאני מהווה איום עולה על בריאות הציבור העולמית בשל הרכישה המהירה של AMR מול טיפולי "השורה האחרונה", כגון colistin10,11,12,,23,24,30,31. בעשורים האחרונים, Tn-seq שיחק תפקיד קריטי בהדרת אינטראקציות גנוטיפ-פנוטיפ על פני מינים חיידקיים רבים והרחבת ההבנה שלנו שלגנט...

הגילוי של אנטיביוטיקה הוא ללא ספק אחד האירועים המשפיעים ביותר הקשורים לבריאות של המאה ה-20. לא רק אנטיביוטיקה במהירות לפתור זיהומים חיידקיים חמורים, הם גם לשחק תפקיד מרכזי ברפואה המודרנית. ניתוחים גדולים, השתלות והתקדמות ברפואת יילודים וכימותרפיה להשאיר חולים רגישים לזיהומים מסכני חיים וטיפולים אלה לא יהיו אפשריים ללאאנטיביוטיקה 1,,2. עם זאת, התפתחות מהירה והתפשטות של עמידות לאנטיביוטיקה בקרב פתוגנים אנושיים הפחיתה באופן משמעותי את היעילות של כל המעמדות החשובים קלינית שלאנטיביוטיקה 3. זיהומים חיידקיים רבים שפעם נוקו בקלות עם טיפול באנטיביוטיקה, כבר לא מגיבים לפרוטוקולי טיפול קלאסיים, גרימת איום רציני על בריאות הציבור העולמי1. עמידות מיקרוביאלית (AMR) היא המקום שבו תאים חיידקיים לגדול בריכוזים קטלניים אחרת של אנטיביוטיקה, ללא קשרלמשך הטיפול 4,5. יש צורך דחוף להבין גורמים מולקולריים וביוכימיים המווסתים AMR, אשר יסייעו להנחות התפתחות מיקרוביאלית חלופית. באופן ספציפי, פתוגנים ESKAPE הם בעייתיים בהגדרות קליניות הקשורים AMR נרחב. אלה כוללים Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella דלקתריאות , Aצ'ינטובקטר באומאני, Pseudomonas aeruginosa ו Enterobacter spp. בעוד מספר מנגנונים לתרום AMR בפתוגנים ESKAPE, ארבעת האורגניזמים האחרונים הם גראם שלילי.
חיידקים גראם שליליים להרכיב קרום חוץ מגדיר שמגן עליהם מפני תנאים סביבתיים קשים. הממברנה החוצה משמשת כמחסום חחלה כדי להגביל את הכניסה של מולקולות רעילות, כגון אנטיביוטיקה, לתוך התא. שלא כמו קרום ביולוגי אחר, הממברנה החוץ היא אסימטרית. העלון הפנימי מועשר בליפופוליסכריד החשוף לפני השטח, ואילו העלון הפנימי הוא תערובת של פוספוליפידים6. מולקולות Lipopolysaccharide מעוגנות קרום החוץ על ידי שומנים שומרים moiety מוטבע בתוך bilayer שומנים7. הליפים הקאנוניים תחום של Escherichia קולי lipopolysaccharide נדרש לצמיחה של רוב חיידקים גראם שלילי והוא מסונתז על ידי מסלול אנזימטי תשעה שלבים כי הוא אחד המסלולים הבסיסיים ביותר וconserved ב אורגניזמים גראםשליליים 6,,7,,8.
פולימיקסין הם פפטידים מיקרוביאליים cationic כי היעד השימנים תחום של lipopolysaccharide כדי לפגוע קרום החוץ ולריס את התא. האינטראקציה האלקטרוסטטית בין שאריות טעונות בחיוב של פולימיקסין לבין שומנים טעונים שלילית קבוצות פוספט לשבש את קרום התא החיידקי בסופו של דבר מוביל למוות תא,9,10,,11,12,,13. Colistin (polymyxin E) הוא מיקרוביאלית המוצא האחרון המשמש לטיפול בזיהומים הנגרמת על ידי פתוגנים נוסוקומיים עמידים multidrug, כגון Acinetobacter baumannii14,15,16. התגלה לראשונה בשנת 1947, polymyxins מיוצרים על ידי חיידקי הקרקע, Paenibacillus polymyxa17,18,19. פולימיקסין נקבעו לטיפול בזיהומים גראם שליליים במשך שנים לפני השימוש הקליני שלהם היה מוגבל בשל דיווחים של nephro משמעותית- ו neurotoxicity20,,21.
א. באומני הוא פתוגן גראם-שלילי נוסוקומלי שהגביר באופן דרמטי את התמלומות והתמותה של תוצאות המטופל בעשוריםהאחרונים 22. מה שנחשב בעבר פתוגן בסיכון נמוך, מהווה כעת סיכון משמעותי לזיהום שנרכש על ידי בית החולים ברחבי העולם בשל יכולתו המדהימה לרכוש AMR וסיכון גבוהלמגפה 23,24. א. באומאני מהווה יותר מ-10% מהזיהומים הנוזוקומיים בארה"ב. מחלה באה לידי ביטוי כמו דלקת ריאות, בקטרימיה, דלקת בדרכי השתן, עור ודלקות רקמות רכות, דלקת קרום המוח, ודלקת פניםהלב 25. אפשרויות הטיפול בזיהומים A. baumannii הצטמצמו בשל התנגדות נגד כמעט כל מחלקות אנטיביוטיקה, כולל β-לקטמס, fluoroquinolones, טטרציקלין, ו aminoglycosides23,24. השכיחות של עמידים multidrug, עמידים באופן נרחב תרופות ופאן-תרופות עמידים A. baumannii מבודד הוביל לתחייה בטיפול colistin, אשר נחשב לאחת האפשרויות הטיפוליות הבודדות שנותרו עדיין יעיל נגד multidrug עמידים A. baumannii. עם זאת, ההתנגדות הגוברת לקוליסטין בקרב מבודדים באומאני הגבירה עוד יותר את האיום שלה על בריאות הציבורהעולמית 10,11,12,13,,27,,30,31.,
ההתפתחויות האחרונות בטכנולוגיות רצף תפוקה גבוהה, כגון רצף transposon (Tn-seq), סיפקו כלים חשובים כדי לקדם את ההבנה שלנו של כושר חיידקי במבחנה ו- vivo. Tn-seq הוא כלי רב עוצמה שניתן למנף כדי ללמוד אינטראקציות גנוטיפ-פנוטיפ בחיידקים. Tn-seq ישימה באופן נרחב על פני פתוגנים חיידקיים, שם היא משלבת מוטאגנזה טרנספוסון מסורתית עם רצף מקביל מסיבי כדי למפות במהירות אתרי הכנסה, אשר ניתן להשתמש כדי לקשר מוטציות DNA לגרסאות פנוטיפיות בקנה מידה רחב גנומי32,33,34,35. בעוד שיטות mutagenesis transposon תוארו בעבר, השלבים הכלליים דומים33. ראשית, ספריית הכנסה נוצרת באמצעות מוטאגנזה transposon, שבו כל תא חיידקי בתוך אוכלוסייה מוגבלת חדף transposon החדרה בתוך ה-DNA הגנומי (gDNA). בעקבות מוטגנזה, מוטנטים בודדים הם מאגר. gDNA מופק מבריכת מוטציה הכניסה וצמתים transposon מוגברים ונותנים לתפוקה גבוהה רצף. הקריאה מייצגת אתרי הכנסה, שניתן למפה לגנום. הוספות טרנספוסון המפחיתות את הכושר נופלות במהירות מהאוכלוסייה, בעוד הוספות מועילות מועשרות. Tn-seq כבר אינסטרומנטלי כדי לקדם את ההבנה שלנו של איך גנים להשפיע על כושר חיידקי בלחץ33.
מערכת הטרנס פוסון הימית Himar1 המקודדת ב- pJNW684 נבנתה ומוטבה במיוחד למטרת מוטאגנזה טרנספוסון. הוא כולל טרנספוסוןימי-משפחה המאגף את גן ההתנגדות kanamycin, אשר משמש לבחירה של מוטציות החדרת transposon ב A. baumannii. הוא גם מקודד יזם ספציפי A. baumannii שמניע ביטוי של גן קידוד transposase36. הטרנספוןמבוסס הימאים מכיל גם שני מחסלים תרגום במורד הזרם של גן התנגדות kanamycin, אשר מונע קריאה במורד הזרם שלהכניסה 37. pJNW684 נושא גם RP4/oriT/oriR6K-מותנה מקור של שכפול אשר דורש את הגן ωpir תרם על ידי זןהתורם לשכפל 38. בהיעדר הגן, וקטור pJNW684 הנושא את מכונות הטרנספוזיציה לא יוכל לשכפל במקבל A. baumannii זן 10,36,38. לכן, במהלך התייחדות חיידקים, רק transposon מוכנס לתוך הגנום הנמען ללא החדרת רקע של פלסמיד, אשר נושא את הגן transposase. הדבר משמעותי משום שהאובדן של פעילות הטרנספוז יחד עם הפלסמיד גורם לאירוע טרנספוזיציה יחיד ויציב שמונע מהטרנספוסון לעבור למיקומים שונים ברגע שהוא מוסיף לגנום הנמען.
pJNW648 נבדק גם לפעילות באורגניזם גרם שלילי אחר, E. coli. הרכבה מוצלחת של ספריית Tn-seq רוויה בזן E. coli W3110 הצביע על המערכת היא נוחה לבצע mutagenesis במגוון רחב של פתוגנים, כולל Enterobacteriaceae. יתר על כן, היזם הספציפי A. baumannii שמניע ביטוי transposase יכול להיות מוחלף במהירות עם יזם ספציפי למין. לבסוף, הגן התנגדות kanamycin ניתן להחליף קלטות התנגדות אחרות, בהתאם פנוטיפ AMR של האורגניזם נחקר.
גורם אחד שתורם להתנגדות קוליסטין ב- Baumannii הוא ניהול של מינונים לא מספיקים, שבו חיידקים נחשפים ללחץ סלקטיבי ברמות לאקטלניות 39. מספר דיווחים הראו כי ריכוזים מיקרוביאליים תת-נפחיים יכולים לגרום לתגובות מוסדרות שמשנות את הפיזיולוגיה של התא כדי להפחית את הרגישות של כל אוכלוסייתהחיידקים 11,12,30,31. באמצעות Tn-seq, גילינו גורמים המסדירים את התנגדות קוליסטין ב A. baumannii זן ATCC 17978 לאחרחשיפה מעכב 10 וריכוזים subinhibitory של קוליסטין. דוגמה זו מפרטת שיטת Tn-seq המייעלת את הבנייה וההעשרה של ספריית מוטציה רוויה הטרנספוסון באמצעות משפחת הטרנספוסון40,41. בעוד מספר פרוטוקולי Tn-seq מייצרים 20,000 - 100,000 מוטנטים35,42,43,44,45,46, הפרוטוקול המתואר בזאת יכול ליצור במהירות ספריית transposon של 400,000 + מוטנטים, אשר בערך משווה להחדרת transposon כל 10 זוגות בסיסים ב A. baumannii10. יתר על כן, ניתן לשנות את גודל הספרייה ללא מאמץ נוסף משמעותי. שיטה זו גם מבטלת את הדרישה למגבלות אנדונו-ליאות, קשירה של מתאם וטיהור ג'ל, מה שיכול להפחית את הגיוון הסופי בספרייה.

<table><tbody><tr><td>10 מ"מ ddCTP, 2',3'-Dideoxycytidine-5'-Triphosphate</td><td>Affymetrix</td><td>77112</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ dCTP 2'-Deoxycytidine-5'-Triphosphate</td><td>Invitrogen</td><td>10217-016</td><td></td></tr><tr><td>100bp DNA סולם סמן משקל מולקולרי</td><td>Promega</td><td>PR-G2101</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ x 15 מ"מ צלחות פטרי</td><td>קורנינג</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>150 מ"מ x 15 מ"מ צלחות פטרי</td><td>קורנינג</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>1X B& W</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>דילול 2X B& W בחצי כדי לקבל 1X שחור-לבן.</td></tr><tr><td>2,6-חומצה דיאמינופימלית</td><td>Alfa Aesar</td><td>B2239103</td><td>בשימוש ב-600 ומיקרו; M</td></tr><tr><td>2X B& W</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>הוסף 2 M NaCl, 10 מ"מ Tris-HCl, 1 מ"מ EDTA (pH 7.5) במים. משמש עם חרוזי סטרפטווידין. התמיסות נשמרות בטמפרטורת החדר.</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות צנטריפוגה סטריליים מפוליפרופילן חרוטי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-565-271</td><td></td></tr><tr><td>9.5 מ"מ dCTP/0.5 מ"מ ddCTP</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>9.5 מ"ל 100 מ"מ dCTP; 5 מ"ל 10 מ"מ ddCTP; 85.5 מ"ל מים. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>12344</td><td></td></tr><tr><td>Acinetobacter baumannii ATCC 17978</td><td>ATCC</td><td>N/A</td><td>AmpS, KanS</td></tr><tr><td>Ampicillin (100 מ"ג/ליטר)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td>בשימוש ב-100 מ"ג/ליטר</td></tr><tr><td>מערכת טיהור PCR BECKMAN</td><td>COULTER</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2939B</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer ניתוח DNA ברגישות גבוהה</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>תערובת תמיסת דאוקסינוקלאוטיד (dNTP)</td> <td>ניו אינגלנד ביולאבס (NEB)</td> <td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 מתלה מגנטי</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>E.coli MFD Dap-N</td><td>/A</td><td>N/A</td><td>DAP Auxotroph, דורש 600 מ"מ בתוספת אקסוגנית DAP כדי לגדול. מכיל מכונות RP4 להעברת פלסמיד. מנשא ל-JNW68 (36).</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקונים קריוגניים עם הברגה חיצונית</td><td>קורנינג</td><td>09-761-71</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית</td><td>קורנינג</td><td>72684</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>G33</td><td></td></tr><tr><td>לולאות חיסון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-363-602</td><td>כלי גירוד</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906</td><td>בשימוש באגר של 25 מ"ג/ליטר</td></tr><tr><td>LB, מרק Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425</td><td></td></tr><tr><td>LB, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>LoTE</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>הוסף 3 מ"מ Tris-HCl, 0.2 מ"מ EDTA (pH 7.5) במים. משמש עם חרוזי סטרפטווידין. התמיסות נשמרות בטמפרטורת החדר.</td></tr><tr><td>מאגר ליזה</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>9.34 מ"ל TE buffer; 600 מ"ל של 10% SDS; 60 מ"ל של פרוטאינאז K (20 מ"ג/מ"ל)</td></tr> <tr><td>פנול/כלורופורם/איזואמיל אלכוהול (תערובת 25:24:1, pH 6.7/8.0, Liq.)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1752I</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח, 10X פתרון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP39920</td><td>מדולל ל 1X</td></tr><tr><td>קיוביט 4 פלואורומטר</td><td>תרמו פישר</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>צינורות בדיקת קיוביט</td><td>תרמו פישר</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>קיוביט dsDNA HS ערכת בדיקה</td><td>תרמו פישר</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>סוניקטור עם מקרר אמבט מים</td><td>Qsonica Sonicators</td><td>Q2000FCE</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטווידין חרוזים מגנטיים</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס (NEB)</td><td>S1420S</td><td></td></tr><tr><td>מאגר TE</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>10 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0); 1 מ"מ EDTA (pH 8.0)</td></tr><tr><td>טרמינל דאוקסינוקלאוטידיל טרנספראז (rTdt)</td><td>Promega</td><td>PR-M1875</td><td></td></tr></tbody></table>

יצירת ספריות הכנסה transposon בחיידקים גראם שלילי עבור רצף בתפוקה גבוהה

Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing

רצף Transposon (Tn-seq) היא שיטה רבת עוצמה המשלבת מוטאגנזה טרנספוסון ו רצף מקבילי מסיבי כדי לזהות גנים ומסלולים התורמים לכושר חיידקי במגוון רחב של תנאים סביבתיים. יישומי Tn-seq הם נרחבים ולא רק אפשרו בדיקה של יחסי גנוטיפ-פנוטיפ ברמת אורגניזם, אלא גם ברמות האוכלוסייה, הקהילה והמערכות. חיידקים גראם שלילי קשורים מאוד עם פנוטיפים עמידות מיקרוביאלית, אשר גדל תקריות של כשל טיפול אנטיביוטי. עמידות מיקרוביאלית מוגדרת כצמיחה חיידקית בנוכחות אנטיביוטיקה קטלנית אחרת. הקוליסטן מיקרוביאלי "השורה האחרונה" משמש לטיפול בזיהומים חיידקיים גראם שלילי. עם זאת, מספר פתוגנים גראם שליליים, כולל Acinetobacter baumannii יכול לפתח התנגדות קוליסטין באמצעות מגוון רחב של מנגנונים מולקולריים, שחלקם אופיין באמצעות Tn-seq. יתר על כן, נתיבי טרנס-תמרת אותות המווסתים את ההתנגדות קוליסטין להשתנות בתוך חיידקים גראם שלילי. כאן אנו מציעים שיטה יעילה של מוטאגנזה transposon ב- Baumannii מייעל הדור של ספריית הכנסה transposon רווי ובניית ספריית אמפיקון על ידי ביטול הצורך אנזימי הגבלה, קשירה מתאם, וטיהור ג'ל. השיטות המתוארות בזאת יאפשרו ניתוח מעמיק של גורמים מכריעים מולקולריים התורמים לכושר של א. באומאני כאשר הם מאותגרים עם קוליסטין. הפרוטוקול ישים גם פתוגנים אחרים ESKAPE גראם שלילי, אשר קשורים בעיקר עם זיהומים עמידים לתרופות שנרכשו על ידי בית החולים.

השיטות המתוארות מתארות את הדור של ספריית טרנספוסון בצפיפות גבוהה ב- A. baumannii זן ATCC 17978 באמצעות התייחדות חיידקים באמצעות E. coli MFD DAP- ,אשר משכפל את pJNW684 plasmid (איור 4B). הפרוטוקול המפורט משתמש בהתייחדות חיידקים דו-הורית להעברת pJNW684 מהזן E. coli ρpiir+ תורם לזן מקבל A. baumannii. זוהי שיטה יעילה וזולת ליצירת ספריות מוטנטיות טרמפוסון צפופות. חיידקים היו מעורבים ביחסים אופטימיזציה והזדווגות זוהו על צלחות agar לוריה-Ber...

אנו מתארים שיטה ליצירת ספריות מוטציה טרנספוסון רוויבחיידקים גראם שלילי והכנה לאחר מכן של ספריות amplicon DNA להמשך תפוקה גבוהה. כדוגמה, אנו מתמקדים בפתוגן ESKAPE, Acinetobacter baumannii, אבל פרוטוקול זה הוא נוח למגוון רחב של אורגניזמים גראם שלילי.

יצירת ספריות הכנסה Transposon בחיידקים גראם שלילי עבור רצף בתפוקה גבוהה

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways ...

שיטה זו היא משמעותית כי זה יכול לשמש מינים חיידקיים מגוונים כדי לזהות גנים חיוניים, גנים עמידות לאנטיביוטיקה וגנים חשובים כושר vivo במהלך זיהום. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שיתוף מכני של DNA גנומי ומהדורת Poly-CTL, אשר מבטלים את הצורך באנזימי הגבלה יקרים, קרינת מתאם וטיהור ג'ל. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב את הטיפול של זיהומים חיידקיים בעייתיים, כי גנים שזוהו חשובים לזיהום או עמידות לאנטיביוטיקה, יכול לשמש מטרות עבור טיפולים אנטי מיקרוביאליים הרומן.שיטה זו יכולה לספק תובנה על גנוטיפ מורכב, יחסי פנוטיפ על פני מינים חיידקיים גרם שלילי וגרם חיובי, ולשפר את ההבנה הנוכחית שלנו של גנטיקה חיידקית. כדי להתחיל, להעביר תרבויות לילה 50 צינורות חרוט מיליליטר, ו גלולה הן הנמען ותורם תרבויות באמצעות צנטריפוגה ב 5, 000 פעמים G במשך 7 דקות. השלך את העל-טבעי.השתמש פיפטה סרולוגית 10 מיליליטר כדי להשעות מחדש את גלולת זן התורם ב 4.5 מיליליטר של LB בתוספת חומצה דיאמינופימילית. העבר את זן התורם המושעה מחדש לצינור המתח של המטופל. ומיד להפיץ את ההזדווגות השעיה כמו בודדים 100 טיפות microliter על צלחות אגר LB, בתוספת חומצה דימינופימילית דגירה הצלחות בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.לאחר מכן, בזהירות להעביר את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס אינקובטור ולאפשר את התרבויות להזדווג במשך שעה אחת. לאחר הדגירה להוסיף 1.5 מיליליטר של LB על כל צלחת לקצור את החיידקים לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר. גלולה התאים המוגמים באמצעות צנטריפוגה ב 5, 000 פעמים G במשך שבע דקות.לאחר מכן, להשליך את supernatant ולהשעות מחדש את התאים ב 10 מיליליטר של LB, כדי להסיר חומצה diaminopimelic שיורית Pellet התאים שוב, ולחזור על לשטוף עם LB. כאשר סיים להשתמש פיפטה סרולוגית 10 מיליליטר כדי להשעות מחדש את גלולה ב 10 מיליליטר של LB, בתוספת 25% גליצרול. מורחים את התאים על לוחות, לפי הוראות כתב היד. לאחר מכן, הדגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס, לילה.צור מיליליטר אחד aliquots של החיידקים הנותרים ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. יוצקים אליקוט של ההזדווגות הקפואה על קרח. לאחר מכן, השתמש גם בחרוזי זכוכית סטריליים כדי להפיץ 150 מיקרוליטרים של הדילול, על כל 30 על 150 מילימטר צלחת אגר לוריא-ברטאני, בתוספת Kanamycin.יש להשליך את הצינור המשמש המכיל הזדווגות עודפת, צלחות דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 14 שעות. לאחר הדגירה לספור את המושבה להרכיב יחידות על כל צלחת כדי להעריך את המוטנטים הכולל בספריית טרנספוזון. לספור 20% של לפחות שלושה לוחות כדי לקבוע את הערכת ספירת המושבה עבור כל הקבוצה של לוחות.לאחר חישוב התשואה המשוערת של המושבה, הוסיפו 3-5 מיליליטר של LB לכל צלחת, וגרדו את החיידקים באמצעות כלי גירוד סטרילי. משוך מתלים חיידקיים מכל הצלחות לתוך צינורות חרוט 50 מיליליטר, ו גלולה המתלים על ידי צנטריפוגה ב 5, 000 פעמים G, במשך שבע דקות. השליכו את העל-טבעי והשעו מחדש את גלולת הכדור בחמישה מיליליטר של LB, בתוספת 30%גליצרול.לאחר מכן, לעשות aliquots מיליליטר של ספריית טרנספוזון cryovials ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. לדלל את gDNA עם מאגר TE לריכוז של 250 ננוגרם למיקרוליטר, בנפח כולל של 200 microliters, ולמקום אותו sonicator אמבט מים. Sonicate ה-DNA להניב שברים של כ 300 נוקלאוטידים.ודא כי ה-DNA הוא לגנוז על ידי הפעלת 10 microliters של DNA unsheared ו 10 microliters של DNA לגוזל, על 1% חזיר צלוי ג'ל. חזור על sonication, במידת הצורך. כדי להוסיף את זנב הזרע פולי לקצה השלישי של הדנ"א, הגדר את תגובת המדיניות כמתואר בכתב היד של הטקסט והדגירה את צינורות התגובה במשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.כדי לטהר את תגובת המדיניות, הוסיפו 40 מיקרוליטרים של חרוזים פרמגנטיים לבחירת גודל לכל מדגם ומערבולת את צינור התגובה. דגימות דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, לזמן קצר צנטריפוגה אותם כדי לאסוף את הנוזל בתחתית הצינור.מעבירים את הצינורות למדף מגנטי ומדרגרים אותם בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות או עד שהפתרון מתבהר. מוציאים בזהירות את העל-טבעי ומוסיפים 200 מיקרוליטרים של אתנול טרי, 80%, מבלי להפריע לחרוזים. דגירה הדגימות עד הפתרון ברור.ואז להסיר את העל טבעי ולחזור על לשטוף אתנול. בקצרה צנטריפוגה הצינורות ולשים אותם בחזרה במתלה המגנטי, כדי להסיר את כל הנוזלים שנותרו. דגירה הדגימות בטמפרטורת החדר, במשך שתיים עד חמש דקות, כדי לאפשר להם להתייבש.ומוסיפים 25 מיקרוליטרים של מים לכל צינור. Vortex אותם במשך כחמש שניות או פיפטה למעלה ולמטה. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינורות כדי לאסוף נוזל בתחתית.מעבירים את הצינורות למדף המגנטי ונותנים להם לשבת כשתי דקות עד שהפתרון ברור. לאחר מכן, להעביר את supernatant לצינור חדש מבלי להפריע את חרוזים. פרוטוקול זה שימש ליצירת ספריית טרנספוזון בצפיפות גבוהה בזן A-baumannii ATCC 17978, באמצעות נדידה חיידקית באמצעות E-coli MFD DAP auxotroph, אשר משכפל את פלסמיד pJNW684.ספריית המוטנטים של טרנספוסון A-baumannii משכה שימשה לזיהוי גורמי כושר, חשובים להתנגדות קוליסטין תחת ריכוזים תת-מעכבים של האנטי מיקרוביאלית. לאחר דלדול ספריית המוטנטים של גנים התורמים להתנגדות קוליסטין, gDNA הכולל של המשיכה הספרייה הנותרת היה מבודד משליטה ותרבויות ניסיוניות. ה- gDNA היה מקוטע עם גיזום מכני וזנב מדיניות נוסף שברי ה- DNA כהכנה לתהפוך.ריכוזי הדנ"א חושבו והדגימות נותחו באמצעות אלקטרופורזה נימית מבוססת שבב, כדי לאשר בניית ספרייה מוצלחת. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא להתאים את נפח ההזדווגות, בהתבסס על ספירת CFU עבור זנים היעד ספציפי כדי ליצור ספריית מוטנטים ברזולוציה גבוהה. בנוסף, זן המטופל חייב להיות רגיש לסמן עמידות לאנטיביוטיקה, באמצעות טרנספוזון לפני mutagenesis.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע מחיקת גנים או שיטת אמירה קולית כדי לדפוק ראשים בודדים להשיג מתוצאות רצף ולאמת גנים של עניין בתנאים מאותגרים.

generating-transposon-insertion-libraries-gram-negative-bacteria-for

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: Kazi, M. I., et. al., יצירת ספריות החדרת טרנספוזונים בחיידקים גראם-שליליים לריצוף תפוקה גבוהה. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים את הבחירה, הכימות והשימור של חיידקים נמענים גראם-שליליים הנושאים החדרות טרנספוזונים על סמך עמידות לקנמיצין.

בידוד של חיידקים גראם-שליליים עם החדרת טרנספוזון גנומי

sp Enterobacter. YSU גדל במדיום מלחים מינימאליים של גלוקוז. Auxotrophs מופקים על ידי הפיכתה עם transposome שמכניס את עצמו באופן אקראי לגנום המארח. מוטציות נמצאות על ידי ציפוי העתק מבינוני מורכבת עד בינוני מינימאלי. גנים נקטעו מזוהים על ידי הצלת גן ורצף.

דור של Enterobacter Sp. YSU Auxotrophs שימוש transposon mutagenesis

כתב יד זה מתאר גישה אוטומטית לבחירת גודל ג'ל לטיהור מקטעי DNA לריצוף הדור הבא. טכנולוגיית הריינג'ר מספקת אוטומציה מלאה של כל תהליך העמסת ג'ל אגרוז, ניתוח אלקטרופורטי ושחזור של שברי DNA ממוקדים המאפשרים ספריות ריצוף מהדור הבא בתפוקה גבוהה ובאיכות גבוהה.

בחירת גודל האוטומטי ג&#39;ל כדי לשפר את האיכות של ספריות רצף הדור הבא הוכן מדגימות סביבתיות מים

. כאן, עוצמת הכניסה אקראי בתיווך transposon של רכיב ה-DNA ללא קידוד שימש כדי לפתור את מעמדה כרומוזומלית אופטימלית.

קביעת Location(s) כרומוזומלית האופטימלית עבור רכיב ה-DNA ב- Escherichia coli באמצעות גישה מוזרה בתיווך Transposon

המובאת כאן היא שיטה פשוטה ליצירת ספריית ההכנסה transposon בצפיפות גבוהה ב- Escherichia coli או שיגלה flexneri באמצעות קוניוגציה. פרוטוקול זה מאפשר היצירה של אוסף של מאות אלפי מוטציות ייחודיות של חיידקים על ידי החדרת גנומית אקראי transposon.

יצירה של צפוף Transposon ההכנסה הספרייה באמצעות קוניוגציה Enterobacterial זנים כגון Escherichia Coli או שיגלה flexneri

שיטות ליצירת ספריות gRNA בקנה מידה גדול צריך להיות פשוט, יעיל וחסכוני. אנו מתארים פרוטוקול לייצור של ספריות gRNA מבוסס על עיכול אנזימטי של יעד ה-DNA. שיטה זו, CORALINA (ספריית gRNA מקיף הדור באמצעות פעילות נוקלאז מבוקר) מציג אלטרנטיבה סינתזה יקר oligonucleotide מותאם אישית.

פרוטוקול אוניברסלי עבור gRNA בקנה מידה גדול ספריית הפקה מכל מקור ה-DNA

נתאר כאן טכניקה המשלבת מוטגנזה מכוונת transposon עם תפוקה גבוהה רצף כדי לזהות ולכמת transposon מוטציות leptospiral ברקמות לאחר אתגר של אוגרים. פרוטוקול זה יכול לשמש המוטנטים מסך עבור הישרדות והפצה בבעלי חיים, ניתן להחיל גם על מחקרים במבחנה .

רצף מקביל בתפוקה גבוהה כדי כושר מדד לזיהום Leptospira interrogans Transposon ההכנסה מוטציות במהלך הזהב הסורי אוגר

באמצעות pBIBAC-GW וקטור בינארי הופך ייצור הטרנסגניים צמחים עם הוספות עותק יחיד ללא פגע, תהליך קל ופשוט. . הנה, סדרה של פרוטוקולים מוצג מדריך את הקורא לאורך התהליך הטרנסגניים תודרנית מפעלים לייצור, ובדיקות את הצמחים על intactness, להעתיק מספר התוספות.

ייצור הטרנסגניים צמחים עם הוספות עותק יחיד באמצעות וקטור בינארי BIBAC-ג'י

השפעה הדדית באמצעות רצף (RH-seq) היא שיטה חדשה ורבת עוצמה למפות את הבסיס הגנטי של הבדל תכונה בין מינים. בריכות המייזוליטיס נוצרות על ידי הטרנספורזיס והכושר שלהם מתבצע באמצעות הצמיחה התחרותית באמצעות רצף ברמה גבוהה. ניתוח הנתונים הנובעים מנקודות גנים שבבסיס התכונה.

מיפוי גנטי של הבדלי התרמוסבילות בין מינים של שמרים באמצעות הגנום ההופכי לניתוח המייזוליסיטי

זוהי שיטה מותאמת לזיהוי גורמי קולוניזציה חרקים מועמדים בסימביונט מועיל Burkholderia. מארח חיפושית נגוע בספריית מוטציות אקראית שנוצרת באמצעות mutagenesis טרנספוסון, ומורכבות הספרייה לאחר קולוניזציה מושוות לשליטה גדל במבחנה.

רצף הכנסה טרנספוסון ככלי להבהב גורמי קולוניזציה חיידקיים בבורקהולדריה גלדיולי סימביונט של לגריה וילוסה בילס

למד ליצור ספריות טרנספוזון רוויות בחיידקים גראם שליליים כמו Acinetobacter baumannii. השיטה מאפשרת זיהוי גנים חיוניים וגורמי עמידות לאנטיביוטיקה לפיתוח טיפולים חדשים.

יצירת ספריות הכנסה Transposon בחיידקים גראם שלילי עבור רצף בתפוקה גבוהה

גלה סרטונים נוספים