יצירת ספריות הכנסה Transposon בחיידקים גראם שלילי עבור רצף בתפוקה גבוהה

שיטה זו היא משמעותית כי זה יכול לשמש מינים חיידקיים מגוונים כדי לזהות גנים חיוניים, גנים עמידות לאנטיביוטיקה וגנים חשובים כושר vivo במהלך זיהום. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שיתוף מכני של DNA גנומי ומהדורת Poly-CTL, אשר מבטלים את הצורך באנזימי הגבלה יקרים, קרינת מתאם וטיהור ג'ל. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב את הטיפול של זיהומים חיידקיים בעייתיים, כי גנים שזוהו חשובים לזיהום או עמידות לאנטיביוטיקה, יכול לשמש מטרות עבור טיפולים אנטי מיקרוביאליים הרומן.

שיטה זו יכולה לספק תובנה על גנוטיפ מורכב, יחסי פנוטיפ על פני מינים חיידקיים גרם שלילי וגרם חיובי, ולשפר את ההבנה הנוכחית שלנו של גנטיקה חיידקית. כדי להתחיל, להעביר תרבויות לילה 50 צינורות חרוט מיליליטר, ו גלולה הן הנמען ותורם תרבויות באמצעות צנטריפוגה ב 5, 000 פעמים G במשך 7 דקות. השלך את העל-טבעי.

השתמש פיפטה סרולוגית 10 מיליליטר כדי להשעות מחדש את גלולת זן התורם ב 4.5 מיליליטר של LB בתוספת חומצה דיאמינופימילית. העבר את זן התורם המושעה מחדש לצינור המתח של המטופל. ומיד להפיץ את ההזדווגות השעיה כמו בודדים 100 טיפות microliter על צלחות אגר LB, בתוספת חומצה דימינופימילית דגירה הצלחות בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.

לאחר מכן, בזהירות להעביר את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס אינקובטור ולאפשר את התרבויות להזדווג במשך שעה אחת. לאחר הדגירה להוסיף 1.5 מיליליטר של LB על כל צלחת לקצור את החיידקים לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר. גלולה התאים המוגמים באמצעות צנטריפוגה ב 5, 000 פעמים G במשך שבע דקות.

לאחר מכן, להשליך את supernatant ולהשעות מחדש את התאים ב 10 מיליליטר של LB, כדי להסיר חומצה diaminopimelic שיורית Pellet התאים שוב, ולחזור על לשטוף עם LB. כאשר סיים להשתמש פיפטה סרולוגית 10 מיליליטר כדי להשעות מחדש את גלולה ב 10 מיליליטר של LB, בתוספת 25% גליצרול. מורחים את התאים על לוחות, לפי הוראות כתב היד. לאחר מכן, הדגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס, לילה.

צור מיליליטר אחד aliquots של החיידקים הנותרים ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. יוצקים אליקוט של ההזדווגות הקפואה על קרח. לאחר מכן, השתמש גם בחרוזי זכוכית סטריליים כדי להפיץ 150 מיקרוליטרים של הדילול, על כל 30 על 150 מילימטר צלחת אגר לוריא-ברטאני, בתוספת Kanamycin.

יש להשליך את הצינור המשמש המכיל הזדווגות עודפת, צלחות דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 14 שעות. לאחר הדגירה לספור את המושבה להרכיב יחידות על כל צלחת כדי להעריך את המוטנטים הכולל בספריית טרנספוזון. לספור 20% של לפחות שלושה לוחות כדי לקבוע את הערכת ספירת המושבה עבור כל הקבוצה של לוחות.

לאחר חישוב התשואה המשוערת של המושבה, הוסיפו 3-5 מיליליטר של LB לכל צלחת, וגרדו את החיידקים באמצעות כלי גירוד סטרילי. משוך מתלים חיידקיים מכל הצלחות לתוך צינורות חרוט 50 מיליליטר, ו גלולה המתלים על ידי צנטריפוגה ב 5, 000 פעמים G, במשך שבע דקות. השליכו את העל-טבעי והשעו מחדש את גלולת הכדור בחמישה מיליליטר של LB, בתוספת 30%גליצרול.

לאחר מכן, לעשות aliquots מיליליטר של ספריית טרנספוזון cryovials ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. לדלל את gDNA עם מאגר TE לריכוז של 250 ננוגרם למיקרוליטר, בנפח כולל של 200 microliters, ולמקום אותו sonicator אמבט מים. Sonicate ה-DNA להניב שברים של כ 300 נוקלאוטידים.

ודא כי ה-DNA הוא לגנוז על ידי הפעלת 10 microliters של DNA unsheared ו 10 microliters של DNA לגוזל, על 1% חזיר צלוי ג'ל. חזור על sonication, במידת הצורך. כדי להוסיף את זנב הזרע פולי לקצה השלישי של הדנ"א, הגדר את תגובת המדיניות כמתואר בכתב היד של הטקסט והדגירה את צינורות התגובה במשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.

כדי לטהר את תגובת המדיניות, הוסיפו 40 מיקרוליטרים של חרוזים פרמגנטיים לבחירת גודל לכל מדגם ומערבולת את צינור התגובה. דגימות דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, לזמן קצר צנטריפוגה אותם כדי לאסוף את הנוזל בתחתית הצינור.

מעבירים את הצינורות למדף מגנטי ומדרגרים אותם בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות או עד שהפתרון מתבהר. מוציאים בזהירות את העל-טבעי ומוסיפים 200 מיקרוליטרים של אתנול טרי, 80%, מבלי להפריע לחרוזים. דגירה הדגימות עד הפתרון ברור.

ואז להסיר את העל טבעי ולחזור על לשטוף אתנול. בקצרה צנטריפוגה הצינורות ולשים אותם בחזרה במתלה המגנטי, כדי להסיר את כל הנוזלים שנותרו. דגירה הדגימות בטמפרטורת החדר, במשך שתיים עד חמש דקות, כדי לאפשר להם להתייבש.

ומוסיפים 25 מיקרוליטרים של מים לכל צינור. Vortex אותם במשך כחמש שניות או פיפטה למעלה ולמטה. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינורות כדי לאסוף נוזל בתחתית.

מעבירים את הצינורות למדף המגנטי ונותנים להם לשבת כשתי דקות עד שהפתרון ברור. לאחר מכן, להעביר את supernatant לצינור חדש מבלי להפריע את חרוזים. פרוטוקול זה שימש ליצירת ספריית טרנספוזון בצפיפות גבוהה בזן A-baumannii ATCC 17978, באמצעות נדידה חיידקית באמצעות E-coli MFD DAP auxotroph, אשר משכפל את פלסמיד pJNW684.

ספריית המוטנטים של טרנספוסון A-baumannii משכה שימשה לזיהוי גורמי כושר, חשובים להתנגדות קוליסטין תחת ריכוזים תת-מעכבים של האנטי מיקרוביאלית. לאחר דלדול ספריית המוטנטים של גנים התורמים להתנגדות קוליסטין, gDNA הכולל של המשיכה הספרייה הנותרת היה מבודד משליטה ותרבויות ניסיוניות. ה- gDNA היה מקוטע עם גיזום מכני וזנב מדיניות נוסף שברי ה- DNA כהכנה לתהפוך.

ריכוזי הדנ"א חושבו והדגימות נותחו באמצעות אלקטרופורזה נימית מבוססת שבב, כדי לאשר בניית ספרייה מוצלחת. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא להתאים את נפח ההזדווגות, בהתבסס על ספירת CFU עבור זנים היעד ספציפי כדי ליצור ספריית מוטנטים ברזולוציה גבוהה. בנוסף, זן המטופל חייב להיות רגיש לסמן עמידות לאנטיביוטיקה, באמצעות טרנספוזון לפני mutagenesis.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע מחיקת גנים או שיטת אמירה קולית כדי לדפוק ראשים בודדים להשיג מתוצאות רצף ולאמת גנים של עניין בתנאים מאותגרים.