הליך ChIP-Seq חצי-אטומי למחקרים אפיגנטיים בקנה מידה גדול

פרוטוקול זה משמעותי בכך שהוא מאפשר ניתוח ChIP-Seq בתפוקה גבוהה של דגימות ראשוניות כדי להבין טוב יותר את מנגנוני הרגולציה של סיס, ואת השלכותיו על מחלות. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם יכולת השחזור של הנתונים, והפחתה דרסטית של זמן המעבדה המעשי. לגזירת כרומטין, הוסף 70 מיקרוליטר של מאגר ליזה טרי, בטמפרטורת החדר, לגלולת תאים מקובעת בגליצין, קפואה ומופשרת מעניינת, לדגירה של דקה בטמפרטורת החדר, ואחריה דקה אחת של השעיה מחדש ללא בועות.

דגרו את הדגימה למשך דקה נוספת בטמפרטורת החדר, לפני הנחת התאים על קרח. העבירו את הגלולה המרחפת לתוך צינור קשירה נמוך של 0.65 מיליליטר על קרח, לפני העמסת הצינור על מחזיק הצינור של סוניקטור. מלאו את כל הרווחים בצינורות איזון המכילים 70 מיקרוליטר מים, ותנו לתאים להתייצב באמבט המים למשך כדקה לפני תחילת הסוניקציה.

לאחר שלושה מחזורים, הסר את הדגימות מהסוניקטור למערבולת עדינה, וסובב את הצינורות לפני החזרתם למחזיק. לשינוי היסטון, הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר tC1 שלם לכל צינור של שתי רצועות שמונה צינורות שבב, והעביר 20 מיקרוליטר מכל אחת מ-16 דגימות משותפות כרומטין לצינורות בודדים של רצועות שמונה צינורות השבב. שטפו את צינורות הכרומטין עם מאגר tC1 שלם של 80 מיקרוליטר, ואחסנו את השטיפות בצינורות המתאימים של רצועות שמונה הצינורות של השבב לנפח סופי של 200 מיקרוליטר תמיסה לכל צינור.

הוסף את נפח הנוגדן המתאים ל-500 מיקרוליטר של מאגר TBW1, והסתובב במהירות מערבולת ופולס. לאחר מכן הוסף 70 מיקרוליטר של tBW1, ו-30 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים לכל צינור של פס שבב חדש בעל שמונה צינורות. לאחר מכן, מערבל היטב מיכל של תמיסת חרוז חלבון A, והוסף חמישה מיקרוליטר חרוזים לכל 0.5 מיקרוגרם נוגדן לרצועת צינור חדשה.

סובב את רצועת החרוזים, ומלא את השורה האחרונה של המטפל בנוזל השבבים ברצועות שמונה צינורות מתויגות, ריקות. לאחר מכן עקוב אחר מפרטי התוכנית של שבב 16-I טהור 200 D למיקום שאר הרצועות, וטען את המאגרים למיקומים הנכונים. לאחר הרצף, לכוד את החרוזים במגנט רצועה בעל שמונה צינורות, והעביר 25 מיקרוליטר של מאגר תיוג לכל צינור.

כשהצינורות מוסרים מהמגנט, מערבבים בעדינות, עד שתמיסות החרוזים הומוגניות, לפני שמכניסים את הצינורות המכוסים מחדש לתוך ThermoMixer שחומם מראש למשך שלוש דקות. בתום הדגירה, הסר את רצועות שמונה הצינורות של השבב בשורה האחרונה של המטפל בנוזל השבבים, והוסף שני מיקרוליטר Rnase A לכל דגימה. לאחר מכן סובבו את הצינורות המכוסים מחדש, וערבבו בעדינות, עד שתמיסות החרוזים הומוגניות.

לטיהור שברי ה-DNA המתויגים, העבירו 100 מיקרוליטר מדגימות ה-DNA הצולבות D לצינורות בודדים של 1.5 מיליליטר, ושטפו את הצינורות עם 100 מיקרוליטר של מאגר קשירת DNA לכל צינור. דופק את השטיפות בצינורות המתאימים, וטען את הדגימות על עמודות. הנח את העמודות בצינורות איסוף חדשים של 1.5 מיליליטר, והוסף תשעה מיקרוליטר של מאגר Tris-EDTA של 55 מעלות צלזיוס ישירות למטריצות העמודים.

לאחר דקה אחת, צנטריפוגה את העמודים, והעבירו את תשעת המיקרוליטרים של הפליטה מכל עמוד לרצועה חדשה בת שמונה צינורות על קרח. הסר את שברי ה-DNA שוב כפי שהודגם, אך עם שמונה מיקרוליטרים של מאגר Tris-EDTA, ואגד את ה-eluate עם תמיסת שברי ה-DNA שנקטפה בעבר. כדי להגביר את דגימות שברי ה-DNA המטוהרים, ערבבו את הדגימות עם פיפטה רב-ערוצית ובצעו תוכנית הגברה עם מספר המחזורים המתאים.

לאחר ההגברה, השתמשו במגנט צלחת כדי ללכוד את החרוזים, והשליכו את הסופרנטנט. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר אתנול טרי של 80% בכל שטיפה, מבלי לשבש את כדור החרוזים. לאחר הכביסה האחרונה, השתמש בקצה פיפטה של 20 מיקרוליטר כדי להסיר עודפי אתנול, ואפשר לחרוזים להתייבש במשך 10 דקות, או עד שמופיעים סדקים בכדורי החרוזים.

הוסף 40 מיקרוליטר מים מחוממים מראש לכל דגימה מיובשת, ואטום את הצלחת לפני מערבולת יסודית, והסתובב לזמן קצר. לאחר מכן כמת את ה-DNA, באמצעות מבחן כימות פלואורסצנטי, על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. מדידות גודל שברי כרומטין גזוזים מדגימות יכולת שחזור רבה כאשר יותר מ-70% מהדגימות נצפו בין 100 ל-500 זוגות בסיסים במשך 14 מחזורים.

כפי שמודגם, המחזור שבו עוצמת הדגימה המתויגת היא מחצית מהמקסימום הממוצע הוא אופטימלי לקביעת מחזור. נתוני הריצוף הטובים ביותר מתקבלים כאשר יותר מ-85% מקטעי ה-DNA נעים בין 200 ל-1000 זוגות בסיסים. במסלולי העשרה מייצגים אלה עבור ארבעה מיקומי גנים, מסלולים בודדים לכל דגימה מראים איכות מיפוי גבוהה ויחס אות לרעש.

שני הלוקוסים הראשונים מכילים גנים המתבטאים היטב בסוגי תאים אלה, בעוד שהגנים בשני הלוקוסים האחרונים אינם באים לידי ביטוי, ומשמשים כבקרות רקע. עבור רוב ההשוואות הזוגיות, מדדי המתאם של פירסון מראים יותר מ-90%, מה שמרמז על רמה גבוהה של עקביות בין השכפולים הביולוגיים. בעוד שלוקוסים ספציפיים לסוג התא מציגים העשרה גבוהה בתאים המתאימים, גן משק בית מראה שינוי היסטון עקבי מאוד.

ניתוח מתאם בין מערך הנתונים של ChIP-Seq שבוצע מדגימות עם פחות מ-100,000 תאים עדיין מדגים יכולת שחזור ומתאם גבוהים עד 10,000 תאים. עם זאת, יש רקע מוגבר ככל שמספרי התאים מצטמצמים, כמו גם ירידה במקדמי המתאם שלהם. ליזציה נכונה של התאים חיונית להפקת נתונים באיכות גבוהה, מכיוון שמצאנו כי ליזיס תאים לא שלם משפיע על שאר הפרוטוקול.

באמצעות שיטה זו, ניתן לבדוק שינויים רבים ושונים בהיסטון וגורמי שעתוק על סוגי תאים שונים המעניינים כדי לקדם את ההבנה שלנו של אלמנטים רגולטוריים של ציס.