כתמים היסטולוגיים באמצעות קטעי רקמה צפים חופשיים
25 באוגוסט 2020
טכניקת הציפה החופשית מאפשרת לחוקרים לבצע צביעות היסטולוגיות, כולל אימונוהיסטוכימיה על חלקי רקמות קבועים כדי להמחיש מבנים ביולוגיים, סוג התא וביטוי ולוקליזציה של חלבונים. זוהי טכניקה היסטוכימית יעילה ואמינה שיכולה להיות שימושית לחקר מספר רב של רקמות, כגון מוח, לב וכבד.
ניתן להשתמש בטכניקת ציפה חופשית זו כדי לבצע אימונוהיסטוכימיה מופחתת על דגימות רקמת מוח של עכברים. טכניקת הציפה החופשית מספקת מספר יתרונות. רכישת קטעי רקמה עבים יותר, ביצוע מחקרים בקנה מידה גדול, תוך שימוש ב-30 עד 40 פרוסות לכל מנה ואחסון דגימות לטווח ארוך.
אם אתה מנסה טכניקה זו בפעם הראשונה, אנו ממליצים לך לתרגל הרכבה של קטעים שאינם קריטיים לניסוי שלך כדי לצבור ניסיון בשיטה. לפחות שעה עד שעתיים לפני החיתוך, התאקלמו את הדגימות המעניינות בקריוסטט בטמפרטורת חיתוך הרקמות המתאימה. כשהרקמות מוכנות.
השתמש בקריוסטט כדי לרכוש חלקים בעובי 20 עד 50 מיקרון ולהניח את החלקים בתוספות בודדות בבארות מלאות PBS של צלחת של שש או 12 בארות. לאחר שכל החלקים נרכשו, כסו את הדגימות בכשישה מיליליטר לשטיפה למשך שלוש שטיפות של חמש דקות לפני העברת כל באר של חלקים לשני צינורות מיקרו צנטריפוגה של מיליליטר, המכילים 1 עד 1.5 מיליליטר של תמיסת אחסון לכל צינור. לאחר מכן אחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לצביעה.
לצורך צביעת חתך רקמות, יש לאזן את הדגימות לטמפרטורת החדר למשך 10 עד 20 דקות לפני פירוק החלקים לתוספות בצלחת חדשה של שש בארות. לאחר ניקוז כל תמיסת האחסון, העבירו את התוספות לבארות חדשות, המכילות כשישה מיליליטר TBS לבאר למשך שלוש כביסות למשך חמש דקות עם TBS טרי לכל שטיפה על שייקר אורביטלי במהירות נמוכה בטמפרטורת החדר. לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו שבעה מיליליטר של תמיסת חדירה חוסמת טרייה שהוכנה לכל באר למשך 30 דקות דגירה על השייקר בטמפרטורת החדר.
בתום הדגירה, הוסף מיליליטר אחד מתמיסת הנוגדנים העיקרית המעניינת לצינור מיקרו צנטריפוגה אחד של שני מיליליטר לכל תוספת והעביר את כל החלקים בכל תוספת לצינור המתאים של שני מיליליטר. ואז הניחו את הצינורות על מערבל מסתובב. הוסף כשבע סיבובים לדקה לדגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס.
למחרת בבוקר, שפכו את החלקים מכל צינור לתוך תוספות באר בודדות בצלחת חדשה של שש בארות ושטפו את החלקים פעמיים למשך 30 שניות לכל שטיפה ופעם אחת למשך 10 דקות ב-TBS טרי לכל שטיפה. לאחר השטיפה האחרונה, העבירו את קבוצות החלקים לשני צינורות מיקרו צנטריפוגה בודדים של מיליליטר, המכילים מיליליטר אחד של תמיסת הנוגדנים המשנית המתאימה לכל שפופרת ודגרו את הדגימות למשך שעתיים בטמפרטורת החדר על שייקר אורביטלי במהירות נמוכה, מוגנת מפני אור. בתום הדגירה, שפכו את החלקים לתוספות בצלחת חדשה של שש בארות ושטפו את הדגימות פעמיים למשך 30 שניות ופעם אחת למשך 15 דקות ב-TBS טרי לכל שטיפה, מוגן מפני אור.
לאחר הכביסה האחרונה, שפכו את החלקים לתוך תא היסטולוגי מלבני מזכוכית, שלושה רבעים מלאים ב-TBS וטבלו מגלשת זכוכית ב-TBS. בעזרת מכחול עדין ומנורת מגדלת אם תרצה, שדל בזהירות את החלקים לכיוון המגלשה והקש בעדינות על קטע על המגלשה, וודא שאין קמטים או קפלים. כאשר כל החלקים נלכדו על מגלשה, הניחו לשקופיות להתייבש כ-10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר, מוגנות מפני אור, עד שהחלקים אטומים ומרחו אמצעי הרכבה מימי מתאים על החלקים.
השתמש בפינצטה כדי להניח החלקת כיסוי על המדיום והשתמש בפיסת נייר סינון כדי ללחוץ בחוזקה כלפי מטה על החלקת הכיסוי כדי להסיר עודפי מדיום. לאחר מכן ניתן לצלם את הקטעים, באמצעות מיקרוסקופ מתאים או לאחסן אותם בקופסת שקופיות כהה המכוונת לארבע מעלות צלזיוס. כפי שנצפה בתמונות מייצגות אלה, ניתן לבצע ניתוח אימונוהיסטוכימי פלואורסצנטי, בשיטת הציפה החופשית על קטעי רקמת מוח של עכבר כדי לבחון ביטוי חלבון חומצי סיבי גליה.
גישה זו מתאימה גם לחשיפת חלבונים בעלי ביטוי נמוך, כגון GFP, בדגימת מוח של עכבר טרנסגני בעל ביטוי נמוך או בפרוטוקולי צביעה היסטוכימיים שאינם פלואורסצנטיים, כגון סגול קרסיל. רקמות היקפיות אחרות ניתנות גם לשימוש בטכניקה זו ללא צורך בשינויים כפי שנצפה עבור דגימות רקמת כבד המבטאות GFP ברמה נמוכה. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בטכניקת הציפה החופשית הוא להיות עדין עם החלקים, במיוחד במהלך העברות וכאשר הדגימות נמצאות על השייקרים או המסובבים.
בנוסף לצביעה אימונופלואורסצנטית, ניתן לשנות שיטה זו בקלות עבור כתמים היסטוכימיים אחרים כגון המטוקסילין ואאוזין וסגול קרסיל או עבור אימונוהיסטוכימיה כרומוגן.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
טכניקת הריחוף החופשי (free-floating) משמשת לביצוע אימונוהיסטוכימיה על חתכי רקמה מקובעים, ומאפשרת ויזואליזציה של מבנים ביולוגיים, סוגי תאים וביטוי חלבונים. שיטה זו יעילה במיוחד לחקר רקמות שונות כגון המוח, הלב והכבד, ומספקת יתרונות כגון חתכי רקמה עבים יותר והתאמה למחקרים בהיקף רחב.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- היסטולוגיה
- אימונוהיסטוכימיה
- ניתוח רקמות
רקע
- היתרונות של טכניקת השכבות החופשיות (free-floating) כוללים טיפול פשוט יותר ואפשרות לאחסון מדגמים לטווח ארוך.
- שיטה זו ישימה על רקמות ביולוגיות מרובות ללא צורך בשינויים.
- היא משפרת את הגילוי של חלבונים בעלי ביטוי נמוך בסוגי מדגמים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- צביעה אימונוהיסטוכימית
- דגימות רקמת מוח של עכבר
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
תוצאות עיקריות
- הטכניקה מאפשרת זיהוי של ביטוי חלבוני חומצה גליאלית סיבית (glial fibrillar acidic protein).
- היא מפגינה יעילות בהקשרים של ביטוי חלבוני נמוך, כגון בדגימות של עכברים טרנסגניים ל-GFP.
- ניתן ליישם בטכניקה זו גם שיטות צביעה אחרות, כגון המטוקסילן ואאוזין.
מסקנות
- המחקר מדגיש את הרב-גוניות של טכניקת הצפה חופשית לצביעה וניתוח של רקמות.
- חיוני שחוקרים יטפלו בדגימות בעדינות כדי לשמור על שלמותן במהלך הניסוי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
טכניקת האימונוהיסטוכימיה של חתכים צפים (free-floating) מאפשרת עיבוד יעיל של חתכי רקמה עבים עבור מחקרים רחבי היקף, ובכך היא תומכת בתיקוף מטרות (target validation) ובצמצום סיכונים מכניסטיים במחקרי מדעי העצב ורקמות פריפריות. על ידי שיפור חדירות הנוגדנים ומאפשרת טיפול במנות של 30-40 חתכים לכל אליקווט, היא משפרת את השחזוריות ואת התפוקה בתהליכי גילוי. גישה זו בעלת ערך מיוחד לחקר דפוסי ביטוי של חלבונים ברקמות מורכבות כמו המוח, שבהם שחזור תלת-ממדי של הקרנות עצביות מסייע בביסוס הביטחון במטרה ובתיעדוף הפורטפוליו.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר ויזואליזציה של ביטוי וחלוציות של חלבונים בחתכי רקמה עבים, ובכך תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות ובהבהרת מסלולים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: מקל על הטיפול במספר רב של חתכים לכל מנה (aliquot), ובכך מפחית את העומס העבודה בקמפיינים של סריקת סממנים ביולוגיים בהיקף נרחב.
- ערך חיזוי: משפר את חדירות הנוגדנים בהשוואה לשיטות המבוססות על הרכבה על זכוכית, ובכך מגביר את הביטחון בזיהוי מטרות בריכוז נמוך, כגון GFP במודלים טרנסגניים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: תואם למספר צבעים היסטוכימיים, כולל hematoxylin and eosin, cresyl violet וצביעות immunohistochemistry כרומוגניות, מה שמאפשר פיתוח גמיש של בדיקות.
- ערך תפעולי: חתכים נותרים תלויים בתמיסה במהלך הצביעה, מה שמבטיח חשיפה אחידה לרכיבים וממזער שונות בין חזרות.
- שביליות (Scalability): תומך באחסון לטווח ארוך ב-80°C-, דבר המאפשר עיבוד של דגימות במנות (batch processing) ואנליזה רטרוספקטיבית בתהליכי גילוי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: ישים להסמכה הן במערכת העצבים המרכזית והן ברקמות היקפיות (למשל, כבד, לב) ללא שינויים בפרוטוקול, דבר התומך בתיקוף בין מטרות שונות.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשר שחזור תלת-ממדי של בליטות אקסוניות ודנדריטיות, ומספק הקשר מבני למעורבות המטרה ולניתוח מסלולים.
- קידום מותאם סיכונים: מייצר נתונים כמותיים של ביטוי חלבונים ברזולוציה מרחבית, המנחים החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) בבחירת מטרות בשלב הפרה-קליני.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימת עבודה
שיטת הריחוף החופשי משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית לגבי מטרות, דרך זיהוי מובילים ועד לתיקוף פרה-קליני, ובמיוחד במדעי העצב ובערכת רעילות מערכית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקה מונחית-היפותזה של דפוסי ביטוי חלבונים ברקמות מקובעות, ומאפשרת תובנה מכניסטית לגבי הביולוגיה של המטרה.
- סריקה: מייצרת תוצאות פלואורסצנטיות או כרומוגניות כמותיות וניתנות לשחזור, המתאימות למערכות דימוי אוטומטיות ולפלטפורמות סריקה מבוססות דימוי.
- אנליטיקה: מפיקה נתוני ביטוי בעלי רזולוציה מרחבית שניתן לכמת ולהשוות בין תנאים ניסיוניים כדי להעריך את המודולציה של המטרה.
- מחקר תרגומי: מאפשרת עקביות בין שלבי הגילוי למודלים פרה-קליניים על ידי יישום פרוטוקולי צביעה זהים בין מינים וסוגי רקמות שונים.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה פלטפורמה סטנדרטית וניתנת להתאמה לניתוח היסטולוגי, שניתן להטמיע בפרויקטים מרובים ובתחומי טיפול שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את רגישות וסגוליות הגילוי באימונוהיסטוכימיה, ומפחית תוצאות שגויות שליליות במחקרי תיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של טיפול ברקמות ונהלי צביעה, מה שמשפר את השחזוריות בין מעבדות ומפחית שונות טכנית.
- ערך אסטרטגי: מגדיל את התפוקה בסריקות מבוסססות היסטולוגיה, מוריד את העלות לדגימה ומאיץ את מחזורי הפחתת הסיכון של מטרות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מטרות מונחה-נתונים על ידי אספקת קריאות רקמה אמינות ורב-פרמטריות, המנחות את הסבירות הביולוגית ואת שולי הבטיחות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהיסטולוגיה, חיתוך רקמות, ושיטות גילוי באמצעות אימונופלוורסצנציה או שיטות כרומוגניות.
- תלוי בגישה לקריוסטט, מיקרוטום, שייקרים מסלוליים (orbital shakers), מיקסרים סיבוביים, ומיקרוסקופי פלואורסצנציה או שדה בהיר.
- מחייב שימוש בבפירות חסימה (blocking), חדירה (permeabilizing) ושטיפה סטנדרטיים כדי לצמצם קישור לא ספציפי ולהבטיח עקביות בצביעה.
- נדרש אופטימיזציה של ריכוזי הנוגדנים וזמני הדגירה עבור כל מטרה וסוג רקמה, במיוחד עבור חלבונים בשכיחות נמוכה.
- דורש טיפול זהיר ועדין בחתכים צפים כדי למנוע נזק מכני במהלך ההעברות ושלבי ההדגירה.
