כתמים היסטולוגיים באמצעות קטעי רקמה צפים חופשיים
August 25th, 2020
טכניקת הציפה החופשית מאפשרת לחוקרים לבצע צביעות היסטולוגיות, כולל אימונוהיסטוכימיה על חלקי רקמות קבועים כדי להמחיש מבנים ביולוגיים, סוג התא וביטוי ולוקליזציה של חלבונים. זוהי טכניקה היסטוכימית יעילה ואמינה שיכולה להיות שימושית לחקר מספר רב של רקמות, כגון מוח, לב וכבד.
ניתן להשתמש בטכניקת ציפה חופשית זו כדי לבצע אימונוהיסטוכימיה מופחתת על דגימות רקמת מוח של עכברים. טכניקת הציפה החופשית מספקת מספר יתרונות. רכישת קטעי רקמה עבים יותר, ביצוע מחקרים בקנה מידה גדול, תוך שימוש ב-30 עד 40 פרוסות לכל מנה ואחסון דגימות לטווח ארוך.
אם אתה מנסה טכניקה זו בפעם הראשונה, אנו ממליצים לך לתרגל הרכבה של קטעים שאינם קריטיים לניסוי שלך כדי לצבור ניסיון בשיטה. לפחות שעה עד שעתיים לפני החיתוך, התאקלמו את הדגימות המעניינות בקריוסטט בטמפרטורת חיתוך הרקמות המתאימה. כשהרקמות מוכנות.
השתמש בקריוסטט כדי לרכוש חלקים בעובי 20 עד 50 מיקרון ולהניח את החלקים בתוספות בודדות בבארות מלאות PBS של צלחת של שש או 12 בארות. לאחר שכל החלקים נרכשו, כסו את הדגימות בכשישה מיליליטר לשטיפה למשך שלוש שטיפות של חמש דקות לפני העברת כל באר של חלקים לשני צינורות מיקרו צנטריפוגה של מיליליטר, המכילים 1 עד 1.5 מיליליטר של תמיסת אחסון לכל צינור. לאחר מכן אחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לצביעה.
לצורך צביעת חתך רקמות, יש לאזן את הדגימות לטמפרטורת החדר למשך 10 עד 20 דקות לפני פירוק החלקים לתוספות בצלחת חדשה של שש בארות. לאחר ניקוז כל תמיסת האחסון, העבירו את התוספות לבארות חדשות, המכילות כשישה מיליליטר TBS לבאר למשך שלוש כביסות למשך חמש דקות עם TBS טרי לכל שטיפה על שייקר אורביטלי במהירות נמוכה בטמפרטורת החדר. לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו שבעה מיליליטר של תמיסת חדירה חוסמת טרייה שהוכנה לכל באר למשך 30 דקות דגירה על השייקר בטמפרטורת החדר.
בתום הדגירה, הוסף מיליליטר אחד מתמיסת הנוגדנים העיקרית המעניינת לצינור מיקרו צנטריפוגה אחד של שני מיליליטר לכל תוספת והעביר את כל החלקים בכל תוספת לצינור המתאים של שני מיליליטר. ואז הניחו את הצינורות על מערבל מסתובב. הוסף כשבע סיבובים לדקה לדגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס.
למחרת בבוקר, שפכו את החלקים מכל צינור לתוך תוספות באר בודדות בצלחת חדשה של שש בארות ושטפו את החלקים פעמיים למשך 30 שניות לכל שטיפה ופעם אחת למשך 10 דקות ב-TBS טרי לכל שטיפה. לאחר השטיפה האחרונה, העבירו את קבוצות החלקים לשני צינורות מיקרו צנטריפוגה בודדים של מיליליטר, המכילים מיליליטר אחד של תמיסת הנוגדנים המשנית המתאימה לכל שפופרת ודגרו את הדגימות למשך שעתיים בטמפרטורת החדר על שייקר אורביטלי במהירות נמוכה, מוגנת מפני אור. בתום הדגירה, שפכו את החלקים לתוספות בצלחת חדשה של שש בארות ושטפו את הדגימות פעמיים למשך 30 שניות ופעם אחת למשך 15 דקות ב-TBS טרי לכל שטיפה, מוגן מפני אור.
לאחר הכביסה האחרונה, שפכו את החלקים לתוך תא היסטולוגי מלבני מזכוכית, שלושה רבעים מלאים ב-TBS וטבלו מגלשת זכוכית ב-TBS. בעזרת מכחול עדין ומנורת מגדלת אם תרצה, שדל בזהירות את החלקים לכיוון המגלשה והקש בעדינות על קטע על המגלשה, וודא שאין קמטים או קפלים. כאשר כל החלקים נלכדו על מגלשה, הניחו לשקופיות להתייבש כ-10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר, מוגנות מפני אור, עד שהחלקים אטומים ומרחו אמצעי הרכבה מימי מתאים על החלקים.
השתמש בפינצטה כדי להניח החלקת כיסוי על המדיום והשתמש בפיסת נייר סינון כדי ללחוץ בחוזקה כלפי מטה על החלקת הכיסוי כדי להסיר עודפי מדיום. לאחר מכן ניתן לצלם את הקטעים, באמצעות מיקרוסקופ מתאים או לאחסן אותם בקופסת שקופיות כהה המכוונת לארבע מעלות צלזיוס. כפי שנצפה בתמונות מייצגות אלה, ניתן לבצע ניתוח אימונוהיסטוכימי פלואורסצנטי, בשיטת הציפה החופשית על קטעי רקמת מוח של עכבר כדי לבחון ביטוי חלבון חומצי סיבי גליה.
גישה זו מתאימה גם לחשיפת חלבונים בעלי ביטוי נמוך, כגון GFP, בדגימת מוח של עכבר טרנסגני בעל ביטוי נמוך או בפרוטוקולי צביעה היסטוכימיים שאינם פלואורסצנטיים, כגון סגול קרסיל. רקמות היקפיות אחרות ניתנות גם לשימוש בטכניקה זו ללא צורך בשינויים כפי שנצפה עבור דגימות רקמת כבד המבטאות GFP ברמה נמוכה. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בטכניקת הציפה החופשית הוא להיות עדין עם החלקים, במיוחד במהלך העברות וכאשר הדגימות נמצאות על השייקרים או המסובבים.
בנוסף לצביעה אימונופלואורסצנטית, ניתן לשנות שיטה זו בקלות עבור כתמים היסטוכימיים אחרים כגון המטוקסילין ואאוזין וסגול קרסיל או עבור אימונוהיסטוכימיה כרומוגן.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
הטכניקה של ציפה חופשית משמשת לביצוע אימונוהיסטוכימיה על חתכי רקמות קבועים, ומאפשרת הדמיה של מבנים ביולוגיים, סוגי תאים וביטוי חלבון. שיטה זו יעילה במיוחד לחקירת רקמות שונות כמו מוח, לב וכבד, ומספקת יתרונות כמו חתכי רקמה עבים יותר והתאמה למחקרים בקנה מידה גדול.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המחקר
- היסטולוגיה
- אימונוהיסטוכימיה
- ניתוח רקמות
רקע
- היתרונות של טכניקת הציפה החופשית כוללים טיפול קל יותר ואפשרות לאחסון דגימות לטווח ארוך.
- שיטה זו חלה על רקמות ביולוגיות מרובות ללא שינויים.
- היא משפרת את זיהוי חלבונים בעלי ביטוי נמוך בסוגי דגימות שונות.
שיטות בשימוש
- צביעה אימונוהיסטוכימית
- דגימות רקמת מוח עכבר
- מיקרוסקופיה פלורסצנטית
תוצאות עיקריות
- הטכניקה מאפשרת זיהוי של ביטוי חלבון פיברילרי גליאלי חומצי.
- היא מדגימה יעילות בהקשרים של ביטוי חלבון נמוך, כמו בדגימות עכבר טרנסגני GFP.
- ניתן ליישם גם שיטות צביעה אחרות כמו המטוקסילין ואאוזין באמצעות טכניקה זו.
מסקנות
- המחקר מדגיש את הרבגוניות של טכניקת הציפה החופשית להדמיה וניתוח רקמות.
- חשוב לחוקרים לטפל בדגימות בעדינות כדי לשמור על שלמותן במהלך הניסוי.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
The free-floating immunohistochemistry technique enables efficient processing of thick tissue sections for large-scale studies, supporting target validation and mechanistic de-risking in neuroscience and peripheral tissue research. By improving antibody penetration and allowing batch handling of 30-40 sections per aliquot, it enhances reproducibility and throughput in discovery workflows. This approach is particularly valuable for studying protein expression patterns in complex tissues such as brain, where 3D reconstruction of neural projections informs target confidence and portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables visualization of protein expression and localization in thick tissue sections, supporting functional target validation and pathway clarification.
- Operational Value: Facilitates handling of large numbers of sections per aliquot, reducing labor in large-scale biomarker screening campaigns.
- Predictive Value: Improves antibody penetration compared to slide-mounted methods, increasing confidence in detection of low-abundance targets such as GFP in transgenic models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Compatible with multiple histochemical stains including hematoxylin and eosin, cresyl violet, and chromogen immunohistochemistry, enabling flexible assay development.
- Operational Value: Sections remain suspended in solution during staining, ensuring uniform reagent exposure and minimizing variability across replicates.
- Scalability: Supports long-term storage at -80°C, allowing batch processing and retrospective analysis in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Applicable to both central nervous system and peripheral tissues (e.g., liver, heart) without protocol modifications, supporting cross-target validation.
- Mechanistic De-risking: Enables 3D reconstruction of axonal and dendritic projections, providing structural context for target engagement and pathway analysis.
- Risk-Adjusted Advancement: Generates quantitative, spatially resolved protein expression data that inform go/no-go decisions in preclinical target selection.
Pipeline & Workflow Integration
The free-floating method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly in neuroscience and systemic toxicity assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of protein expression patterns in fixed tissues, enabling mechanistic insight into target biology.
- Screening: Generates reproducible, quantitative fluorescence or chromogenic readouts suitable for automated imaging and image-based screening platforms.
- Analytics: Produces spatially resolved expression data that can be quantified and compared across experimental conditions to assess target modulation.
- Translational Research: Enables consistency between discovery and preclinical models by applying identical staining protocols across species and tissue types.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized, adaptable platform for histological analysis that can be deployed across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances detection sensitivity and specificity in immunohistochemistry, reducing false negatives in target validation studies.
- Operational Value: Standardizes tissue handling and staining procedures, improving inter-lab reproducibility and reducing technical variability.
- Strategic Value: Increases throughput in histology-based screening, lowering cost per sample and accelerating target de-risking cycles.
- Portfolio Impact: Supports data-driven target prioritization by providing reliable, multi-parameter tissue readouts that inform biological plausibility and safety margins.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, tissue sectioning, and immunofluorescence or chromogenic detection methods.
- Dependent on access to cryostat, microtome, orbital shakers, rotating mixers, and fluorescence or brightfield microscopes.
- Necessitates standardized blocking, permeabilizing, and washing buffers to minimize non-specific binding and ensure staining consistency.
- Requires optimization of antibody concentrations and incubation times for each target and tissue type, particularly for low-abundance proteins.
- Demands careful, gentle handling of free-floating sections to prevent mechanical damage during transfers and incubation steps.
