אסטרטגיה דו-שלבית המשלבת שינוי אפיגנטי ורמזים ביומכניים ליצירת תאים פלוריפוטנטיים של יונקים

הפרוטוקול המוצג בסרטון זה משלב לראשונה את השימוש במחיקה אפיגנטית כימית עם רמזים ביומכניים כדי לגרום ולשמור על פלוריפוטנטיות בתאים בוגרים בעלי התמיינות סופנית. החוזק העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא אינו דורש וקטורים טרנסגניים או ויראליים. יתר על כן, הוא חזק, ניתן לשחזור וגמיש.

טכניקה זו אינה דורשת שימוש בטרנספקציה גנטית, ולכן מייצגת התקדמות טכנולוגית בולטת לרפואה תרגומית וטיפול תאי, תוך תמיכה בתרבית ארוכת טווח של תאים בעלי פלסטיות גבוהה. המדגימות את ההליך יהיו ג'ורג'יה פנרוסה, פרופסור עוזרת, וטרזינה דה יוריו, דוקטורנטית מהמעבדה שלי. התחל בהכנת תמיסת מלאי 5-aza-CR טרייה של מילי-מולרית אחת.

שוקלים 2.44 מיליגרם של 5-aza-CR וממיסים אותו ב -10 מיליליטר DMEM עם גלוקוז גבוה. השעו מחדש את האבקה על ידי מערבולת ועיקרו את התמיסה בעזרת פילטר של 0.22 מיקרומטר. הכן תמיסת עבודה 5-aza-CR על ידי דילול מיקרוליטר אחד מתמיסת המלאי במיליליטר אחד של מדיום תרבית פיברובלסטים.

טריפסיניזציה של התאים כמתואר בכתב היד של הטקסט ועקירתם בעזרת פיפטינג עדין. לאחר מכן אוספים את תרחיף התאים ומעבירים אותו לצינור חרוטי. ספור תאים באמצעות תא ספירה תחת מיקרוסקופ אופטי.

צנטריפוגה את מתלה התאים ב -150 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה כדי לקבל 40,000 תאים ב-30 מיקרוליטר של מדיום תרבית פיברובלסטים בתוספת 5-aza-CR מיקרו-מולרי אחד. מלאו צלחת פטרי בגודל 35 מילימטר באבקת PTFE כדי לייצר מצע והפיצו את 30 המיקרוליטרים של התאים על מצע האבקה.

סובב בעדינות את צלחת הפטרי בתנועה סיבובית כדי להבטיח שאבקת PTFE מכסה לחלוטין את פני טיפת הנוזל ליצירת מיקרוביו-ריאקטור שיש נוזלי. הרם את המיקרוביו-ריאקטור משיש נוזלי באמצעות קצה פיפטה של 1000 מיקרוליטר שנחתך כדי להתאים לקוטר השיש. צלחת את המיקרו-ביו-כור על צלחת פטרי בקטריולוגית נקייה כדי לייצב אותו.

לאחר מכן, העבירו את המיקרו-ביו-ריאקטור מצלחת הפטרי לצלחת של 96 בארות. הוסף לאט לאט 100 מיקרוליטר מדיה משולי הבאר. המיקרו-ביו-ריאקטור צריך לצוף על גבי המדיה.

דגרו את המיקרו-ביו-ריאקטור משיש נוזלי למשך 18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת פחמן דו חמצני של 5%. לאחר הדגירה, אספו את המיקרו-ביו-ריאקטור משיש נוזלי באמצעות קצה פיפטה של 1000 מיקרוליטר והניחו אותו בצלחת פטרי בקטריולוגית חדשה בגודל 35 מילימטר. השתמש במחט כדי לנקב את הגולה הנוזלית ולשבור אותה.

שחזר את הספרואידים שנוצרו עם קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר שנחתך בקצה תחת סטריאומיקרוסקופ. כדי לשטוף שאריות 5-aza-CR, העבירו את האורגנואידים לצלחת פטרי המכילה מדיום ESC. הכינו צלחת פטרי חדשה בגודל 35 מילימטר המכילה את מצע האבקה PTFE והפיצו אורגנואיד בודד בטיפה של 30 מיקרוליטר של מדיום תרבית ESC על האבקה באמצעות קצה פיפטה חתוך של 200 מיקרוליטר.

סובב בעדינות את המנה בתנועה סיבובית ליצירת מיקרו-ביו-ריאקטור חדש משיש נוזלי והעבירו אותו לבאר של צלחת של 96 בארות. הוסף 100 מיקרוליטר מדיה משולי הבאר כדי לרחוץ לאט את השיש. תרבית המיקרוביו-ריאקטורים משיש נוזלי ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

ניתוחים מורפולוגיים מראים כי לאחר דגירה של 18 שעות עם חומר הדמתילציה 5-aza-CR, פיברובלסטים משלושה מיני יונקים עטופים במיקרוביו-ריאקטורים PTFE הצטברו ויצרו מבנים כדוריים תלת מימדיים עם גיאומטריה בגודל אחיד. בתנאים תלת מימדיים, 86.31% מהתאים העטופים שינו באופן יוצא דופן את הפנוטיפ שלהם. לעומת זאת, תאים לאחר 5-aza-CR שגודלו בתנאים סטנדרטיים דו-ממדיים היו קטנים משמעותית בגודלם, עם גרעינים מגורענים ושמרו על התפלגות חד-שכבתית.

השינויים המורפולוגיים לוו בהופעת ביטוי גנים הקשור לפלוריפוטנטיות, הן בתאי תלת מימד והן בתאים דו-ממדיים לאחר 5-aza-CR. שעתוק נצפה עבור הומאובוקס אחד מסוג POU 5, הומאובוקס NANOG, חלבון אצבע אבץ ZFP42 ואזור קובע מין Ybox2, אשר נעדרים בפיברובלסטים לא מטופלים. ויסות משמעותי של מולקולת ההידבקות של תאי אפיתל 10-11 טרנסלוקציה 2 וגנים של קדהרין 1 נצפתה גם בתאי תלת מימד לאחר 5-aza-CR בהשוואה לתאים שגודלו בצלחות פלסטיק סטנדרטיות דו-ממדיות.

במקביל, התגלה ויסות נמוך של אנטיגן פני השטח של תא Thy1 הספציפי לסמן פיברובלסטים בתאי תלת מימד ודו-ממד לאחר 5-aza-CR. ירידה משמעותית ברמות המתילציה בתאי 3D ו-2D לאחר 5-aza-CR אושרה עם ELISA. רמות המתילציה של ה-DNA היו נמוכות משמעותית בתאי תלת-ממד לאחר 5-aza-CR בהשוואה לתאים שגודלו בתנאים דו-ממדיים.

יתר על כן, תאי תלת מימד לאחר 5-aza-CR שמרו על המבנה הכדורי התלת-ממדי הנרכש, רמות ביטוי גבוהות של גנים הקשורים לפלוריפוטנטיות ורמות מתילציה נמוכות של DNA במשך 28 ימים, ובשלב זה התרבית נעצרה. המיקרוביו-ריאקטורים יכולים לשמש גם לשמירה על תנאים אופטימליים לתרביות תאי אב, כמו גם להגביר את יעילות ההתמיינות הסופית.