התגבשות חלבונים על שבב על ידי מיקרודיאליזה עבור In Situ רנטגן עקיפה מחקרים

נייר זה מפרט את פרוטוקול הייצור של שבבים מיקרופלואידיים שפותחו להתגבשות חלבונים על שבב בשיטת הדיאליזה ובניסויי עקיפת קרני רנטגן. תהליך microfabrication מאפשר לשלב קרום דיאליזה תאית מתחדשת למחצה עם כל משקל מולקולרי מנותק, בין שתי שכבות של השבב.

מאמר זה מתאר את פרוטוקול הייצור של שבבים מיקרופלואידיים שפותחו עבור התגבשות חלבונים על שבב בשיטת הדיאליזה ובניסויי עקיפת רנטגן situ בטמפרטורת החדר. אחד היתרונות העיקריים של שבבים אלה הוא הבחירה של חומרי ייצור, מה שהופכים את השבבים תואמים באיסוף נתונים עקיפת רנטגן situ בטמפרטורת החדר. ניסויי התגבשות על השבב דורשים כמויות קטנות של דגימת החלבון, מה שמפחית את העלות הכוללת של עבודה עם מקרומולקולות בעלות גבוהה אלה.

התגבשות על השבב גם מבטלת את הקציר הידני של גבישי החלבון השבירים, המיושמים לעתים קרובות בשילוב עם קירור קריו במהלך ניסויי התגבשות קונבנציונליים. יתר על כן, השבבים שלנו משתמשים במיקרו-דיאליזה להתגבשות חלבונים, שהיא שיטה מבוססת דיפוזיה שמטרתה לייצב את ריכוז המשקעים באמצעות קרום חדיר למחצה, על מנת להתקרב לריכוז הקרומולנט להתגבשות חלבונים, ומאפשרת שליטה מדויקת והפיגור על תנאי ההתגבשות. מיקרו-דיאליזה בשילוב עם בקרת טמפרטורה יכולה לשמש לניתוק התגרענות מצמיחת גביש לצורך חקירת דיאגרמות פאזה, על ידי שינוי ריכוז המשקעים תוך שימוש באותה דגימת חלבון.

ראשית להכין 50 גרם של בסיס סיליקון PDMS וזה ריפוי סוכן ביחס מסה 10-1. מערבבים את שני המרכיבים בקסה עם מרית. לאחר ערבוב, מניחים את התערובת בתא ואקום על מנת להסיר את כל בועות האוויר.

שים 25 גרם של PDMS premixed לתוך SU8 הראשון לשלוט המכיל את הדפוסים של הערוץ microfluidic ואת העמודים, עד לגובה של כחמישה מילימטרים. לאחר מכן יוצקים את 25 גרם הנותרים של PDMS לתוך המאסטר השני SU8, המכיל רק את התבניות של העמודים. לרפא את שתי שכבות PDMS בתנור ב 338 קלווין במשך שעה אחת.

חותכים את שכבות PDMS נרפא סביב הדפוסים של אדוני SU8 עם אזמל, בעדינות לקלף את תבניות PDMS מן אדוני סיליקון. הנח את תבנית ה- PDMS, הכוללת הן את הערוצים והן את העמודים על מגלשת זכוכית מיקרוסקופ נוקשה עם התבניות הפונות כלפי מעלה. חותכים חתיכה קטנה של קרום דיאליזה תאית מחדש על מנת לכסות את העמוד המרכזי של עובש PDMS, אשר נועד להיות תא החלבון.

ניתוק המשקל המולקולרי של קרום הדיאליזה נבחר בהתאם למשקל המולקולרי של דגימת החלבון, והמשקעים של פתרון ההתגבשות. לאחר מכן להפריד בזהירות את החלק היבש של קרום דיאליזה תאית מחדש. חותכים חתיכה קטנה של קרום הדיאליזה המופרד.

הגודל של חתיכת קרום זה תלוי בתכנון השבב. ובאופן ספציפי, זה תלוי בממדים של העמוד המרכזי. הפקד את חתיכת קרום הדיאליזה על העמוד המרכזי של תבנית PDMS, הנתמכת על מגלשת הזכוכית, כשעמודיה ותעלותיה פונים כלפי מעלה.

לאחר מכן הניחו את תבנית ה-PDMS השנייה הכוללת רק את העמודים הפונים כלפי מטה, מעל תבנית ה-PDMS שכבר נתמכת בשקופית הזכוכית. יישרו את כל העמודים של שתי תבניות PDMS. פיסת קרום הדיאליזה התאית המחודשת דחוקה בין שני העמודים המרכזיים של תבניות PDMS.

שלב זה של הליך הייצור יכול להתבצע תחת מיקרוסקופ אופטי או פשוט על ידי בדיקה חזותית בזהירות את היישור של כל העמודים. מניחים את ההרכבה בתא ואקום ומתייבשים במשך 30 דקות על מנת להסיר את בועות האוויר הלכודות בתוך תבניות ה- PDMS, וכדי לשפר את החדרת שארף ה- NOA הפוטו-קורי, המתואר בשלב הבא של פרוטוקול זה. מוציאים את ההרכבה מתא הוואקום וממלאים את החלל הריק בין שתי תבניות PDMS עם שרף מבוסס תיולין פוטו, NOA 81, על ידי imbibition נימי.

החל את שף על שלושה מארבעת הצדדים של ההרכבה. מניחים את ההרכבה במקשר צולב ומרפאים את שרף ה- NOA על ידי חשיפה לאור UV למשך שמונה שניות, באמצעות מנורת UV קולימינציה של 35 מילי-ואט לסנטימטר מרובע. חותכים חתיכת PMMA בעובי 175 מיקרומטר בממדים הסטנדרטיים של מגלשת זכוכית מיקרוסקופ, ומקלפים את הגנת הפלסטיק מכל צד של פיסת PMMA.

לאחר השלמת החשיפה הראשונה ל-UV, הסירו את תבנית ה-PDMS העליונה עם שף NOA מקושר חלקית תקוע עליו מתבנית ה-PDMS התחתונה ומשקופית הזכוכית. לחץ בעדינות על ההרכבה של תבנית PDMS העליונה ואת שף NOA נרפא חלקית על פיסת PMMA. מניחים את ההרכבה החדשה בקישור הנגדי ומרפאים שוב את שרף ה-NOA על ידי חשיפה לאור UV למשך 60 שניות.

הסר בזהירות את תבנית ה- PDMS העליונה. שבב הדיאליזה העשוי משוחל NOA חוצה קישורים לחלוטין המטביע קרום דיאליזה תאית מחודשת ונתמך על פיסת PMMA מוכן. מחברים זמינים מסחרית בונד בנקודות ההטבעה והשקע של הערוץ המיקרופלואידי עם דבק אפוקסי מהיר.

לטיפול בנוזלים, בחר את קוטר צינורות ה- PTFE בהתבסס על גודל המחברים. הצינורות משמשים להכנסת פתרון ההתגבשות בתוך הערוץ הנוזלי של שבב הדיאליזה. פיפטה ידנית טיפה של דגימת החלבון בתוך מאגר החלבון הממוקם ממש על קרום הדיאליזה.

נפח טיפת החלבון תלוי בתכנון השבב שנמצא בשימוש. ובאופן ספציפי, זה תלוי בנפח של העמוד המרכזי, וזה יכול להיות 0.1 או 0.3 microliters. יש למרוח בזהירות שכבה דקה של שומן סיליקון ואקום גבוה מסביב למאגר החלבון.

חותכים חתיכה קטנה של PMMA ומניחים אותה בעדינות מעל השכבה הדקה של גריז הסיליקון. חותכים חתיכה של סרט קפטון, גדול מספיק כדי לכסות את חתיכת PMMA ממוקם מעל מאגר החלבון להידבק על שבב NOA סביב כל הקצוות. דגימת החלבון נעטפת בתוך המאגר והשבב יכול לשמש לניסויי התגבשות.

ראשית להכין כ 500 microliters של פתרון התגבשות על ידי ערבוב כמויות מתאימות של החיץ ואת פתרונות משקעים. הזרק את פתרון ההתגבשות בנקודה של שבב הדיאליזה דרך המחברים הנוזליים, או באופן ידני עם המזרק או עם מערכת מונעת לחץ אוטומטית. ברגע שהערוץ הנוזלי מתמלא בתמיסת ההתגבשות ואף אוויר לא נלכד בתוכו, אטמו את יציאות המפרצון והשקע של השבב עם סרט Parafilm.

פיפטה את הנפח המתאים של תמיסת החלבון בתוך מאגר החלבון ולתמצת את דגימת החלבון כפי שכבר תואר. ניתן לדמיין את צמיחת גביש החלבון ולתעד אותו באמצעות מצלמה דיגיטלית. לייצור שבבי הדיאליזה, בחרנו בחומרים שקופים אופטיים ולא פעילים ביולוגית, המדגימים תאימות גבוהה לניסויי עקיפת קרני רנטגן.

רעש הרקע שנוצר על ידי החומרים המרכיבים את תא החלבון של השבב, שנמצא בנתיב הישיר של קרן הרנטגן, הוערך. תא החלבון מורכב מממברנה דיאליזה תאית מחודשת, סרט קפטון, ושתי שכבות PMMA, אחת המשמשת כמצע של השבבים, ואחת המשמשת לאנקפסולציה של דגימת החלבון. בתמונה זו, מודגם רעש הרקע שנוצר על ידי קלטת Kapton, קרום דיאליזה תאית מחודשת, שכבת PMMA, ואת ההרכבה שלהם.

למרות שהשורף הפוטו-מרפא NOA מהווה את הגוף העיקרי של השבבים, אינו נכלל במדידות אלה מכיוון שהוא אינו חלק מתא החלבון. טבעות מפוזרות המיוחסות לאינטראקציות של צילומי רנטגן עם החומרים ניתן לראות עבור קלטת Kapton ברזולוציה נמוכה מארבעה אנגסטרום, PMMA בין ארבעה לשמונה אנגסטרום, ואת קרום הדיאליזה בין ארבע לחמש אנגסטרום. רעש הרקע הכולל שנוצר על ידי השבב נצפה בעיקר ברזולוציה נמוכה משש חרדות, המציין כי הטיפול בנתוני עקיפה ברזולוציה גבוהה lysozyme אינו מושפע.

השבבים הורכבו מול קרן הרנטגן עם תמיכה מודפסת בתלת מימד שעיצבנו לניסויי עקיפת קרני רנטגן, והוא יכול להכיל עד שלושה שבבים בו זמנית. ניסויים נערכו על מנת להעריך את היעילות של השבבים להתגבשות על השבב של חלבונים מסיסים במודל בשיטת המיקרו-דיאליזה. גבישי lysozyme גדלו ב 293 קלווין בשני תנאים שונים.

מצב ההתגבשות הראשון הכיל 1.5 נתרן כלורי טוחן, ו 0.1 נתרן אצטט טוחן. מצב ההתגבשות השני הכיל נתרן כלורי טוחן אחד, נתרן אצטט טוחן 0.1 ו-30% פוליאתילן גליקול 400, ונבחר להראות את תאימות השבבים ואת שיטת השבבים, עם משקעים בעלי משקל מולקולרי גבוה ופתרונות צמיגים. ניסויי ההתגבשות בוצעו בתנאים סטטיים.

לאחר גבישי lysozyme גדלו על השבב, הם שימשו בניסויים עקיפת רנטגן situ בטמפרטורת החדר. השבבים הורכבו בקו הקרן בעזרת התמיכה המודפסת בתלת-ממד וערכות נתונים מלאות של עקיפת קרני רנטגן נאספו משני גבישי lysozyme. לאחר טיפול בנתוני עקיפת קרני הרנטגן, מפת צפיפות האלקטרונים של גביש lysozyme יחיד הושגה ברזולוציה של 1.95 חרדה, כפי שמוצג באיור A.Figure B מראה את מפת צפיפות האלקטרונים שהושגה ברזולוציה של 1.85 אנגסטרום.

לאחר מיזוג שתי ערכות נתונים המתקבלות משני גבישי lysozyme שונים, שתי מפות צפיפות האלקטרו מראות מידע מבני מפורט שניתן להשיג על ידי ניסויי עקיפת רנטגן situ שנערך ישירות על שבבי דיאליזה בטמפרטורת החדר, מגבישי חלבון יחיד או מרובים. הדגמנו את הליך הייצור של מכשירים מיקרופלואידיים המיועדים להתגבשות חלבונים על שבב בשיטת המיקרו-דיאליזה, ובניסויי עקיפת קרני רנטגן במקום בטמפרטורת החדר. השתמשנו בחומרי ייצור עם שקיפות רנטגן גבוהה, תואמת לקריסטלוגרפיה של חלבון situ.

איסוף נתוני עקיפה הוא אוטומטי עם שימוש בתמיכה מודפסת 3D עבור השבבים, כי ניתן להתקין ישירות בקווי קרן קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית. הרב-תכליתיות של שבב זה נובעת משימוש במיקרו-דיאליזה כדי לשלוט באופן הפיך בתנאי התגבשות ולמפות דיאגרמות פאזה באמצעות נפח חלבון קטן. אב-טיפוס של המכשיר הוא פשוט, המאפשר ייצור של עד 30 שבבים ביום אחד בחדר נקי, עם חומרים זולים יחסית.

אנו מצפים כי תכונות אלה של השבבים ניתן להשתמש עבור מחקרים קריסטלוגרפיה רנטגן סדרתי של מטרות חלבון מאתגר יותר.