Name: אגרובקטריום -תווךטרנספורמציה גנטית, ייצור טרנסגנית, ויישום שלה לחקר התפתחות הרבייה הגברית באורז (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: למד טרנספורמציה גנטית מבוססת Agrobacterium באורז (Oryza sativa) ליצירת קווים זכריים-עקרים באמצעות CRISPR-Cas9. שיטה זו מדגימה עריכת גנים יעילה לשיפור גידולים ולמחקר ביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להכיר Xiaofei חן למתן תפלות אורז צעיר וסיוע בהפיכה את תרבות רקמת האורז בינוני. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31900611).

1. sgRNA-CAS9 צמח ביטוי וקטור בנייה וקטורית אגרובקטריום-תיווך טרנספורמציה
<ol><li>היעד גן סטרילי זכר OsABCG15 באורז על פי הספרות שפורסמה28.</li>
	<li>עיצוב sgRNA עבור האתר המיועד הממוקם בין 106-125 bp ב exon השני של OsABCG15 (איור 1).</li>
	<li>השתמש T4 פולינוקלאוטיד קינאז כדי לסנתז את האוליגוס sgRNA (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3' ו 5 sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCTTGAGAGAGGTGCTT').</li>
	<li>השתמש אנדונוקלאז BbsI לעכל את וקטור עמוד השדרה psgR-Cas929.</li>
	<li>לדגדג את האוליגוס sgRNA מסונתז עם עמוד השדרה של PSGR-Cas9 ליניארי באמצעות ליגאז T4 בעקבות פרוטוקול היצרן.</li>
	<li>באמצעות HindIII /EcoRI, לעכל את קלטת sgRNA מ שלב 1.5 ואת subclone לתוך האתר הינדי /EcoRI של וקטור בינארי pCAMBIA1300 עבורטרנספורמציה יציבה 29.</li>
	<li>אשר את הפלסמיד הבנוי על ידי עיכול אנזימים ודיון. מאוחר יותר, להפוך את המבנה הבינארי לתוך tumefaciens אגרובקטריום זן EHA105 ולגדל אותם על לוחות בחירה Kan / Rif ב 28 ° C במשך 2-3 ימים.</li>
</ol>2. טרנספורמציה גנטית אורז ותרבות רקמת הצמח
<ol><li>אינדוקציה והתחדשות קוס הערה: השתמשו בתפלות אורז צעירות טריות כחומר ההתחלתי כדי לגרום לטלוס (איור 2).<ol>
<li>לאסוף את התפלות הצעירות מתוך שדה האורז או הבית הירוק בשלב meiosis, נקבע על ידי אורך floret של 1.6-4.8 מ"מ(איור 2A)29. ודא כי תפלת האורז מכוסה בפנס עלה. מנגבים כל תסיסה עם 70% דגימת אלכוהול ולתת לו להתייבש לפני החיתוך.</li>
		<li>הביאו את התסיסה לספסל סטרילי נקי. חותכים אותו לחתיכות קטנות (קטן יותר טוב) עם מספריים עיקור ולאחר מכן להעביר חתכים לצלחת פטרי המכיל NBD2 בינוני(איור 2B, טבלה 1).</li>
		<li>דגירה את הצלחת בחושך ב 26 ° C במשך כ 10-14 ימים כדי לגרום מנוסה (איור 3A). הערה: השתמש בטלוס החדש שנוצר עבור חדירת אגרובקטריום (שלב 2.2.7) ישירות או recondition פעם נוספת במדיום NBD2 טרי כדי להשיג תבלות יותר. מעבירים את ההתקשרות למדיום NBD2 החדש כל 8-10 ימים.</li>
	</ol></li>
	<li>טרנספורמציה וטיפוח-שותף<ol>
<li>השתמש בחיידקים של א. tumefaciens המכילים את הפלסמיד הבינארי מ- 1.6 לטרנספורמציה. אחסן את הזנים A. tumefaciens במדיום YEB (טבלה 1) עם 50% גליטרול ב -80 °C לשימוש נוסף.</li>
		<li>פס A. tumefaciens מ -80 ° C גליצטרול מלאי לYEB אגר בינוני המכיל אנטיביוטיקה סלקטיבית(טבלה 1) ולגדולב 25-28 ° C עבור 48-72 שעות, כדי לאפשר למושבות להופיע.</li>
		<li>לחסן מושבה אחת מצלחת YEB עם אנטיביוטיקה סלקטיבית 5 מ"ל של נוזל YEB בינוני המכילאת אותה אנטיביוטיקה סלקטיבית (טבלה 1),ב 50 מ"ל צינור סטרילי חוטי. לנער על שייקר מסלולית ב 250 x g g, ב 25-28 ° C עד חיידקים לגדול OD600 של 0.5.</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של מתלים חיידקיים 100 מ"ל של YEB בינוני (שולחן 1) עם אותו אנטיביוטיקה סלקטיבית בקבוקון חוטי 250 מ"ל ולנער על שייקר מסלולית ב 250 x גרם, ב 28 מעלות צלזיוס עבור 4 שעות.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 4,000 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף חיידקים. זרוק את הסופרנטנט.</li>
		<li>תוסתה מחדש את הגלולה החיידקית עם AAM-AS בינוני(טבלה 1) ודללאת המתלים ל- OD600 = 0.4. הערה: מנת ה-OD המושלמת של מתלים חיידקיים היא קריטית לשינוי יעיל. זה עוזר בחיסול עודף צמיחה חיידקים על ההתפתלויות.</li>
		<li>לאסוף סביב 150 בריא גדל בהיר צהוב בהיר שביר קלי עוברי מ שלב 2.1.3 לתוך בקבוק סטרילי 150 מ"ל. מוסיפים 50-75 מ"ל מתלי תאים חיידקיים מ-2.2.6 לבקבוק הסטרילי, ולאחר מכן מוסיפים כ-10-25 מ"ל בינוני AAM-AS טרי כדי לטבול את הקלי במשך 10-20 דקות, רועד מדי פעם.</li>
		<li>לשפוך את המתלים חיידקים מהבקבוקון בזהירות לייבש את המתלים חיידקים עודף מן הקלווס באמצעות נייר סינון סטרילי #1 נייר טישו. לאחר מכן מניחים אותם על צלחת פטרי עם NBD-AS בינוני(שולחן 1)מכוסה נייר סינון סטרילי #1. דגירה ב 25-28 ° C בחושך במשך 3 ימים ולבדוק אם חיידקים overgrowth.</li>
	</ol></li>
	<li>בחירה עבור תלת עמידים<ol>
<li>לאחר 3 ימים של טיפוח-שותף, מעבירים את הקלי לצלחת פטרי סטרילית עם נייר סינון סטרילי.</li>
		<li>ייבש את ה-calli במשך 2 שעות על ספסל נקי. ודא שההתקשרות אינה דבקה בנייר המסנן.</li>
		<li>להעביר את הקלי באופן שווה באמצעות פינצטה סטרילית לבחירה העיקרית בינוני NBD2 (עם 40 מ"ג / L hygromycin ו 250 מ"ג / L טזמן)(טבלה 1). תרבות קאלי במשך 2 שבועות ב 25-28 ° C בחושך.</li>
		<li>לאחר 2 שבועות, להעביר calli באופן שווה לצלחת חדשה המכילה בחירה טרי בינוני NBD2 (עם 40 מ"ג / L hygromycin ו 250 מ"ג / L timentin)(טבלה 1). תרבות ה-calli לעוד שבועיים ב 25-28 מעלות צלזיוס בחושך.</li>
	</ol></li>
	<li>בדיל ים<ol>
<li>להעביר כבלים בינוני MS טרי (עם 25 מ"ג / L hygromycin ו 150 מ"ג / L טזמן)(שולחן 1). תרבות תחת האור ב 25-28 מעלות צלזיוס במשך כ 2 שבועות.</li>
		<li>חזור על שלב 2.4.1 פעם נוספת.</li>
		<li>להעביר את ניצני לירות למדיום MS החדש (עם 10 מ"ג / L hygromycin) כדי להתרבות יורה יותר.</li>
	</ol></li>
	<li>אינדוקציה שורש<ol>
<li>להעביר את הצילומים החדשים לתוך 1/2 MS מדיום(טבלה 1). תרבות תחת האור ב 25 ° C - 28 °C. הצמחים שהשתנו מייצרים שורשים בתוך שבועיים.</li>
		<li>לאחר שבוע, להעביר את הצמחים סירים נקיים המכסים את הצמח כדי למנוע התייבשות.</li>
	</ol></li>
</ol>3. זיהוי גנוטיפ
<ol><li>לאסוף עלים צעירים מצמחים חדשים שנוצרו עבור הפקת DNA הכולל באמצעות צטילטרימתיל אמוניום ברומיד (CTAB)שיטה 31.</li>
	<li>באמצעות ה-DNA הגנומי כתבנית, בחר את פריימרים (Hygromycin-F: 5' GATGTTGGCGACCTCGCGTATT 3' והיגרומיצין-R: 5' CGAAGACTCTCGTCTCTCTCA 3' הממוקם באזור Hygromycin) כדי לבצע תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי לאמת את האינטגרציה הטרנסיתותדרים (איור 4). תנאי ה-PCR הבאים: 94 °C למשך 5 דקות; 36 מחזורים (94°C ל-30 שניות; 56°C ל-30 שניות; 72°C למשך דקה אחת); 72°C ל-7 דקות. תגובות PCR מוצלחות מניבות 604 bp amplicon.</li>
	<li>בצע PCR אחר כדי להגביר את האזור הגנומי המקיף את אתרי היעד CRISPR באמצעות פריימרים ספציפיים (OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCTCTCTCTCAACAGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT 3' ו- OsABCG15-ID-R: 5' TTGGTGTTTATTAACATTGCTAT 3') כדי לזהות את הגנוטיפ של הטרנספורמטורים. תנאי ה- PCR זהים לתנאים בשלב 3.2.</li>
	<li>השתמש בשברי PCR ממדרגה 3.3 ישירות ל-Sanger כדי לזהות מוטציות.</li>
</ol>4. שים לב לפנוטיפ הבסיסי של המוטנט
<ol><li>להכין את פתרון I2-KI: להמיס 2 גרם של KI (אשלגן יודיד) ב 10 מ"ל של מים מזוקקים ולאחר מכן להוסיף 0.2 גרם של I2 (יוד resublimed) בזה. לאחר ערבוב, להביא את הנפח הכולל 100 מ"ל עם מים מזוקקים.</li>
	<li>הכינו את פתרון ה-FAA (63% אתנול אנידרי, 5% חומצה אצטית קרחונית, 5% פורמלדהיד ו-27% מים) ומערבבים לפני השימוש.</li>
	<li>הכינו את תמיסת הכתמים הכחולה טולואידין 0.5% : להמיס 0.5 גרם של טולואידין כחול ב 100 מ"ל של מים מזוקקים.</li>
	<li>לבצע תצפית פנוטיפית צמחית, על ידי הדמיה צמחים שלמים עם מצלמה דיגיטלית.</li>
	<li>לבצע תצפית פנוטיפ רבייה, להסיר את הפלאה והלמה מן floret. צלם תמונות של אנשים שלמים תחת סטריאומיקרוק.</li>
	<li>שים לב לכדאיות האבקה על ידי כתמי יוד.<ol>
<li>לקטוף קוצים אורז בוגרים לפני אנתזה פרח, להסיר את הפלאה והלמה כדי לשחרר את anthers.</li>
		<li>קח 6 anthers ולמקם אותם על מגלשת זכוכית. מוסיפים טיפה אחת של מים מזוקקים, מועצים את באר האנתר עם פינצטה כדי לשחרר את גרגרי האבקה, ולאחר מכן מוסיפים 2-3טיפות של תמיסתI 2 -KI. תכסה עם כיסוי.</li>
		<li>שים לב תחת מיקרוסקופ הגדלה נמוכה. גרגרי אבקה צבועים בשחור להראות קתנות נמרצת יותר, אין צבע או צהוב חום צבועים מעוכב או מנוון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ביצוע קטע דק למחצה של את'ר אורז<ol>
<li>לתקן את פרחי האורז בשלבים התפתחותיים שונים לפתרון FAA. שואבים את החומרים ב-4°C (בדרך כלל 15 דקות) כדי לאפשר למתקן לחדור לרקמות עד שהחומר שוקע לתחתית בקבוק האיסוף.</li>
		<li>החלף בפתרון FAA חדש למחרת. ברגע שהחומר שוקע לתחתית, החלף ב-70% אתנול ואחסן ב-4°C לשימוש לטווח ארוך.</li>
		<li>מייבשים את החומרים עם מעברי צבע שונים של אתנול (70%, 80%, 95% בכל פעם במשך 30 דקות, 100% אתנול ל-2 שעות, 100% אתנול המכיל מעט צבע ספראנין למשך 2 שעות). הערה: להוסיף קצת צבע Safranin לתוך השני 100% אתנול לצבוע את anthers עבור מקטע קל יותר לאחר מכן.</li>
		<li>בצע הטבעה על-ידי ביצוע הוראת היצרן (טבלת חומרים). לאחר מכן, אופים בתנור ב-60 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות לפני המקטע.</li>
		<li>מקטע את הדגימה לעובי של 2 μm באמצעות microtome. מוסיפים טיפת מים על מגלשת הזכוכית. לאחר מכן, להרים את החלקים הדקים המכילים בלוקים anther על ידי מפס ולשים אותם על פני השטח של טיפת המים על המגלשות.</li>
		<li>מניחים את המגלשות על אמבט המים ב-50°C כדי להפיץ את החלקים לחלוטין כדי לאפשר לה לדבוק ביציבות בשקופית.</li>
		<li>השתמש 0.5% טולואידין כחול פתרון להכתים את השקופיות במשך 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף עם מים ויבש בכסה המנוע אדים. אטום עם דבק עץ נייטרלי. מניחים בעדינות כיסוי על המגלשה ומתייבשים בכיסוי האדים.</li>
		<li>צפה וצלם את הדגימה תחת מיקרוסקופ.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>FAO. FAO statistical yearbook, World Food and Agriculture. Rome. ISBN 978-92-5-107396-4. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fao.org/3/i3107e/i3107e.pdf">http://www.fao.org/3/i3107e/i3107e.pdf</a> (2013).</li>
<li>FAO. The future of food and agriculture: Trends and challenges. Rome. ISBN 978-92-5-109551-5. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fao.org/3/a-i6583e.pdf">http://www.fao.org/3/a-i6583e.pdf</a> 109551-109555 (2017).</li>
<li>Izawa, T., Shimamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Becoming+a+model+plant%3A+The+importance+of+rice+to+plant+science%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Becoming a model plant: The importance of rice to plant science.</a> Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).</li>
<li>Shimamoto, K., Kyozuka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+as+a+model+for+comparative+genomics+of+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Rice as a model for comparative genomics of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).</li>
<li>Selva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+breeding+in+wheat%3A+how+shaping+floral+biology+can+offer+new+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives.</a> Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).</li>
<li>Lippman, Z. B., Zamir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosis%3A+revisiting+the+magic%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Heterosis: revisiting the magic.</a> Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).</li>
<li>Zhang, D., Liang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+food+security%3A+using+male+fertility+for+hybrid+seed+breeding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding.</a> Science. , 45-48 (2016).</li>
<li>Masters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-Mediated+Immature+Embryo+Transformation+of+Recalcitrant+Maize+Inbred+Lines+Using+Morphogenic+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (156), e60782(2020).</li>
<li>Laurenceau, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+type+IV+pilus+mediates+DNA+binding+during+natural+transformation+in+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473(2013).</li>
<li>Tzfira, T., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+of+plants%3A+biology+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).</li>
<li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+in+the+genomics+age%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium in the genomics age.</a> Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).</li>
<li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).</li>
<li>Hiei, Y., Komari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+rice+using+immature+embryos+or+calli+induced+from+mature+seed%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed.</a> Nature Protocols. 3 (5), 824(2008).</li>
<li>Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transformation+of+rice+%28Oryza+sativa+L.%29+mediated+by+Agrobacterium+and+sequence+analysis+of+the+boundaries+of+the+T-DNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.</a> The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).</li>
<li>Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+rice+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).</li>
<li>Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2796(2006).</li>
<li>Yara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+transgenic+japonica+rice+%28Oryza+sativa%29+cultivar%2C+Taichung+65%2C+by+the+Agrobacterium-mediated+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method.</a> Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).</li>
<li>Cho, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transformation+of+Korean+rice+cultivars+%28Oryza+sativa+L.%29+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens.</a> Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).</li>
<li>Toki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).</li>
<li>Zhang, J., Xu, R. j, Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+elite+indica+and+japonica+rice+cultivars%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars.</a> Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).</li>
<li>Aldemita, R. R., Hodges, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transformation+of+japonica+and+indica+rice+varieties%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties.</a> Planta. 199 (4), 612-617 (1996).</li>
<li>Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+plant+production+mediated+by+Agrobacterium+in+indica+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice.</a> Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).</li>
<li>Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+efficient+transformation+and+regeneration+of+diverse+indica+rice+cultivars%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars.</a> Plant Methods. 7 (1), 49(2011).</li>
<li>Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice+cv.+Rojolele%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).</li>
<li>Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+Javanica+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice.</a> Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).</li>
<li>Bortesi, L., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas9+system+for+plant+genome+editing+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond.</a> Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+japonica+photo-sensitive+genic+male+sterile+rice+lines+by+editing+carbon+starved+anther+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415(2016).</li>
<li>Qin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCG15+encodes+an+ABC+transporter+protein%2C+and+is+essential+for+Post-Meiotic+anther+and+pollen+exine+development+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice.</a> Plant and Cell Physiology. 54, (2013).</li>
<li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+CRISPR-Cas+system+for+efficient+genome+engineering+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants.</a> Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).</li>
<li>Itoh, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+plant+development%3A+from+zygote+to+spikelet%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rice plant development: from zygote to spikelet.</a> Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).</li>
<li>Gawel, N. J., Jarret, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+CTAB+DNA+extraction+procedure+forMusa+andIpomoea%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).</li>
<li>Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. iC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Consortium+of+Rice+Mutagenesis%3A+resources+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Rice%22%5BJournal%5D)">International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond.</a> Rice. 6 (1), 39(2013).</li>
<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+plants+using+a+CRISPR%2FCas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system.</a> Cell Research. 23 (10), 1229(2013).</li>
</ol>

מוטנטים סטריליים גבריים מלאכותיים נוצרים באופן מסורתי על ידי מוטגנזה פיזית, כימית או ביולוגית אקראית. למרות שאותם טכניקות רבות עוצמה, טבעם האקראי לא מצליח לנצל את הכמות העצומה של ידע גנומי מודרני בעל פוטנציאל לספק שיפורים מותאמים אישית ברבייה מולקולרית32. מערכת CRISPR-Cas9 שימשה באופן נרחב בצמחים בשל האמצעים הפשוטים והמשתלמים שלה כדילתמרן ולערוך DNA 29,33; יש לו פוטנציאל לחסוך זמן בהשוואה לשיטות mutagenesis מסורתיות.
<p class="jove_con...

אורז הוא יבול המזון החשוב ביותר, במיוחד במדינות מתפתחות, ומייצג מזון בסיסי עבור יותר ממחצית מאוכלוסיית העולם. בסך הכל, הביקוש לדגן אורז גדל והוא צפוי לגדול ב-50% עד 2030 ו-100% עד 20501,,2. שיפורים עתידיים בתפוקת אורז יצטרכו לנצל משאבים מולקולריים וגנטיים מגוונים ש הופכים את האורז למודל מצוין למחקר צמחים מונוקוטלדונים. אלה כוללים מערכת טרנספורמציה יעילה, מפה מולקולרית מתקדמת, ומסד נתונים נגיש לציבור של תגי רצף מבוטאים, אשר נוצרובמשך שנים רבות 3,4. אסטרטגיה אחת לשיפור תפוקת היבול היא ייצורזרעים היברידיים 5, מרכיב מרכזי שבו היא היכולת לתמרן את הפוריות הגברית. הבנת השליטה המולקולרית של פוריות הגבר בגידולי דגנים יכולה לעזור לתרגם ידע מפתח לטכניקות מעשיות כדי לשפר את ייצור הזרעים היברידיים ולשפראת פרודוקטיביות היבול 6,7.
טרנספורמציה גנטית היא כלי מפתח למחקר בסיסי וחקלאות מסחרית שכן היא מאפשרת הכנסת גנים זרים או מניפולציה של גנים אנדוגניים בצמחי יבול, ותוצאות יצירת קווים מהונדסים גנטית. פרוטוקול טרנספורמציה מתאים יכול לעזור להאיץ מחקרים גנטיים ומולקולריים ביולוגיה להבנה בסיסית של ויסותגנים 8. בחיידקים, טרנספורמציה גנטית מתרחשת באופן טבעי; עם זאת, בצמחים, הוא מבוצע באופן מלאכותי באמצעות טכניקות ביולוגיהמולקולרית 9,10. אגרובקטריום tumefaciens הוא קרקע נישאת, חיידק גראם שלילי הגורמים למחלת מרה הכתר בצמחים על ידי העברת T-DNA, אזור של Ti plasmid שלה, לתוך תא הצמח באמצעות מערכת הפרשת סוגIV 11,12. בצמחים, A. tumefaciens-תווך טרנספורמציה נחשבת שיטה נפוצה לשינוי גנים כי זה מוביל יציב ושילוב מספר עותק נמוך של T-DNA לתוך הגנוםהמארח 13. אורז טרנסגני נוצר לראשונה באמצעות טרנספורמציהגנטית מתווכת אגרובקטריום באמצע שנות ה־90 של המאה ה־20, ב־japonica cultivar14. באמצעות פרוטוקול זה, מספר קווים טרנסגניים הושגו בתוך תקופה של 4 חודשים עם יעילות טרנספורמציה של 10%-30%. המחקר הצביע על כך שיש שני צעדים קריטיים לטרנספורמציה המוצלחת: האחד הוא אינדוקציה של תרכובת עוברית מזרעים בוגרים והשנייה היא תוספת של acetosyringone, תרכובת פנולית, לתרבות החיידקית במהלך טיפוח שותף, המאפשר יעילות טרנספורמציה גבוהה יותר בצמחים14,15. פרוטוקול זה שימש בהרחבה עם שינויים קלים japonica16,17,,18,19, כמו גם cultivars אחרים כגון indica20,21,22,,23 ו japonica טרופי,24,25. ואכן, מעל 80% מהמאמרים המתארים את טרנספורמציה אורז להשתמש אגרובקטריום-מתווכים שינוי גן ככלי13. עד כה פותחו מספר פרוטוקולי טרנספורמציה גנטית באמצעות זרעי אורז כחומר התחלתי לאינדוקציה16,,17,,18,,19. עם זאת, מעט מאוד ידוע על תפרה צעירה כמו explants לייצור יבלות. בסך הכל, חשוב להקים פרוטוקול מהיר, לשחזור ויעיל של שינוי גנים והתחדשות עבור גנומיקה תפקודית ומחקרים על שיפור היבול.
בשנים האחרונות, ההתקדמות של טכנולוגיית CRISPR-Cas9 הביאה מנגנון עריכה גנומי מדויק כדי להבין את תפקוד הגנים ולספק שיפורים חשובים אגרונומית לגידולצמחים 26,27. CRISPR מציע גם הבטחה ניכרת למניפולציה של התפתחות הרבייה הגברית וייצור היברידי. במחקר זה, השתמשנו במערכת נוקאאוט גנים באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9 והכנסנו אותה לפרוטוקול יעיל של שינוי גן אורז באמצעות תפלות צעירות כהסברים, ובכך יצרנו קווים סטריליים יציבים לחקר התפתחות הרבייה.

<table><tbody><tr><td>1-חומצה נפתלינאצטית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0640</td><td></td></tr><tr><td>2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7299</td><td></td></tr><tr><td>6-Benzylaminopurine (6-BA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>B3408</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10000561</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום גופרתי</td><td>סינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td>10002918</td><td></td></tr><tr><td>אנאורין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T4625</td><td></td></tr><tr><td>אתנול נטול מים</td><td>סינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>פפטון בקטריולוגי</td><td>סנגון ביוטק</td><td>A100636</td><td></td></tr><tr><td>תמצית בקר</td><td>סנגון ביוטק</td><td>A600114</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10004808</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט</td><td>סינופארם מגיב כימי ושות', בע"מ</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>קזאין חומצה הידרוליזט</td><td>בייג'ינג XMJ מדעי ושות', בע"מ</td><td>C184</td><td></td></tr><tr><td>קובלט (II) כלוריד הקסהידראט</td><td>סינופארם מגיב כימי ושות', בע"מ</td><td>10007216</td><td></td></tr><tr><td>נחושת (II) סולפט פנטהידראט</td><td>סינופארם ריאגנט כימי ושות', בע"מ</td><td>10008218</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-גלוקוז נטול מים</td><td>סינופארם ריאגנט כימי ושות', בע"מ</td><td>63005518</td><td></td></tr><tr><td>D-סורביטול</td><td>סינופארם ריאגנט כימי ושות 'בע"מ</td><td>63011037</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, מלח דיסודיום, דיהידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>EOS מצלמות SLR דיגיטליות ומצלמות מערכת קומפקטיות</td><td>Canon</td><td>EOS 700D</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>סינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td>10010018</td><td></td></tr><tr><td>אוטומטי לחלוטין סיבובי מיקרוטום</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica RM 2265</td><td></td></tr><tr><td>קרחון חומצה אצטית</td><td>סינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td>10000208</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td>62011516</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>בייג'ינג XMJ מדעי ושות', בע"מ</td><td>H370</td><td></td></tr><tr><td>אינוזיטול</td><td>סינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td>63007738</td><td></td></tr><tr><td>יוד</td><td>סינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td>10011517</td><td></td></tr><tr><td>ברזל (II) סולפט הפטהידראט</td><td>סינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td>10012116</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>בייג'ינג XMJ מדעי ושות', בע"מ</td><td>K378</td><td></td></tr><tr><td>קינטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>K0753</td><td></td></tr><tr><td>L-ארגינין</td><td>סינופארם מגיב כימי ושות', בע"מ</td><td>62004034</td><td></td></tr><tr><td>L-חומצה אספרטית</td><td>סינופארם מגיב כימי ושות', בע"מ</td><td>62004736</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>בייג'ינג XMJ מדעי ושות', בע"מ</td><td>G229</td><td></td></tr><tr><td>L-פרוליין</td><td>בייג'ינג XMJ מדעי ושות', בע"מ</td><td>P698</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט הפטהידראט</td><td>סינופארם ריאגנט כימי ושות', בע"מ</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>מנגן גופרתי מונוהידראט</td><td>סינופארם מגיב כימי ושות', בע"מ</td><td>10013418</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופים</td><td>NIKON</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Phytotech</td><td>M519</td><td></td></tr><tr><td>חומצה ניקוטינית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>N0765</td><td></td></tr><tr><td>פיטגל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סינופארם מגיב כימי ושות', בע"מ</td><td>10016308</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן דימימן פוספט</td><td>סינופארם מגיב כימי ושות', בע"מ</td><td>10017608</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן יודיד</td><td>סינופארם מגיב כימי ושות', בע"מ</td><td>10017160</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן חנקתי</td><td>סינופארם מגיב כימי ושות', בע"מ</td><td>1001721933</td><td></td></tr><tr><td>פירידוקסין הידרוכלוריד (B6)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>47862</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>בייג'ינג XMJ מדעי ושות', בע"מ</td><td>R501</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>סינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>נתרן מוליבדט דיהידראט</td><td>סינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td>10019816</td><td></td></tr><tr><td>סטריאו מיקרוסקופים</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica M205 A</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סינופארם ריאגנט כימי ושות', בע"מ</td><td>10021418</td><td></td></tr><tr><td>ערכות הטמעה של טכנוביט 7100</td><td>Heraeus Teknovi, גרמניה</td><td>14653</td><td></td></tr><tr><td>Timentin</td><td>בייג'ינג XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>T869</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים לקטעי פרפין</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica HI1210</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>Sangon Biotech</td><td>A515245</td><td></td></tr><tr><td>אבץ גופרתי heptahydrate</td><td>סינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td>10024018</td><td></td></tr></tbody></table>

אגרובקטריום -תווךטרנספורמציה גנטית, ייצור טרנסגנית, ויישום שלה לחקר התפתחות הרבייה הגברית באורז

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

עקירת הזכר היא תכונה אגרונומית חשובה לייצור זרעים היברידיים המאופיינת בדרך כלל על ידי פגמים פונקציונליים באיברי רבייה/גימטים גבריים. ההתפתחויות האחרונות בטכנולוגיית עריכת הגנום CRISPR-Cas9 מאפשרות יעילות עריכה גבוהה ומוטציות נוקאאוט מצילות זמן של גנים של מועמדים אנדוגניים באתרים ספציפיים. בנוסף, אגרובקטריום-מתווכים טרנספורמציה גנטית של אורז היא גם שיטת מפתח לשינוי גנים, אשר אומצה באופן נרחב על ידי מעבדות ציבוריות ופרטית רבות. במחקר זה, יישם CRISPR-Cas9 כלי עריכת הגנום ויצרנו בהצלחה שלושה קווי מוטציה סטרילי זכר על ידי עריכת גנום ממוקד של OsABCG15 ב cultivar japonica. השתמשנו בשיטת שינוי אגרובקטריום-מתווכת אורז שיכול לספק אמצעים מצוינים של סירוס גנטי לייצור זרעים היברידיים באורז. צמחים טרנסגניים ניתן להשיג בתוך 2-3 חודשים וטרנספורמטורים הומוזיגים הוקרן על ידי genotyping באמצעות ההגדלה PCR ו רצף סנגר. אפיון פנוטיפי בסיסי של קו הומוזיגוס סטרילי זכר בוצע על ידי תצפית מיקרוסקופית של איברי הרבייה זכר האורז, ניתוח קיימות אבקה על ידי יוד אשלגן יודיד (I2-KI) מכתים חצי דק חתך של anthers מתפתח.

הוכח כאן הוא השימוש בטכנולוגיית עריכת גנים כדי ליצור קו סטרילי זכר למחקר עתידי על ידי אגרובקטריום-מתווכים טרנספורמציה גנטית באורז. כדי ליצור את הקו הסטרילי הגברי של osabcg15, CRISPR-CAS9-בתיווך mutagenesis שימש לבנייה וקטורית בינארית. SgRNA היה מונע על ידי היזם OsU3, בעוד קלטת הביטוי של hSpCas9 היה מונע על ידי מקדם 35S כפול, ואת הווקטור האמצעי הורכב pCAMBIA1300 וקטור בינארי יחיד תוכנן עבור אגרובקטריום-מתווכים טרנספורמציה יציבה של אורז. ייצוג גרפי של המבנה ששימש עבור CRISPR/Cas9-בתיווך ...

עבודה זו מתארת את השימוש בטכנולוגיית עריכת הגנום CRISPR-Cas9 כדי נוקאאוט גן אנדוגני OsABCG15 ואחריו Agrobacterium שונה-פרוטוקול טרנספורמציה בתיווך לייצר קו זכר סטרילי יציב באורז.

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

תפרחות צעירות כמו explant לייצור callus חשובים לביסוס טרנספורמציה גנים מהירה ויעילה ושיטת התחדשות לחשיפת תפקוד הגנים, כמו גם לשיפור היבול. תפרחות צעירות כמו explant לייצור callus חשובים לביסוס טרנספורמציה גנים מהירה ויעילה ואת שיטת ההתחדשות לחשיפת תפקוד הגנים. הדגמת וידאו של טכניקה זו תסייע לצופה להבין את תהליך השמירה על החומרים כדי לייצר את היישור הטרנסגני הרצוי מבלי לבזבז זמן ומאמץ.התחל על ידי איסוף תפרחות אורז צעירות מהשדה אורז או חממה בשלב meiosis, לוודא שהם מכוסים נדן עלה. מנגבים כל תפרחת עם ספוגית של 70% אלכוהול ותנו לה להתייבש לפני החיתוך. מביאים את תפרחת לספסל מעבדה סטרילי וחותכים אותו לחתיכות קטנות עם מספריים מעוקרים, ואז מעבירים את החתכים לצלחת פטרי המכילה מדיום NBD2.הדגירה את הצלחת בחושך ב 26 מעלות צלזיוס במשך 10 עד 14 ימים כדי לגרום קאלוס. כדי לבצע טרנספורמציה, להעביר מושבה אחת מצלחת EB לבן עם אנטיביוטיקה סלקטיבית לחמישה מיליליטר של מדיום YEB נוזלי המכיל את אותה אנטיביוטיקה במבחנה סטרילית חרוטית 50 מיליליטר. לנער את הצינור על שייקר מסלולית ב 250 פעמים g ו 25 כדי 28 מעלות צלזיוס עד חיידקים לגדול OD 600 של 0.5.הוסף מיליליטר אחד של השעיה חיידקית ל 100 מיליליטר של מדיום YEB עם אותה אנטיביוטיקה סלקטיבית בבקבוק חרוט 250 מיליליטר לנער את הבקבוק על שייקר מסלולית ב 250 פעמים g ו 28 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות. צנטריפוגה התרבות ב 4, 000 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את החיידקים. השלך את supernatant ו resuspend את גלולה עם AAM כבינוני, ולאחר מכן לדלל את ההשעיה ל OD 600 של 0.4.לאחר הדגירה, לאסוף סביב 150 קאלי עוברי צהוב בהיר בריא לתוך בקבוק סטרילי 150 מיליליטר. הוסף 50 עד 75 מיליליטר של ההשעיה תא חיידקי לתוך הבקבוק ולאחר מכן להוסיף 10 עד 25 מיליליטר של טרי AAM כבינוני לטבול את קאלי במשך 10 עד 20 דקות, רועד מדי פעם. יוצקים את ההשעיה החיידקית מתוך הבקבוק בזהירות ומייבשים את הקאלי בנייר מסנן סטרילי, ואז מניחים אותם על צלחת פטרי עם NBD AS בינוני ומכסים אותם בנייר סינון.דגירה קאלי ב 25 עד 28 מעלות צלזיוס בחושך במשך שלושה ימים, בדיקת אותם עבור צמיחת יתר חיידקית. לאחר שלושה ימים של טיפוח שותף, מעבירים את הקאלי לצלחת פטרי סטרילית באמצעות נייר סינון, ואז מייבשים אותם באוויר במשך שעתיים על ספסל נקי. ודא שהקאלי אינם דבקים בנייר הסינון והעבר אותם לבינונית הבחירה הראשית NBD2.לאחר שבועיים, להעביר את קאלי באופן שווה לצלחת חדשה המכילה מדיום בחירה טרי, ולאחר מכן להעביר את קאלי למדיום טרשת נפוצה טרי עבור בידול ואת ניצני לירות למדיום MS עם 10 מיליגרם לליטר Hygromycin להתרבות יורה יותר. העבר את היורה החדש לתוך חצי MS בינוני עבור אינדוקציה שורש ותרבות אותם תחת אור ב 25 עד 28 מעלות צלזיוס. הצמחים שהשתנו צריכים לייצר שורשים בתוך שבועיים.כדי לבצע תצפית פנוטיפ הרבייה, להסיר את פלאה ולמה מן הפרחוני ותמונה anthers כולו תחת מיקרוסקופ סטריאו. כדי לבחון את הכדאיות אבקה, לבחור קוצים אורז בוגרת לפני אנתזת הפרח ולהסיר את פלאה ו lemma לשחרר את anthers. קח שישה אנתרים והצב אותם על מגלשת זכוכית.מוסיפים טיפה אחת של מים מזוקקים, מוחצים את האנטר עם פינצטה כדי לשחרר את גרגרי האבקה, ואז מוסיפים שתיים עד שלוש טיפות של תווי יוד ומכסים בכיסוי. שים לב לשקופית תחת מיקרוסקופ הגדלה נמוכה. גרגרי אבקה צבועים בשחור מראים כדאיות נמרצת יותר בעוד דגנים ללא צבע או אלה צבועים חום צהוב הם ננסיים או מנוונים.כדי לבצע מיקרוסקופיה חתוכת רוחבית, השתמש בתותב כחול 0.5% toluidine כדי להכתים את השקופיות במשך 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם במים ולייבש אותם במכסה המנוע אדים. לאחר ייבוש, לאטום את השקופיות עם דבק עץ ניטרלי, בעדינות למקם כיסוי על השקופית ולייבש אותם ברדס אדים, ואז תמונה המדגם תחת מיקרוסקופ. פרוטוקול זה שימש ליצירת קו סטרילי זכר על ידי טרנספורמציה גנטית מתווך אגרובקטריום באורז.הקאלי העוברי שימש ישירות לשינוי או תת-תרבות להתרבות כדי להשיג יותר קאלי לזיהום נוסף. לאחר טיפוח שותף במשך 48 שעות, הקאלי הועברו לסיבוב שני של מדיום בחירה. לאחר 10 עד 14 ימים, הפך קאלי הראה microcalli שזה עתה נוצר בעוד קאלי untransformed הפך חום ומת.מאוחר יותר, קאלי בצבע בריא וקרמי הועברו למדיום התחדשות. הקאלי שהשתנתה הראתה בהדרגה כתמים ירוקים. כתמים ירוקים אלה היו מתורבתים במדיום התחדשות כדי לאפשר צמיחה לירות ולאחר מכן עבר חצי מדיום MS כדי לגרום לשורשים.מאוחר יותר נקצרו יריות גידול בריאות ונמרצות עם שורשים מפותחים. בסך הכל הושגו 21 שתילים מחדש. הגברה PCR עבור אזור Hygromycin הראה כי תדירות הטרנספורמציה היה כ 85.71%the transformants היו genotyped לזהות את המוטציות באתרי היעד sgRNA.בין 18 הצמחים המהודקים, שמונה קווים הטרוזיגים ושלושה קווים הומוזיגים היו CRISPR CAS9 חיובי. מוטנטים נוקאאוט הומוזיגוס אומתו על ידי התבוננות בסיסית איברי הרבייה הגבריים. אנת'רים של osabcg15 היו קטנים יותר חיוורים יותר מאלה של סוג הבר וחסר גרגרי אבקה בוגרת.מיקרוסקופיה חתך רוחבי בוצעה כדי לחקור את הפגמים מורפולוגיים אנתר ב osabcg15. בשלב 10, מיקרוספורים מסוג פראי הפכו עגולים בצורתם ו vacuolated עם exine מוכתם כחול כהה. לעומת זאת, המיקרו-ספרוס של osabcg15 התמוטט והתדרדר.בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב לוודא כי החומר שנאסף נמצא בשלב meiosis ולשלוט על זמן יובש האוויר של קאלי.

agrobacterium-mediated-genetic-transformation-transgenic-production

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: בירנינק, ב. מ. ואחרים. הזרקה ישירה של שתילי תירס באמצעות הזרקה של וירוס הפסיפס של זנב שועל רקומביננטי ושיבוטים זיהומים של וירוס פסיפס קנה הסוכר. J. Vis. Exp. (2021)הסרטון הזה מדגים את העברת שיבוטים ויראליים רקומביננטיים בתיווך אגרובקטריה לשתילי תירס לצורך השתקת גנים. הוא מתאר את תהליך זיהום האגרובקטרים , התפשטות וירוסית מערכתית ושינויים פנוטיפיים המונעים מהפרעות RNA.

העברת שיבוטים ויראליים רקומביננטיים בתיווך אגרובקטריום לשתילי תירס להשתקת גנים

בסרטון זה אנו מדגימים טרנספורמציה גנטית של גנום האורז באמצעות וקטור בינארי Agrobacterium tumefaciens. חיידק זה מאפשר העברה של פלסמיד DNA זר באמצעות חלבוני אלימות אגרובקטריום.

טרנספורמציה גנטית בתיווך אגרובקטריום: שיטה לשינוי גנטי של גנום האורז באמצעות גידולי אגרובקטריום מהונדסים גנטית

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים להפוך את תפוחי האדמה צמחים. הטרנספורמציה Agrobacterium tumefaciens מוביל צמח מהונדס מלאה בעוד Agrobacterium rhizogenes מייצרת הטרנסגניים שורשים שעירים יורה פראי סוג זה יכול להיות עצמי שעבר בירושה. אנחנו מכן לזהות יזם פעילות על-ידי גאס צביעת שורשים טרנספורמציה.

Agrobacterium tumefaciens , Agrobacterium rhizogenes-מתווכת טרנספורמציה של תפוחי אדמה, יזם פעילות של גן Suberin על ידי גאס Staining

גנים מורפולגניים הצמח יכול לשמש כדי לשפר את הטרנספורמציה גנטית של גנוטיפים הסרבן. המתואר כאן הוא Agrobacterium-תיווך הטרנספורמציה גנטית (quickcorn) פרוטוקול עבור שלושה חשובים הציבור תירס שורות.

Agrobacterium-תיווך המעבר העובר בלתי בוגר של הסרבן מתוך תירס שורות באמצעות גנים מורפולגניים

בגלל היישום הרב-תכליתי שלו כמין מודל בתחומי מחקר שונים, יש צורך בארגז כלים לשינוי גנטי בפלנטיין צר עלים (Plantago lanceolata).  כאן, באמצעות טרנספורמציה בתיווך Agrobacterium tumefaciens, מוצג פרוטוקול שמביא לקווים טרנסגניים יציבים עם יעילות טרנספורמציה של 20%.

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בטרנספורמציה בתיווך גידולים אגרובקטריום (AMT) לשילוב גנים בעלי עניין בגנום הגרעיני של המיקרו-אצות הירוקות Chlorella vulgaris, מה שמוביל לייצור טרנספורמנטים יציבים.

Agrobacterium tumefaciens-מתווך גנטי של מיקרו-אצות ירוקות, Chlorella vulgaris

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור יעיל של שורשים שעירים סויה מהונדסים.

טרנספורמציה של שורש סויה שעיר לניתוח תפקוד גנים

הפרוטוקול מתאר גידול זני אורז עמילן עמידים על ידי תכנון באמצעות טכנולוגיות עריכת גנום בצורה מדויקת, יעילה ופשוטה מבחינה טכנית.

גידול לפי תכנון לאורז פונקציונלי עם טכנולוגיות עריכת גנום

אנו מציגים פרוטוקול יעיל ואופטימלי לטרנספורמציה בתיווך אגרובקטריה של מין דו-חיים אל-מיני, Rorippa aquatica, ללא הליכים עתירי משאבים של תרבית רקמות סטריליות. באמצעות סמן טרנספורמציה חזותי וצינור התחדשות של הכדורים נוצרו בהצלחה טרנספורמנטים קרובים לשיבוטים, ובכך קידם את המחקרים העתידיים של הסתגלות הצמח לסביבה התת-ימית.

טרנספורמציה יעילה בתיווך אגרובקטריה מבוססת רגנרציה של מין דו-חיים א-מיני, Rorippa aquatica

בדיקת רגישות חזותית לטאות באמצעות פרדיגמה התניה אופרנטית המעסיקה וידאו השמעה אקראית של נקודה kinematograms ו ממוחשבת חסרי חוליות.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

למד טרנספורמציה גנטית מבוססת Agrobacterium באורז (Oryza sativa) ליצירת קווים זכריים-עקרים באמצעות CRISPR-Cas9. שיטה זו מדגימה עריכת גנים יעילה לשיפור גידולים ולמחקר ביולוגיה התפתחותית.

אגרובקטריום -תווךטרנספורמציה גנטית, ייצור טרנסגנית, ויישום שלה לחקר התפתחות הרבייה הגברית באורז

גלה סרטונים נוספים