תרבית רקמת קליפת המוח השחלות

פרוטוקול זה מאפשר בדיקה מקדימה מעמיקה של סביבת המיקרו השחלות. המאפשר למשתמשים לקבוע צמיחה והתפתחות זקיק, כמו גם steroidogenesis ושפע של מולקולות החיסון. יתרון אחד של טכניקה זו הוא היכולת להעריך ישירות שינויים בסביבת המיקרו השחלות וזקיקים מתעוררים ולהעריך את יחסי הגומלין הייחודיים הנגרמים על ידי תוספת של הורמונים ספציפיים.

טכניקה זו יכולה לשמש כדי ללמוד מגוון רחב של הפרעות רבייה גרימת מעצרים זקיקים. לדוגמה, תסמונת השחלות הפוליטיות. מכיוון שאנחנו יכולים להעריך ישירות את סביבת המיקרו השחלות במבחנה, מדגים את ההליך יהיה ברוק בל, חוקר לתואר ראשון מהמעבדה שלי.

בעזרת מלקחיים של לסתות, מאבטחים את השחלה, פורסים לשניים ומתחילים להסיר פרוסות חיצוניות. להבטיח כי לא יותר מעומק אחד עד שני מילימטר של פני השטח נחתך מן השחלה, כך שלא נאסף מדולה. חותכים שלוש עד ארבע רצועות דקות של קליפת המוח השחלתית עם אזמל ומניחים את הרצועות בצלחת פטרי השלישית במילוי PBS.

חותכים את הרצועות לחתיכות מרובעות קטנות של 0.5 למילימטר מעוקב אחד עם להב אזמל. השתמש בסרגל מתחת לצלחות פטרי כדי להבטיח את החלקים הם בגודל ועובי דומים כדי להפוך חתיכות קליפת המוח השחלות עקבי. לשטוף חתיכות קליפת המוח השחלות בכל שלוש PBS ואנטיביוטיקה שדה פטרי צלחות, באמצעות מלקחיים קצה מעוקלים כדי להעביר את החלקים בין שטיפות.

העבר חתיכות קליפת המוח דרך הסדרה של LB-15 שטיפות ומניחים אותם בצלחת פטרי סופית LB-15 מלא. תייג את המכסה עם תעודת זהות החיה והצד השחלות. לאסוף ארבע חתיכות קליפת המוח השחלות לכל שחלה ולתקן אותם ליום אפס היסתולוגיה ולהקפיא חתיכות נוספות לטיהור RNA.

השתמש חתיכות הרקמה הנותרות לתרבות. הכן ארון בטיחות ביולוגי לשטיפת רקמות סופית והכנת תרבות. לחטא אספקה עם 70% אתנול לפני הצבתם בארון הבטיחות הביולוגי.

העבר את כל חתיכות קליפת המוח השחלתית המיועדות לתרבות לארון הבטיחות הביולוגי ושטוף אותם שוב בצלחת פטרי מלאה LB-15. פיפט 350 מיקרוליטרים של מדיום Waymouth לכל באר לתוך צלחת תרבית רקמות 24 היטב. מקם את התרבות הלא מכווצת היטב מוסיף לתוך כל באר באמצעות מלקחיים לוודא כי אין בועות נוצרות מתחת לבסיס של להוסיף.

מקם בזהירות ובעדין ארבע חתיכות קליפת המוח השחלתית על הרשת של כל הוספה מבלי לנקב את הרשת. לדגור את הרקמה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. שנה את תרבית קליפת המוח השחלות מדי יום במשך שבעה ימים והקפידו להשתמש במדיום Waymouth שהתחמם מראש.

במהלך השינויים הבינוניים, השתמש במלקחיים כדי להרים בעדינות את ההחדרה מהבאר ולאסוף את המדיום Waymouth התרבותי בצינורות 0.5 מיליליטר. הגדר את ההוספה בחזרה לבאר ולהוסיף 350 microliters של מדיום תרבות טרי על ידי חלוקת אותו בין הצד של ההוספה ואת הבאר. לאחסן את המדיום שנאסף מתרבות הרקמות במינוס 20 מעלות צלזיוס.

לאחר שבעה ימים של תרבות, דמיין את חתיכות קליפת המוח השחלתית באמצעות מיקרוסקופ ניתוח עם מצלמה מחוברת ותוכנת הדמיה ממוחשבת. תקן שתי חתיכות קליפת המוח השחלתית לבאר בתמיסה של בוין להיסתולוגיה והקפאת הבזק לחתיכות קליפת המוח השחלתית בחנקן נוזלי כדי להשיג RNA עבור cDNA. חזור על שלב זה עבור כל בארות עם רקמה ואז לאסוף את המדיום מהיום השביעי ואחסנו אותו מינוס 20 מעלות.

אפשר לחתיכות קליפת המוח השחלתית להישאר שקוע בתמיסה של Bouin במשך כ 1.5 שעות, ולאחר מכן לשטוף אותם עם 70% אתנול שלוש פעמים, לשמור על הרקמה 70%אתנול ולנקות אותו מדי יום עד הפתרון כבר לא צהוב. המטוקסילין וכתם אאוזין בוצעו עבור זקיקים ראשוניים, זקיקים ראשוניים מוקדמים, זקיק ראשוני, זקיק משני וזקיק Antral. בימוי זקיק נערך על קליפת המוח השחלתית קבוע לפני ולעקוב אחר תרבות כדי להעריך פוליקולוגנזה.

ההבדל במורפולוגיה כפי שנקבע על ידי תצהיר קולגן יכול להצביע על פיברוזיס בקליפת המוח השחלות ממדרגות מדרגות או עפרות שליטה. השוואה של האזור הממוצע של כתמים חיוביים אדומים picrosirius לכל קליפת המוח השחלות מלא בין שליטה עריסות מדרגות מוצג כאן. האוסף היומי של מדיום תרבות היה מלוים במשך שלושה ימים כדי להעריך ייצור הורמון סטרואידים מגוונת, באמצעות radioimmunoassay.

מטבוליטים סטרואידים וייצור ציטוקינים נמדדו גם בתרבית קליפת המוח השחלתית מדיום מבאר אחת עבור כל חיה מצרפת במשך ארבעה ימים של תרבות. ככל שהרקמה יושבת יותר, כך קשה יותר לעבוד איתה. ייתכן שיהיה עליך לתרגל חתכים מדויקים.

טכניקה זו משמשת כדי להבין את ההשפעות על מסלולי טרנסדוקציה אות כדי להציל steroidogenesis עודף כדי לקבוע את ההשפעות של סטרואידים עודפים על ייצור ציטוקינים וכימוקין, כדי לקבוע את ההשפעות על התקדמות זקיק או מעצר בתוך רקמת השחלה.