Name: הדגמה של קומפלקסים הטרולוגיים שנוצרו על ידי חלבוני קרום מסוג III של תושב גולגי באמצעות בדיקת השלמה פיצול לוציפראז (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-10T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: חקור אינטראקציות בין חלבוני קרום מסוג III של תושב גולגי באמצעות בדיקת השלמה פיצול לוציפראז בתאי HEK293 חיים. שיטה רגישה זו מאפשרת זיהוי אינטראקציות ברמות ביטוי נמוכות מבלי לפגוע בתפקוד התא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מס ' 2016/23/D/NZ3/01314 מהמרכז הלאומי למדע (NCN), קרקוב, פולין.

1. דור הפלסמידים של הביטוי
<ol><li>בחן את טופולוגיית הממברנה של החלבונים המעניינים באמצעות כלי חיזוי טופולוגיה.</li>
	<li>תכנן את אסטרטגיית השיבוט כך שהשברים הגדולים והקטנים יותר יעמדו בפני הציטופלסמה ברגע שחלבוני ההיתוך הוכנסו לקרומי גולגי. אם, כמו במקרה המוצג כאן, הן N והן C-termini של חלבונים מעניינים מכוונים ציטופלסמית, תייג את החלבונים בשמונה דרכים אפשריות (ראה איור 1B). אם N- או C-terminus של אחד או שניהם חלבונים של עניין הוא מכוון זוהר, אל תכלול אותו תיוג.</li>
	<li>Subclone את הגנים של עניין לתוך וקטורים ביטוי מתאים (ראה רשימת חומרים) על ידי ביצוע פרוטוקולי שיבוט סטנדרטיים. הערה: מומלץ לבדוק את כל הכיוונים האפשריים, מכיוון שאפשרויות תיוג מסוימות עשויות שלא לפעול עקב קרבה לא מספקת, כיוון תת-אופטימלי או אילוצים מרחביים.</li>
</ol>2. טרנספקטיבה חולפת של הביטוי פלסמידים לתאים
<ol><li>לקצור את תרבית התא HEK293T דבק על ידי טריפסיניזציה ו resuspend התאים במדיום צמיחה מלא ייעודי. צלחת התאים (2 x 104/100 μL / טוב) על צלחת תחתית ברורה, צד לבן 96-well. התאם את המספר הכולל של הבארות כך שיתאימו לכל השילובים והפקדים שנבדקו, כולל עותקים משוכפלים. הערה: נסו להשתמש רק ב-60 הבארות הפנימיות של הצלחת כדי למזער את השינויים התרמיים ולהימנע מאידוי בן לילה. שימוש בלוחות מצופים פולי-D-ליזין מומלץ מאוד כגון אלה המצוינים בטבלת החומרים, אחרת תאים עשויים להתנתק במהלך שלבי הכביסה הבאים.</li>
	<li>תרבית את התאים לילה בתנאים סטנדרטיים (37 °C (37 °C (5° C (5% CO2).</li>
	<li>למחרת להעביר את התאים עם השילובים הרצויים של plasmids ביטוי המתקבל בנקודה 1.1.<ol>
<li>מדלל פלסמידים ביטוי במדיום ללא סרום (ראה טבלת חומרים) ל 6.25 ng/μL עבור כל מבנה.</li>
		<li>הוסף את ריאגנט transfection מבוסס שומנים בדם ביחס מתאים שומנים ל- DNA ודגור על פי הוראת היצרן.</li>
		<li>הוסף 8 μL של שומנים בדם: תערובת DNA לבארות ייעודיות. מערבבים את תכולת הצלחת על ידי סיבוב עדין. התוצאה היא טרנספקטציה של שני מבני הביטוי ב 50 ng / טוב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תרבית את התאים עבור 20-24 שעות בתנאים סטנדרטיים (37 °C (37 °C (5% CO2). הערה: Culturing התאים במשך זמן רב יותר עלול לגרום לרמות גבוהות יותר של ביטוי חלבון היתוך, אשר עשוי לקדם קשר לא ספציפי בין השברים.</li>
</ol>3. החלפה בינונית
<ol><li>למחרת להחליף את המדיום המותנה עם 100 μL של מדיום ללא סרום בכל באר. ודא שהתאים לא התנתקו בעת חילופים בינוניים. הערה: שלב זה צריך להיעשות 2-3 שעות לפני הוספת פתרון העבודה furimazine. נסיגת סרום ממזערת את הרקע הנגרם על ידי autoluminescence של furimazine.</li>
</ol>4. הכנת פתרון עבודה פורימזין
<ol><li>רגע לפני המדידה, יש לערבב נפח אחד של furimazine עם 19 כרכים של מאגר דילול (דילול של פי 20). הערה: הנפח הכולל של פתרון העבודה furimazine להיות מוכן תלוי במספר בארות בודדות שיש לנתח (פתרון העבודה furimazine מתווסף למדיום תרבית התא ביחס 1:5, ולכן, לכל היטב בעבר מלא עם 100 μL של מדיום ללא סרום 25 μL של פתרון העבודה furimazine יש להוסיף).</li>
	<li>מוסיפים את פתרון העבודה furimazine לבארות ייעודיות (25 μL / טוב). מערבבים בעדינות את הצלחת ביד או באמצעות שייקר מסלולית (למשל, 15 שניות ב-300-500 סל"ד).</li>
</ol>5. מדידת זוהר
<ol><li>הכנס את הצלחת לקורא מיקרו-לוחית זוהר.<ol>
<li>עבור ניסויים כי הם להתבצע ב 37 °C (50 °F) שיווי משקל הצלחת במשך 10-15 דקות בטמפרטורה שצוינה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בחר את הבארות שיש לנתח.</li>
	<li>קרא את הזוהר עם זמן אינטגרציה של 0.3 שניות. המשך לעקוב אחר זוהר עד 2 שעות בעת הצורך.</li>
</ol>6. ניתוח נתונים
<ol><li>חשב ערכים ממוצעים וחריגות תקן עבור כל השילובים שנבדקו ושלטו.</li>
	<li>נתח נתונים באמצעות ANOVA חד-כיווני עם השוואות מרובות.</li>
	<li>חשב ערכי שינוי קיפול על-ידי חלוקת אור ממוצע המתקבל עבור שילובים של עניין על-ידי אור ממוצע המתקבל עבור הפקדים השליליים המתאימים. הערך את התוצאות. הערה: הגישה לניתוח נתונים המוצעת כאן מניחה כי ניתן לתבוע את האינטראקציה אם האור המתקבל עבור השילוב שנבדק גבוה סטטיסטית באופן סטטיסטית מהאור המתקבל עבור שילוב הבקרה המתאים, ובמקביל, היחס בין שני ערכים אלה עולה על 10.</li>
</ol>

<ol><li>Hadley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+nucleotide+sugar+transporters%3A+Current+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).</li>
<li>Puglielli, L., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution%2C+identification%2C+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+GDP-fucose+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).</li>
<li>Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+UDP-N-acetylgalactosamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).</li>
<li>Gao, X., Dean, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+protein+domains+of+the+yeast+Golgi+GDP-mannose+transporter+mediate+oligomer+assembly+and+export+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).</li>
<li>Olczak, M., Guillen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mutation+and+an+alternative+splicing+of+UDP-galactose+transporter+in+MDCK-RCAr+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).</li>
<li>Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-N-acetylglucosamine+transporter+and+UDP-galactose+transporter+form+heterologous+complexes+in+the+Golgi+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane.</a> FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).</li>
<li>Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+delivery+of+activated+sialic+acid+into+Golgi+for+sialyation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).</li>
<li>Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+substrate+specificity+and+regulation+of+nucleotide+sugar+transporters+in+the+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer.</a> Nature Communications. 10 (1), 4657(2019).</li>
<li>Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+homologous+and+heterologous+interactions+between+UDP-galactose+transporter+and+beta-1%2C4-galactosyltransferase+1+using+NanoBiT%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT.</a> Analytical Biochemistry. 593, 113599(2020).</li>
<li>Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Leishmania+GDP-mannose+transporter+is+an+autonomous%2C+multi-specific%2C+hexameric+complex+of+LPG2+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits.</a> Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).</li>
<li>Sosicka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insight+into+the+orphan+nucleotide+sugar+transporter+SLC35A4%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).</li>
<li>Sprong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+Golgi+UDP-galactose+transporter+with+UDP-galactose%3Aceramide+galactosyltransferase+allows+UDP-galactose+import+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).</li>
<li>Maszczak-Seneczko, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-galactose+%28SLC35A2%29+and+UDP-N-acetylglucosamine+%28SLC35A3%29+Transporters+Form+Glycosylation-related+Complexes+with+Mannoside+Acetylglucosaminyltransferases+%28Mgats%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats).</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).</li>
<li>Khoder-Agha, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylglucosaminyltransferases+and+nucleotide+sugar+transporters+form+multi-enzyme-multi-transporter+assemblies+in+golgi+membranes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).</li>
<li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li>
<li>Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+in+live+cells+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging in live cells and animals.</a> Neurophotonics. 3 (2), 025001(2016).</li>
<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).</li>
<li>Inoue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+G-Protein-Coupling+Selectivity+of+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs.</a> Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).</li>
<li>White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Mediated+Protein+Tagging+with+Nanoluciferase+to+Investigate+Native+Chemokine+Receptor+Function+and+Conformational+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes.</a> Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).</li>
<li>Akinjiyan, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Luminescence-Based+High-Throuput+Approach+for+Cellular+Resolution+of+Protein+Ubiquitination+using+Tandem+Ubiquitin+Binding+Entities+%28TUBEs%29%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs).</a> SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).</li>
<li>Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoBiT+Complemetation+to+Monitor+Agonist-Induced+Adenosine+A1+Receptor+Internalization%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization.</a> SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).</li>
<li>Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+in+the+ATG5-ATG16L1+complex+following+nutrient+deprivation+measured+using+NanoLuc+Binary+Technlology+%28NanoBiT%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT).</a> FEBS Journal. , 15275(2020).</li>
<li>Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+NanoBiT-based+assay+monitors+the+interaction+between+lipoprotein+lipase+and+GPIHBP1+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time.</a> Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט המאפשר הדגמה של מתחמים הטרולוגיים שנוצרו בין חלבוני קרום מסוג III תושב גולגי, כגון NSTs, באמצעות בדיקת השלמת לוציפראז פיצול. הגישה המוצעת לניתוח נתונים ופרשנות כרוכה בהתייחסות לאור המתקבל עבור שילוב החלבון של עניין לאור המתקבל עבור שילוב השליטה המתאים, המורכב מאחד החלבונים של עניין התמזגו עם השבר הגדול יותר ואת חלבון הבקרה של מקור חיידקי התמזג עם שבר קטן יותר. האחרון בא לידי ביטוי בציטופלסמה של תאי יונקים; לכן, שימוש בו כהפניה דורש כי N- ו / או C-termini של החלבונים, אשר האינטראקציה שלהם היא...

כתב יד זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב כדי לבדוק את נוכחותם של אינטראקציות הטרולוגיות בין חלבוני קרום מסוג III תושב גולגי בתאים אנושיים שהודבקו באופן חולף באמצעות הגרסה העדכנית ביותר של בדיקת השלמת לוציפראז פיצול. ההליך נבדק בהרחבה ביותר נגד מובילי סוכר נוקלאוטידים (NSTs) אבל הצלחנו גם להשיג תוצאות חיוביות עבור חלבונים אחרים מסוג גולגי סוג III ממברנה אשר N- ו / או C-termini עומדים בפני הציטופלסמה.
קבוצת המחקר שלנו בוחנת את תפקידם של NSTs בגליקוזילציה של מקרומולקולות. NSTs הם חלבוני ממברנה מסוג III מסוג Golgi ו/או ER עם N- ו- C-termini הפונים לצד הציטופלסמי של הממברנה האורגנית1. NSTs נחשבים לשאת סוכרים המופעלים נוקלאוטידים על פני ממברנות אברונים כדי לספק גליקוסילטרפרנספראזס עם המצעים שלהם. NSTs יוצרים דימרים ו/או אוליגומרים גבוהים יותר2,3,4,5,6,7,8,9,10. יתר על כן, אינטראקציות הטרולוגיות בין NSTs שונים דווחו גם 6,11. NSTs הוכחו גם כדי ליצור קומפלקסים עם אנזימי גליקוסילציה הקשורים פונקציונלית12,13,14. חיפשנו אלטרנטיבה לטכניקה הנמצאת בשימוש כיום, הדמיה לכל החיים פלואורסצנטית (FLIM) מבוססת גישת FRET, לחקר אינטראקציות של NSTs וחלבונים הקשורים לגולגי הקשורים לתפקוד, ולכן החלטנו לבדוק את בדיקת ההשלמה של לוציפראז הפיצול. זה איפשר לנו לזהות אינטראקציה חדשנית בין NST ואנזים גליקוזילציה הקשורים לתפקודית9.
השינוי האחרון של בדיקת ההשלמה פיצול לוציפראז, NanoBiT, משמש בפרוטוקול המוצג כאן15. הוא מסתמך על שחזור של האנזים לוציפראז (למשל, NanoLuc) משני השברים - הגדול, המכונה BiT גדול או LgBiT, חלבון 17.6 kDa, ואת הקטן, המורכב רק 11 חומצות אמינו, המכונה BiT קטן או SmBiT. שני החלבונים המעניינים מותכים עם השברים המשלימים ומתבטאים באופן חולף בקו תאים אנושי. אם שני חלבוני ההיתוך מתקשרים, אור נוצר במקום עם תוספת של מצע חדיר לתא. שני שברים אלה עברו אופטימיזציה כך שהם מתרועעים עם זיקה מינימלית אלא אם כן הם מובאים יחד על ידי אינטראקציה בין חלבוני העניין שהם מותכים.
באופן כללי, לשיטות מבוססות ביולומינציה יש כמה יתרונות על פני אלה המבוססים על פלואורסצנטיות. לאותות ביו-זוהרים יש יחס אות-לרעש גבוה יותר מכיוון שהאור ברקע זניח בהשוואה לאות שמקורו בלוציפראז16. לעומת זאת, גישות מבוססות פלואורסצנטיות סובלות בדרך כלל מרקע גבוה יחסית הנגרם על ידי תופעת ההפלורציה האוטומטית. חוץ מזה, ביולומינציה פחות מזיקה לתאים המנותחים מאשר פלואורסצנטיות, כמו במקרה הקודם אין צורך לרגש את המדגם. מסיבות אלה גישות ביו-זוהרות לחקר PPIs ב- vivo עולות על השיטות הפלואורסצנטיות הנפוצות כמו העברת אנרגיה תהודה של Förster (FRET) או השלמה פלואורסצנטית דו-מולקולרית (BiFC).
הפרוטוקול שלנו מסתמך על הפניית אור המתקבל עבור שילוב החלבון של עניין לאור המתקבל עבור שילוב הבקרה. האחרון כולל את אחד החלבונים שנבדקו אשר מותך עם שבר גדול יותר חלבון בקרה (למשל, HaloTag), התמזג עם שבר קטן יותר. האחרון הוא חלבון ממוצא חיידקי שאינו צפוי לקיים אינטראקציה עם אף אחד מחלבוני היונקים. שימוש בחלבון זה כבקרה מציב מגבלות לטופולוגיה של זוגות החלבונים של תושבי גולגי שיש לנתח. מאז בתאי יונקים חלבון זה מסונתז בציטופלסמה, שני החלבונים של עניין צריך להיות לפחות זנב ציטופלסמי אחד.
גישה זו יכולה להיות שימושית במיוחד להקרנה ראשונית של ממשקי PPIs. זה עשוי להיות שיטת הבחירה כאשר חלבוני ההיתוך של עניין באים לידי ביטוי ברמות כי הם פשוט לא מספיק עבור גישות אחרות להיות מיושם. באופן דומה, הבדיקה המשלימה לוציפראז פיצול יכול להיות האפשרות הטובה ביותר אם החלבונים של עניין באים לידי ביטוי ברמות גבוהות, אבל זה משפיע לרעה על לוקליזציה תת תאית שלהם או ידוע לכפות אינטראקציות לא ספציפיות. מאז שבר קטן יותר יש רק 11 חומצות אמינו, בדיקת ההשלמה לוציפראז לפצל ניתן ליישם בעת שימוש בתגים גדולים יותר הוא בלתי אפשרי. לבסוף, ניתן להשתמש בו כדי לאשר עוד יותר נתונים שהושגו באמצעות טכניקות אחרות, כמו במקרה המוצג כאן.

<table><tbody><tr><td>0.25% תמיסת</td><td></td><td></td><td></td>טריפסין-EDTA</tr><tr><td>קו תאי יונקים דבק BioCoat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine 96 בארות לבן/שקוף תחתון שטוח מטופל TC, עם מכסה</td><td>קורנינג</td><td>356651</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td>תרבית</tr><tr><td>תאים תוספי תרבית תאים (סרום בקר עוברי מומת בחום, L-גלוטמין, פניצילין, סטרפטמיצין)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO<תת>2</תת> אינקובטור</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלסמידים ביטוי המקודדים חלבונים מעניינים שאינם מתויגים עם שברי</td><td></td><td></td><td></td>NanoBiT</tr><tr><td>FuGENE HD Transfection Reagent</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>GloMax Discover Microplate Reader (או קורא מיקרו-פלטות זוהר אחר)</td> <td>Promega</td><td>GM3000</td><td></td></tr><tr><td>מצע גידול המוקדש לקו התאים השתמש</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בחומרים וריאגנטים לשיבוט מולקולרי סטנדרטי (חיידקים, פולימראז יציב בחום, אנזימי הגבלה, DNA ליגאז, חומרים וריאגנטים לטיהור חומצות גרעין)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NanoBiT MCS Starter</td><td>System Promega</td><td>N2014</td><td>ערכה זו מכילה וקטורים המאפשרים תיוג של החלבונים המעניינים עם שברי NanoBiT בכיוונים שונים, כמו גם את פלסמיד הבקרה המקודד חלבון HaloTag המאוחה עם SmBiT וזוג פלסמיד בקרה חיובי.</td></tr><tr><td>מערכת בדיקת תאים חיים של Nano-Glo</td><td>Promega</td><td>N2011</td><td>ערכה זו מכילה פורימזין, שהוא מצע המאפשר זיהוי פעילות NanoLuc בתאים חיים, ומאגר דילול ייעודי.</td></tr><tr><td>Opti-MEM I מדיום סרום מופחת, ללא פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Oribital שייקר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנה לניתוח נתונים (למשל GraphPad Prism)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>תרמציקלר</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הדגמה של קומפלקסים הטרולוגיים שנוצרו על ידי חלבוני קרום מסוג iii של תושב גולגי באמצעות בדיקת השלמה פיצול לוציפראז

Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay

מטרת פרוטוקול זה היא לחקור את הישימות של הגרסה האחרונה של השלמת לוציפראז מפוצל להדגמת מתחמים הטרולוגיים שנוצרו על ידי מובילי סוכר נוקלאוטידים (NSTs). חלבונים רב-תכליתיים אלה, התושבים בחדר המיון ובגולגי, נושאים את הסוכרים הנוקלאוטידים המסונתזים מבחינה ציטופלסמית על פני ממברנות האברונים כדי לספק אנזימים המתווכים גליקוזילציה עם המצעים שלהם. NSTs קיימים כמו דימרים ו / או אוליגומרים גבוהים יותר. כמו כן דווח על אינטראקציות הטרולוגיות בין NSTs שונים. כדי לוודא אם הטכניקה מתאימה לחקר התופעה של הטרומריזציה של NST, בדקנו אותה מול שילוב של שני NSTs תושב גולגי שהוכחו בעבר כמקשרים במספר אמצעים אחרים. בדיקת ההשלמה של לוציפראז נראית מתאימה במיוחד לחקר אינטראקציות בין חלבוני ממברנה תושבי גולגי, שכן היא אינה דורשת רמות הבעה גבוהות, אשר לעתים קרובות לעורר מיקום שגוי של חלבון ולהגדיל את הסיכון של חיובי שווא.

כדי להשיג את הנתונים האמינים ביותר בגישה זו יש לבדוק את כל השילובים האפשריים (ראו איור 1). במקביל, יש לכלול פקדים חיוביים ושליליים. השליטה החיובית צריכה להיות מורכבת משני החלבונים הידועים כאינטראקציה, מתוכם אחד מותך עם השבר הגדול יותר והשני מותך עם השבר הקטן יותר. השליטה השלילית באופן אידיאלי צריכה להיות מורכבת משני חלבוני קרום מסוג III שאינם אינטראקציה מתויגים באופן דומה. עם זאת, הקמת שליטה כזו עשויה להיות מאתגרת, שכן חוסר האינטראקציה של שני חלבוני הבקרה צריך להיות מאושר ביסודיות באמצעות מס...

הפרוטוקול המוצג כאן נועד להדגים את התרחשותן של אינטראקציות הטרולוגיות בין חלבוני קרום מסוג III מסוג גולגי עם N- ו / או C-termini שנחשפו באופן ציטופלזמי בתאי יונקים חיים באמצעות הגרסה העדכנית ביותר של בדיקת המשלים לוציפראז מפוצלת.

הדגמה של קומפלקסים הטרולוגיים שנוצרו על ידי חלבוני קרום מסוג III של תושב גולגי באמצעות בדיקת השלמה פיצול לוציפראז

The goal of this protocol is to explore the applicability of the most recent variant of split luciferase complementation for demonstrating heterologous ...

הפרוטוקול שלנו מאפשר לזהות ולנתח אינטראקציות בין חלבונים טרנסממברניים מרובים של הרטיקולום האנדופלזמי וקומפלקס גולגי בתאים חיים ברמות ביטוי נמוכות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הרגישות המיוחדת, המאפשרת להימנע מרמות ביטוי יתר גבוהות שלעתים קרובות מזיקות לבריאות התא ועלולות להפריע ללוקליזציה התת-תאית של החלבון. קצרו את תרבית תאי ה-T HEK293 על ידי טריפסיניזציה והשעו מחדש את התאים במצע גידול מלא ייעודי.צלחת את התאים על צלחת תחתית שקופה, צד לבן 96 בארות. התאימו את המספר הכולל של הבארות כך שיתאימו לכל השילובים והבקרות שנבדקו, כולל שכפולים. לאחר מכן, תרבית התאים למשך הלילה בתנאים סטנדרטיים.למחרת, העבירו את התאים עם השילובים הרצויים של פלסמידים לביטוי. מדללים את הפלסמידים במדיום נטול סרום ל-6.25 ננוגרם למיקרוליטר עבור כל מבנה ומוסיפים את מגיב הטרנספקציה מבוסס השומנים. הוסף יחס שומנים ל-DNA מתאים.דגרו את הפלסמידים לפי הוראות היצרן. לאחר מכן, הוסף שמונה מיקרוליטרים מתערובת ה-DNA השומני לבארות המיועדות לכך. מערבבים את תכולת הצלחת בסיבוב עדין ומתרביים את התאים למשך 20, 24 שעות בתנאים סטנדרטיים.למחרת, החלף את המדיום המותנה בכל באר ב-100 מיקרוליטר של מדיום נטול סרום, וודא שהתאים לא יתנתקו בעת החלפת המדיום. רגע לפני מדידת הזוהר, ערבבו נפח אחד של פורימזין עם 19 נפחים של מאגר דילול. הוסף 25 מיקרוליטר מתמיסת העבודה של הפורימזין לכל באר, וערבב בעדינות את הצלחת ביד או עם שייקר מסלולי.הכנס את הצלחת לקורא מיקרו צלחות זוהר ויזן את הצלחת ב -37 מעלות צלזיוס למשך 10 15 דקות. בחר את הבארות לניתוח וקרא זוהר עם זמן אינטגרציה של 0.3 שניות. המשך לעקוב אחר הזוהר עד שעתיים בעת הצורך.פרוטוקול זה נבדק על שני מובילי סוכר נוקלאוטידים, SLC35A2 ו-SLC35A3, שהם חלבוני ממברנה מסוג שלושה תושבים גולגי עם טרמיני N ו-C הפונים לציטופלזמה. היו שמונה אפשרויות תיוג אפשריות וניתן היה להגדיר את חלבוני ההיתוך שהתקבלו בשמונה דרכים אפשריות. יחידות זוהר יחסיות ממוצעות או ערכי RLU המתאימים לכל שילובי הבקרה שנבדקו מוצגים כאן.ערכי ה-RLU שהתקבלו עבור שלושה מהשילובים היו גבוהים משמעותית מאלה שהתקבלו עבור שילוב הבקרה המקביל. כדי להשיג ערכי יחס עבור שילובי העניין, ערכי ה-RLU חולקו בערכי ה-RLU שהתקבלו עבור הבקרות המתאימות. יחסים בין 10 ל-1000 מעידים מאוד על אינטראקציות ספציפיות.היו שני שילובים כאלה שתמכו ברעיון ש-SLC35A2 ו-SLC35A3 מתקשרים. כדי לאשר נתונים אלה, SLC35A2 או SLC35A3 מתויגים HA באו לידי ביטוי במשותף עם השילוב שהביא לזוהר היחסי הגבוה ביותר. כמויות משתנות של הפלסמידים וגרסאות NST מתויגות HA מקודדות שימשו לטרנספקציה משותפת, וכתוצאה מכך ירידה תלוית מינון מובהקת סטטיסטית בערכי RLU.הדבר הקריטי ביותר הוא להתמודד עם האינטרס העצמי של החלבון שלך בכל הדרכים האפשריות ולבחון את כל השילוב האפשרי, מכיוון שאוריינטציה מסוימת של תיוג עלולה לייצר תוצאות שליליות כוזבות. לאחר שנבחר השילוב בעל הביצועים הטובים ביותר, ניתן לנטר את הדינמיקה של האינטראקציה המתאימה, למשל לזהות סוכנים או תנאים המשבשים את מכלול העניין שלך לאורך זמן.

demonstration-heterologous-complexes-formed-golgi-resident-type-iii

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים נהלים לחקר שינויים בביטוי גנים phagocytosis המושרה עם גישה בלוציפראז מבוסס כתב הגן באמצעות מערכת כפולה GloTM Assay בלוציפראז מ Promega.

לימוד biogenesis ממברנה עם Assay בלוציפראז מבוסס Gene כתב

Subcellular לוקליזציה של חלבונים חשוב בקביעת הרגולציה במרחב ובזמן של איתות התא. כאן אנו מתארים השלמה הקרינה bimolecular (BiFC) כשיטה פשוטה לניטור אינטראקציות המרחבי של חלבונים בתא.

השלמה Fluorescence bimolecular

הליך יעיל להעריך את הנטייה oligomerization יחיד לעבור תחומים הטרנסממברני (TMDS) מתואר. חלבונים כימרי המורכב TMD התמזגו ToxR באים לידי ביטוי למתח כתב החיידק. TMD-Induced oligomerization גורם dimerization של ToxR, הפעלת שעתוק וייצור חלבונים הכתב,-galactosidase.

דומיין הטרנסממברני Oligomerization הנטייה נקבע על ידי Assay ToxR

פתחנו assay איחוי תאים שמכמת אירועי איחוי המלכודת בתיווך על ידי ביטוי של β הופעל-גלקטוזידאז.

ניתוח איחוי מלכודת בתיווך באמצעות Assay איחוי תאים אנזימתי

סרטון זה מדגים את בדיקת השלמת לוציפראז מפוצלת כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון. בבדיקה זו, החלבונים המעניינים מתויגים למקטעים קטנים וגדולים של האנזים לוציפראז. כאשר החלבונים מתקשרים, המקטעים הגדולים והקטנים משתלבים ליצירת קומפלקס אנזימים פעיל, אשר בנוכחות מצע מסוים, משחרר זוהר בהיר שניתן למדוד.

בדיקת השלמת לוציפראז מפוצלת לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות

ההתאמה המדויקת של תושבים גולג'י חיוני להבנת פונקציות הסלולר של גולג'י. עם זאת, מיקרוסקופ אופטי קונבנציונאלי אין אפשרות לפענח את מבנה תת-גולג'י. כאן נתאר את פרוטוקול שיטה סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה קונבנציונאלי המבוסס באופן כמותי לקבוע לוקליזציה תת-גולג'י של חלבון.

לוקליזציה כמותית של חלבון גולג'י על ידי הדמיה המסה מרכז של זריחה

כאן, אנו מראים כיצד להשתמש Assay מצדו קרבה (PLA) כדי להמחיש את MST1/MST2 heterodimerization בתאים קבוע עם רגישות גבוהה.

זיהוי של Heterodimerization של חלבון איזופורמים שימוש בחיי עיר הקרבה מצדו Assay

כאן אנו מציגים ביוסנסור מבוססי לוציפראז לכמת את פעילות קינאז מדכאי גדולים (באמת)-קינאז המרכזית בההיפופוטם איתות. ביוסנסור הזה יש יישומים שונים ומגוונים במחקר בסיסי והתרגום שמטרתה לחקור היפו מסלול הרגולטורים במבחנה וב -vivo.

ניטור היפו איתות לשביל פעילות באמצעות ביוסנסור משתיק קול (באמת) מבוסס-לוציפראז הגידול גדול

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למדידת אינטראקציה eIF4E-eIF4G בתאים חיים שיאפשר למשתמש להעריך הפרעה הנגרמת על ידי סמים של דינמיקה מורכבת eIF4F בפורמטי סינון.

ניטור הרכבת eIF4F על-ידי מדידת אינטראקציית eIF4E-eIF4G בתאים חיים

פרוטוקול זה מדגים את השימוש בסדר הקירבה הצמוד כדי לבדוק את האינטראקציות של חלבון חלבון באתרו בתוך C. אלגיה germline.

באיתור באתרו של האסיפה המורכבת של ריבונאופאנפרוטאין ב -C. אלגיה germline באמצעות שיטת הסמיכות

הקמנו בדיקת הרכבה מחדש של לוציפראז מפוצל כדי לפקח על המגעים האנדופלסמיים בין הרשתית למיטוכונדריה בתאים חיים. באמצעות בדיקה זו, אנו מתארים פרוטוקול למדידה כמותית של רמת הצימודים הבין-אברונים הללו בתאי HEK293T, בתנאי של טיפול כימי.

בדיקת הרכבה מחדש של Split-Luciferase למדידת מגעים אנדופלסמיים בין הרשתית למיטוכונדריה בתאים חיים

חקור אינטראקציות בין חלבוני קרום מסוג III של תושב גולגי באמצעות בדיקת השלמה פיצול לוציפראז בתאי HEK293 חיים. שיטה רגישה זו מאפשרת זיהוי אינטראקציות ברמות ביטוי נמוכות מבלי לפגוע בתפקוד התא.

הדגמה של קומפלקסים הטרולוגיים שנוצרו על ידי חלבוני קרום מסוג III של תושב גולגי באמצעות בדיקת השלמה פיצול לוציפראז

גלה סרטונים נוספים