זן מבוקר של הידרוג'ל תלת מימדי תחת הדמיה מיקרוסקופית חיה

רקמות ביולוגיות גדלות בסביבות רכות תלת מימדיות שדרכן נחשפים התאים לרמזים מכניים שונים. השיטה שלנו מאפשרת מתיחה של הידרוג'לים בצורה תלת מימדית לחקירת תגובות ביומכניות. טכניקה זו מאפשרת מתיחה אחידה של הידרוג'לים לאורך עוביים תוך ביצוע הדמיה חיה.

בנוסף, ניתן לתפעל את הגיאומטריה של ההידרוג'ל לכל גודל או צורה. ידע על האופן שבו תאים ומטריצה חוץ-תאית מגיבים לכוחות חשוב לחשיפת האופן שבו רקמות מתפתחות ומחלות מתקדמות. זה יכול להוביל לפיתוח פוטנציאלי של טיפולים בסרטן ומודלים של הנדסת רקמות.

התחל בשימוש בלייזר או חותך ידני ליצירת רצועת גומי עם חור במרכז. חותכים מלבן של סרט הידרופובי כך שיהיה רחב יותר מרצועות הסיליקון ושוטפים כלי פלסטיק עם 70% אתנול. לאחר ייבוש עם מגבונים נטולי מוך, הניחו את סרט האיטום לתוך הכלי והניחו רצועת סיליקון אחת כשהניילון הוסר מצד אחד למרכז כל פיסת סרט איטום.

להיווצרות ג'ל פיברין, העבירו באופן אחיד 2.5 מיקרוליטר של פיברינוגן עם תווית קרה לתוך גזרת הסיליקון של כל רצועה כך שכל ההיקף של כל חיתוך יהיה במגע עם פיברינוגן, תוך הקפדה לא לאפשר לכיסי אוויר או בועות להיווצר בשום מקום בתמיסות. הוסיפו מיד 2.5 מיקרוליטר תרומבין מקורר ישירות לכל תמיסת פיברינוגן וערבבו במהירות את התמיסות עם פיפטינג זהיר, תוך הזזת הקצה סביב התערובת כולה ליצירת תמיסה הומוגנית ככל האפשר. לאחר הערבוב מניחים את המנה המכוסה בחממה למשך 30 דקות לפילמור ג'ל.

בתום הדגירה, הוסף מספיק PBS לכלי כדי להטביע את מבני הסיליקון הג'ל והרם בזהירות כל דגימה מהצלחת, וודא ששכבת סרט האיטום נשארת דבוקה לרצועה. מקלפים לאט מקצה אחד של הסיליקון לקצה השני, נתקו בזהירות את סרט האיטום מכל חתיכת סיליקון, ואז הניחו את הרצועה בחזרה לכלי והניחו את המנה על במת מיקרוסקופ אור כדי להעריך את מצב הדגימה. כדי להעמיס את הדגימה על מכשיר המתיחה, מלאו את האמבטיה ב-PBS והניחו את רצועת הסיליקון המכילה את ג'ל הדגימה על פני החלק העליון של האמבטיה כך שקצוות הרצועה יושבים בכל צד של האמבטיה.

הניחו את המהדקים ורצועות הבד, ואז הדקו כך שכל החלקים מחוברים ליצירת רצועה ישרה אחת עם הגזרה במרכז. הניחו את החומר על הבאר ואבטחו החלקת כיסוי בתחתית הבאר, ואז הניחו נוזל אלומיניום היטב לתוך מכשיר המתיחה. מלאו את הבאר במיליליטר אחד עד שניים של מדיום תא PBS והניחו את מבנה ג'ל בד הרצועה לתוך המכשיר.

מהדק את רצועת הבד לתוך התושבת כך שגזרת הג'ל תהיה במרכז לפני הנחת ונעילת הכנס בזהירות למקומו במכשיר. הנח ונעל את צד הבד השני לתוך הציר והנח את מכשיר המתיחה ואת הדגימה המצורפת על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקלי. השתמש בכבל USB כדי לחבר את המיקרו-בקר למחשב ולחבר את מנוע הסרוו למיקרו-בקר.

לאחר מכן פתח את מודול הבקרה של התקן המתיחה במחשב כדי לדמות את הדגימה. כדי לקבוע אם הדגימה מתאימה לניסוי, השתמש בהדמיה חיה ברזולוציה נמוכה כדי לסרוק את כל הג'ל ולקבוע את מיקום ה-Z הנמוך ביותר שבו ניכרת הידבקות מלאה לדפנות הפנימיות של החתך ללא קרעים או בועות. לאחר ציון מיקום Z של המיקרוסקופ, סרוק את הממשק של התווית הפלואורסצנטית של הג'ל ורצועת הסיליקון כדי לקבוע את ההדבקה המלאה של הג'ל לסיליקון לאורך כל היקפו.

לאחר הסריקה, הזיזו את ה-stage בכיוון Z עד שאין יותר המשכיות בג'ל ושימו לב לגבול העליון של מיקום Z. לאחר מכן הפחיתו את הגבול העליון של כיוון Z מהגבול התחתון כדי לחשב את עובי הדגימה. כדי לקבוע את מיקום המתיחה המוקדמת של הדגימה, לחץ על עבור אל Zero Servo POS בתוכנת המודול כדי לוודא שמנוע הסרוו נמצא במצב האפס שלו ולחבר את מנוע הסרוו למכשיר המתיחה, תוך הקפדה ולא להפעיל עומס על הדגימה.

בזמן ההדמיה, לחץ על כפתור הפלוס אחד כדי להזיז את המנוע מעלה אחת בכל פעם בכיוון השעון. כאשר הצד הימני של הגזרה זז, לחץ על כפתור מינוס אחד כדי להפוך את הדגימה למצב הלפני אחרון כדי לשמור על הדגימה במתח מינימלי. לחצו על Set Min Servo Position לקביעת מיקום הייחוס וללכוד תמונה של אריח פרוסת Z בודד בהגדלה של 40 פעמים ורזולוציה גבוהה של כל אזור הג'ל כהפניה בסיסית לניתוח שלאחר העיבוד.

לאחר שכל התמונות נרכשו, קדם את מנוע הסרוו מעלה אחת לשנייה עד שתגיע לגודל המתיחה הרצוי. בכל גודל מתיחה שעבורו רצוי ניתוח, ודא שהג'ל לא התנתק מהסיליקון בשום נקודה לאורך היקפו על ידי סריקת הממשק בין הג'ל לסיליקון, ולאחר מכן צלם סט תמונות מחסנית Z ברזולוציה גבוהה של כל אזור הג'ל לניתוח לאחר עיבוד. התקרבות ומעקב ידני אחר אגרגטים של חרוזים במהלך מתיחת ג'ל מאפשרים חישוב של זני הג'ל המקומיים בכיוונים הציריים והמאונכים.

בדרך כלל הגדילים הציריים מתפשטים באופן ליניארי יחסית מקצה חיתוך הסיליקון למרכז הג'ל והם גדולים יותר מהזנים הניצבים הלוחצים. כאן מוצגות תמונות בהגדלה גבוהה של הידרוג'ל טיפוסי לא מתוח ואיזוטרופי יחסית, ומימן תחת מתח חיתוך גבוה של 80% המתאר סיבים מיושרים מאוד בכיוון המתיחה. ניתוח הכיוון מחדש של הסיבים חשף תלות ליניארית בערך בין יישור הסיבים לבין המתח החיצוני על החתך עד לזנים של 40% עם רוויה בינונית בזנים מעל 40% כפי שמוצג בניתוח יישור סיבים זה, ככל שהעומס החיצוני על החתך עולה, יישור הסיבים גדל, בעקבות עקומה לא ליניארית כוללת.

שימו לב שתגובת הג'ל למתיחה אחידה יחסית לאורך עובי ה-Z שלה. כפי שמודגם בסימולציה ראשונית זו של אלמנטים סופיים שבוצעה על חומר רציף דו-ממדי, שטיח הצבע נע בין 38 ל-42%, מה שמצביע על כך שזני הג'ל הומוגניים יחסית בכל אזור הג'ל העגול. חשוב לוודא שההידרוג'ל נצמד לחלוטין לדפנות הפנימיות של הגזרה הגיאומטרית, שכן הידבקות והמשכיות חיוניות למתיחה אמינה של דגימות.

על ידי שינוי הגיאומטריה של גזרת הסיליקון, אנו יכולים לתכנת שיפועים במתח וביישור סיבים, כך שבעת הטמעת תאים נוכל לנתח את התגובה לשיפועים אלה.