Name: אקס ויוו צרויד נבט א-סאי של אנגיוגנזה מיקרו-וסקולרית עינית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: למדו שיטת אקס ויוו לחקר אנגיוגנזה מיקרו-וסקולרית עינית באמצעות מודל נבט כורואידי בעכברים. השיטה מאפשרת הערכת תרופות ומסלולי מולקולריים בניווסקולריזציה כורואידלית ובניוון מקולרי קשור לגיל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה נתמכה על ידי מענקים מהקרן הסוכרתית Manpei סוזוקי (YT), בית החולים לילדים בבוסטון OFD / BTREC / CTREC הפקולטה לפיתוח קריירה מענק, בוסטון ילדים בית החולים Ophthalmology הקרן, BCH פיילוט פרס, BCH מנטון מרכז מלגות, וקרן ג'ירפה הקטנה (ZF), קרן המחקר הגרמנית (DFG; לפנה"ס [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY017-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), קרן עין האריות של מסצ'וסטס (LEHS).

כל הניסויים בבעלי חיים שתוארו אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדיים בבית החולים לילדים בבוסטון (פרוטוקול ARCH מספר 19-04-3913R).
1. הכנה
<ol><li>הוסף 5 מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין (10000 U / mL) ו 5 מ"ל ו 10 מ"ל של תוספי מזון זמינים מסחרית ל 500 מ"ל של מדיום קלאסי מלא עם סרום. Aliquot 50 מ"ל של המדיום בתחילה. הערה: אין להחזיר כל מדיום בחזרה למניה כדי למנוע זיהום.</li>
	<li>שים aliquot של מדיום קלאסי שלם על קרח.</li>
	<li>השתמש 70% אתנול כדי לנקות את מיקרוסקופ ניתוח, מטלפים, ומספריים.</li>
	<li>הכן שתי מנות תרבות תאים (10 ס"מ), אחת על מיקרוסקופ הניתוח, אחת על קרח; לשים 10 מ"ל של מדיום קלאסי שלם בכל מנה.</li>
</ol>2. שלבים ניסיוניים (איור 1)
<ol><li>הקרבת עכברים C57BL/6J סביב לאחר הלידה (P) 20 באמצעות 75-100 מ"ג/ק"ג קטמין ו 7.5 -10 מ"ג / ק"ג xylazine מוזרק תוך אפית. שמור את העיניים במדיום קלאסי שלם על קרח לפני הניתוח.</li>
	<li>הסר את רקמת החיבור (רקמת שריר ושומן) ואת עצב הראייה על העין.</li>
	<li>השתמש מיקרו מספריים לחתוך היקפית 0.5 מ"מ אחורי לימבוס הקרנית. הסר את תסביך הקרנית/ הקשתית, זיבתי ואת העדשה.</li>
	<li>הפוך חתך 1 מ"מ בניצב לקצה לחתוך לכיוון עצב הראייה לחתוך רצועה היקפית של רוחב 1 מ"מ. הפרד את האזורים המרכזיים וההיפריאליים של המתחם. השתמש מלקחיים כדי לקלף את הרשתית מ RPE / choroid / תסביך סקלרה.</li>
	<li>שמור את להקת choroid ההיקפית במדיום קלאסי שלם על קרח; לבודד את העין השנייה ולחזור על התהליך כדי לחתוך רצועה שנייה.</li>
	<li>חותכים את הרצועה העגולה ל-6 ~ חלקים מרובעים שווים (~ 1 מ"מ x 1 מ"מ). הערה: לעולם אל תיגע בקצה כלשהו.</li>
	<li>הפשר את תמצית הממברנה הבסיסית (BME) לפי הוראת הייצור. הוסף 30 μL / גם של BME למרכז של כל באר של צלחת 24 תרבות רקמות היטב. ודא שהירידה של BME יוצרת כיפה קנית בתחתית הצלחת מבלי לגעת בקצוות. הערה: להפשיר את BME לילה במקרר. BME צריך להיות על הקרח בכל עת לאחר הפשרה.</li>
	<li>מניחים את הרקמה באמצע BME. הערה: אין לשטח את explant choroid; בדרך כלל, תן לרקמה להתרחב בתוך BME. הכיוון של הרקמה (צד scleral למעלה או למטה) אינו משפיע על התוצאה הניסיונית.</li>
	<li>הדגירה את הצלחת ב 37 °C (60 °F) במשך 10 דקות כדי לתת את הג'ל להתגבש.</li>
	<li>הוסף 500 μL של המדיום הקלאסי המלא / טוב.</li>
	<li>שנה את המדיום הקלאסי כל יומיים (500 μL). נביעה Choroid ניתן לראות לאחר 3 ימים עם מיקרוסקופ. הערה: לטיפול בגורם גדילה, להרעיב את הרקמה במשך 4 שעות. לדלל תרכובת ניסיון בינוני מופחת גורם גדילה (1:200 דחיפה במקום 1:50).</li>
</ol>3.SWIFT כימות ממוחשבת 3.Choroid17 (איור 2)
הערה: נעשה שימוש בשיטה ממוחשבת למדידת האזור המכסה בכלי גידול. יש צורך בתוסף מאקרו לתוכנה ImageJ לפני כימות (ראה מידע משלים לפרטים נוספים).
<ol><li>פתח את התמונה הנבטת choroid עם ImageJ ובדוק "| סוג| 8 סיביות" עם קנה מידה אפור.</li>
	<li>עבור אל "| התאם | בהירות/חדות (Ctrl/shift/C)" ומטב את החדות.</li>
	<li>השתמש בפונקציית מטה הקסם כדי לחלק ולהסיר מהתמונה את רקמת הצ'רויד שנמצאת במרכז הנבטים (באמצעות מקש קיצור "F1") (איור 2A,B). הערה: הגדר את שיעור הרגישות של שרביט הקסם ל- 20-30%.</li>
	<li>הסר את הרקע של התמונה בעזרת כלי הבחירה החינמיים (איור 2C). עבור אל "| התאם | סף (Ctrl/shift/T)". השתמש בפונקציית הסף כדי להגדיר את הנבטים המיקרו-וסקולריים על רקע הפריפריה (איור 2D).</li>
	<li>לחץ על "F2" ויופיע סיכום. שמור תמונה של האזור הנבחר על-ידי לחיצה על "שמור". שמור באותה תיקיה שבה שמור את התמונה המקורית לעיון בעתיד.</li>
	<li>לאחר מדידת קבוצת דגימות, העתק את התועד לניתוח נתונים. הערה: ניתן גם למדוד את האזור (μm²) על ידי "לנתח | הגדר קנה מידה" באמצעות תמונות עם סרגלי קנה מידה.</li>
</ol>

<ol><li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).</li>
<li>Pemp, B., Schmetterer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+blood+flow+in+diabetes+and+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration.</a> Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).</li>
<li>Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+response+in+retinal+homeostasis+and+inflammatory+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778(2020).</li>
<li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyslipidemia+in+retinal+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dyslipidemia in retinal metabolic disorders.</a> EMBO Molecular Medicine. 11 (10), 10473(2019).</li>
<li>Daruich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+macular+edema%3A+Beyond+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of macular edema: Beyond the surface.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Acting+FGF21+Inhibits+Retinal+Vascular+Leakage+in+In+Vivo+and+In+Vitro+Models%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188(2020).</li>
<li>Maisto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARPE-19-derived+VEGF-containing+exosomes+promote+neovascularization+in+HUVEC%3A+the+role+of+the+melanocortin+receptor+5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5.</a> Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).</li>
<li>Mazzoni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+Inhibitor+Apcdd1+Coordinates+Vascular+Remodeling+and+Barrier+Maturation+of+Retinal+Blood+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels.</a> Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).</li>
<li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiponectin+Mediates+Dietary+Omega-3+Long-Chain+Polyunsaturated+Fatty+Acid+Protection+Against+Choroidal+Neovascularization+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+Oxidase+2C+Inhibition+Adds+to+omega-3+Long-Chain+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Protection+Against+Retinal+and+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).</li>
<li>Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+angiogenesis+by+different+cell+types+in+the+aorta+ring+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).</li>
<li>Bellacen, K., Lewis, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+ring+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visulaized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Aortic ring assay.</a> Journal of Visulaized Experiments. (33), e1564(2009).</li>
<li>Masson, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Aortic+Ring+Assay%3A+A+New+Approach+of+the+Molecular+Genetics+of+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis.</a> Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).</li>
<li>Katakia, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+model+for+studying+endothelial+tip+cells%3A+Revisiting+the+classical+aortic-ring+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay.</a> Microvascular Research. 128, 103939(2020).</li>
<li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li>
<li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ex+vivo+murine+retina+angiogenesis+%28EMRA%29+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay.</a> Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).</li>
<li>Shao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+sprouting+assay%3A+an+ex+vivo+model+of+microvascular+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis.</a> PLoS One. 8 (7), 69552(2013).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+fatty+acid+receptor+4+activation+protects+against+choroidal+neovascularization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice.</a> Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+TWIST1+promotes+pathological+ocular+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis.</a> Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+microRNA-150+is+an+intrinsic+suppressor+of+pathologic+ocular+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncEGFL7OS+regulates+human+angiogenesis+by+interacting+with+MAX+at+the+EGFL7%2FmiR-126+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus.</a> Elife. 8, 40470(2019).</li>
<li>Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+assay+for+angiogenesis+of+cultured+choroidal+tissues+in+streptozotocin-diabetic+Wistar+and+spontaneously+diabetic+GK+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats.</a> Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).</li>
<li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effects+of+tetrandrine+and+related+synthetic+compounds+on+angiogenesis+in+streptozotocin-diabetic+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).</li>
<li>Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N%28epsilon%29-%28carboxymethyl%29lysine+proliferated+CD34%28%2B%29+cells+from+rat+choroidal+explant+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).</li>
<li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overproduction+of+N%28epsilon%29-%28carboxymethyl%29lysine-induced+neovascularization+in+cultured+choroidal+explant+of+streptozotocin-diabetic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).</li>
<li>Bergers, G., Song, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+pericytes+in+blood-vessel+formation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance.</a> Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).</li>
<li>Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reply+to%3A+Phenotypic+plasticity+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells.</a> British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין גילויים פיננסיים. השיטה הממוס ממוחשבת זמינה ללא תשלום למוסדות אקדמיים באמצעות המחברים.

המדגמה הנבטת choroidal מסייעת למחקר ב AMD neovascular9,10,18,19,20. מתפוצצים Choroid ניתן לבודד מעכברים, כמו גם חולדות ובני אדם17,21. explant choroid כולל ECs, מקרופאגים, ו pericytes17. בהבחנה זו את האינטראקציה בין ECs choroidal ותאים סמוכים כגון תאי RPE, לעזור להבהר את המנגנוני...

Dysregulation אנגיוגנזה Choroidal קשורה ניוון מקולרי הקשורות לגיל neovascular (AMD)1. הצ'רואיד היא מיטה מיקרוווסקולרית מתחת לאפיתל הפיגמנט הרשתית (RPE). הוכח כי זרימת דם מופחתת choroid קשורה להתקדמות של AMD2. הקשר המורכב בין אנדותל כלי דם, RPE, מקרופאגים, קרום הלב ותאים אחרים אחראי על הונוסטזיסשל הרקמה 3,4,5. לכן, בדיקה לשחזור מידול microenvironment choroidal הוא קריטי לחקר AMD neovascular.
Ex vivo angiogenesis בדיקות ותרבויות תאים אנדותל במבחנה יכול להשלים מחקרים של התנהגות microvascular ב vivo, לבדיקת תרופות חדשות למחקרים של פתוגנזה. תאים אנדותל כגון תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של רשתית אנושית (HRMECs), תאי אנדותל ורידים טבורים אנושיים (HUVEC), מוח ראשוני מבודד של בעלי חיים או ECs רשתית משמשים לעתים קרובות במחקרים במבחנה למחקר אנגיוגנזהעינית 6,7,8. HRMECs בפרט שימשו באופן נרחב כמודל של ניאו-וסקולריזציה במבחנה (CNV)9 על ידי הערכת התפשטות אנדותל, הגירה, היווצרות צינורית, דליפה כלי דם כדי להעריךהתערבויות 6,10. עם זאת, ECs בתרבות מוגבלים כמודל של CNV בגלל חוסר אינטראקציות עם סוגי תאים אחרים שנמצאו choroid ומכיוון שרוב EC בשימוש ב- assays אלה אינם מקורם choroid. עכבר choroidal ECs קשה לבודד ולשמור בתרבות.
הערכה טבעת האאורטיק נעשה שימוש נרחב כמודל של התפשטות כלי דם מאקרו. נבטים של כלי דם מאקסים של מפתחי הדם כוללים מחשבים אלקטרוניים, פריציטים ומאקרופאגים11. מרשם טבעת האאורטיק מדגים היטב אנגיוגנזה כלי גדול12,13,14. עם זאת, יש לו מגבלות כמודל של neovascularization choroidal כמו טבעות גוף העורקים הם רקמה macrovascular חסר את הסביבה המיקרו-וסקולרית choroidal אופייני, נבטים מכלי גדולים עשויים להיות שונים נבטים מרשתות נימי מעורב פתולוגיה מיקרוווסקולרית. לאחרונה פרסמה קבוצה את ההתדגם הרשתית לשעבר Vivo15,16. אמנם, הוא מתאים למחלות neovascular רשתית, זה לא מתאים עבור neovascularization choroidal כפי שניתן לראות ב- AMD.
המדגימה הנבטת choroidal באמצעות העכבר RPE, choroid, ואת הרקמה explanted scleral פותחה כדי מודל טוב יותר CNV. הרקמה יכולה בקלות להיות מבודדת מעכבר (או מינים אחרים)עיניים 17. בדיקה זו מאפשרת הערכה לשחזור של פוטנציאל פרו ואנטי אנגיוגני של תרכובות פרמקולוגיות והערכת התפקיד של מסלולים ספציפיים neovascularization choroidal באמצעות רקמה מעכברים מהונדסים גנטיתשולט 18. זה נביעה ניצנים choroidal כבר התייחס בפרסומים רביםהבאים 9,10,18,19,20. כאן, השיטה המעורבת בשימוש בהוכחה זו מוכחת.

<table><tbody><tr><td>AnaSed (קסילזין)</td> <td>AKORN</td><td>59339-110-20</td><td></td></tr><tr><td>תמצית קרום בסיס (BME) Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים</td><td>NEST</td><td>704001</td><td>10 ס"מ</td></tr><tr><td>מדיום קלאסי שלם עם סרום ומערכות תאים CultureBoost</td><td></td><td>4Z0-500</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול אתילי 200 הוכחה</td> לשימוש <td>111000200 פארמקו</td><td></td><td>עבור 70% </td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>ZEISS</td><td>Axio Observer Z1</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td>10000 U/mL</td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות (24 בארות)</td><td>אולימפוס</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>VetaKet CIII (קטמין)</td><td>AKORN</td><td>59399-114-10</td><td></td></tr></tbody></table>

אקס ויוו צ'רויד נבט א-סאי של אנגיוגנזה מיקרו-וסקולרית עינית

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

אנגיוגנזה פתולוגית choroidal, תכונה בולטת של ניוון מקולרי הקשור לגיל, מוביל ליקוי ראייה ועיוורון. בדיקות התפשטות תאי אנדותל (EC) באמצעות תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית אנושית (HRMECs) או ECs רשתית ראשונית מבודדת נמצאים בשימוש נרחב במודלים במבחנה לחקר אנגיוגנזה ברשתית. עם זאת, בידוד טהור מורין תאי אנדותל רשתית הוא מאתגר מבחינה טכנית ECs רשתית עשוי להיות תגובות התפשטות שונות מאשר תאי אנדותל choroidal ואינטראקציות תאים / תאים שונים. מאוד לשכפל לשעבר vivo choroidal נבטים בדיקה כמודל של התפשטות כלי דם microvascular choroidal פותחה. מודל זה כולל את האינטראקציה בין כלי דם choroid (EC, מקרופאגים, pericytes) ו אפיתל פיגמנט רשתית (RPE). עכבר RPE/ choroid / מתפוצצים scleral מבודדים דגירה תמצית קרום בסיס מופחת גורם גדילה (BME) (יום 0). מדיום משתנה כל יומיים ונבט choroid הוא כימת ביום 6. התמונות של explant choroid בודדים נלקחים עם מיקרוסקופ פאזה הפוך ואת האזור נבט הוא לכמת באמצעות תוסף מאקרו אוטומטי למחצה לתוכנת ImageJ שפותחה במעבדה זו. בדיקה זו להתרבות לשכפל לשעבר vivo choroidal נבטים ניתן להשתמש כדי להעריך תרכובות לטיפול פוטנציאלי עבור מחקר מחלות מיקרוווסקולריות כדי להעריך מסלולים המעורבים התפשטות כלי מיקרו choroidal באמצעות סוג הבר רקמת עכבר מהונדסים גנטית.

השוואה של צמיחה נביעה choroid ליום
ניתרנו את הצ'רויד עם סקלרה, מוטבע ב-BME ותרבתנו אותם במשך 6 ימים(איור 1). נביעה choroid בעכברים C57BL/6J מיום 3 ליום 6 נבדקו עם מיקרוסקופ וכמתו עם SWIFT-Choroid שיטת כימות אוטומטית למחצה ImageJ. במקרה מייצג, שטח הנביטה של הכורואידל (כלי השיט המשתרעים מן ההקרבה, למעט האקספלנט עצמו) היה 0.38 מ"מ2 ביום 3 (איור 3A),1.47 מ"מ2 ביום 4 (איור 3B),</s...

פרוטוקול זה מציג בדיקה נבטי choroid, מודל vivo לשעבר של התפשטות מיקרוווסקולרית. בדיקה זו יכולה לשמש כדי להעריך מסלולים המעורבים בהתרבות כלי מיקרו choroidal ולהעריך טיפולים תרופתיים באמצעות סוג פראי רקמת עכבר מהונדסים גנטית.

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...

בדיקת כורואיד זו ניתנת לשחזור ורלוונטית למחקר אנגיוגנזה כורואידלית וניוון מקולרי הקשור לגיל, AMD זה יכול להחמיא למחקרי in vivo של התנהגות מיקרו-וסקולרית. בדיקה זו יכולה לשמש לסינון תרכובות כטיפולים פוטנציאליים ל-AMD ניאו-וסקולרי או להערכת מסלולים המעורבים בניאווסקולריזציה כורואידלית באמצעות רקמת עכבר מסוג בר ורקמת עכבר מהונדסת גנטית. כדי להתחיל, הוסיפו חמישה מיליליטר של פניצילין, סטרפטומיצין ו-10 וחמישה מיליליטר של תוספי מזון זמינים מסחרית ל-500 מיליליטר של מדיום קלאסי שלם עם סרום, ואז הפשירו 50 מיליליטר של המדיום להפשיר את תמצית קרום הבסיס או BME למשך הלילה במקרר בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס.שים קרחון של מדיום קלאסי שלם על הקרח. נקה את המיקרוסקופ המנתח, המלקחיים והמספריים עם 70% אתנול. התכוננו לצלחות תרבית תאים ולהניח אחת על מיקרוסקופ הדיסקציה והשנייה על קרח.לאחר מכן הוסיפו 10 מיליליטר של מדיום קלאסי שלם לכל מנה. שמור את העיניים במדיום קלאסי שלם על קרח לפני הניתוח. הסר את רקמת החיבור ועצב הראייה ולאחר מכן השתמש במספריים זעירים כדי לחתוך באופן היקפי 0.5 מילימטר אחורי לימבוס הקרנית.הסר את קומפלקס הקשתית של הקרנית, הזגוגית ואל העדשה. בצע חתך של מילימטר אחד בניצב לקצה החתוך לכיוון עצב הראייה וכדי לחתוך פס היקפי ברוחב מילימטר אחד ואז להפריד בין האזורים המרכזיים וההיקפיים של המתחם. השתמש במלקחיים כדי לקלף את הרשתית מקומפלקס RPE כורואיד סקלרה.שמור את רצועת הכורואיד ההיקפית במדיום קלאסי שלם על קרח. בודדו את העין השנייה וחזרו על התהליך כדי לחתוך רצועה שנייה. חותכים את הרצועה העגולה לחמש עד שש חתיכות מרובעות שוות בערך.הוסף 30 מיקרוליטר של ה-BME המופשר למרכז כל באר של צלחת תרבית רקמות של 24 בארות. וודאו כי טיפת ה- BME יוצרת כיפה קמורה בתחתית הצלחת מבלי לגעת בקצוות. הנח את הרקמה באמצע ה-BME.אין לשטח את צמח הכורואיד X. תן לרקמה להתרחב בתוך ה-BME. דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לתת לג'ל להתמצק, ואז הוסיפו 500 מיקרוליטר של מדיום קלאסי שלם לכל באר.החלף את המדיום הקלאסי כל יומיים. ניתן לצפות בהנבטת כורואיד לאחר שלושה ימים במיקרוסקופ. פתח את תמונת הנביטה של הכורואיד עם תמונה J ובדוק תמונה, סוג ושמונה סיביות בקנה מידה אפור.לאחר מכן מטב את הניגודיות על ידי בחירת תמונה, התאמה, ניגודיות בהירות והתאמתה. השתמש בפונקציית שרביט הקסמים כדי לשרטט ולהסיר את רקמת הכורואיד הנמצאת במרכז הנבטים. הסירו את הרקע של התמונה בעזרת כלי הבחירה החינמיים.לאחר מכן, עבור לתמונה, התאם את הסף והשתמש בפונקציית הסף כדי להגדיר את הנבטים המיקרו-וסקולריים על הרקע בפריפריה. לחץ על F2 וסיכום יופיע. לחץ על שמור כדי לשמור תמונה של האזור שנבחר באותה תיקייה שבה נמצאת התמונה המקורית לעיון עתידי.לאחר מדידת קבוצת דגימות, העתק את הנתונים המוקלטים לניתוח. פרוטוקול זה שימש לבחינה וכימות של נביטת כורואיד בעכברי C 57, שישה עכברי J שחורים מהיום השלישי עד היום השישי. במקרה מייצג, שטח ההנבטה הכורואידלי היה 0.38, 1.47, 5.62 ו-10.09 מילימטרים בריבוע בימים השלישי, הרביעי, החמישי והשישי, בהתאמה.ההשפעות של אובדן FFAR4 על נביטת כלי דם כורואידליים הוערכו באמצעות מבחן הנבטת כורואיד בעכברי FFAR4 4 נוקאאוט ו-FFAR4 מסוג בר. אזור ההנבטה בעכברי נוקאאוט FFAR4 הגדיל את צמיחת כלי הדם הכורואידליים בהשוואה לסוג הבר FFAR4 ביום השישי. יתר על כן, טיפול באגוניסט FFAR4 מיקרו-מולרי אחד הפחית את אזור ההנבטה הכורואידלי בהשוואה לעכברים שלא טופלו ביום השישי.בדיקה זו מאפשרת הערכה ניתנת לשחזור של הפוטנציאל האנטי-אנגיוגני של תרכובות פרמקולוגיות ושינוי התפקיד של מסלולים ספציפיים ב-Choroidal Neovascularization באמצעות רקמת עכברים מהונדסת גנטית.

an-ex-vivo-choroid-sprouting-assay-ocular-microvascular

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הקרנית היא ייחודית בכך שהיא חסרה רקמות כלי הדם. עם זאת, כלי דם חזקים צמיחה והישרדות יכול להיגרם על הקרנית על ידי גורמים angiogenic עוצמה. לכן, הקרנית יכול לספק לנו עם כלי רב ערך עבור מחקרים angiogenic. פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע את המודל של העכבר assay הקרנית כיס וכיצד להעריך את אנגיוגנזה המושרית על ידי גורמים angiogenic באמצעות המודל הזה.

במודל עכבר של Assay את הקרנית Pocket לחקר אנגיוגנזה

סרטון זה מדגים בדיקה מבוססת חרוזים מיקרו-נשאים המשלבת פריציטים לחקר הנבטת אנדותל בשלבים המוקדמים של אנגיוגנזה. הבדיקה מספקת מודל ניסויי במבחנה להבנת מנגנונים מולקולריים של אנגיוגנזה ואת ההשפעה של טיפולים אנטי-אנגיוגנטיים.

בדיקת הנבטת חרוזים להערכת אנגיוגנזה בשלב מוקדם: מודל מבוסס חרוזים במבחנה לחקר הנבטת אנדותל בנוכחות פריציטים

סרטון זה מדגים את הפיתוח של מודל ex vivo של הנבטה כורואידית לחקר אנגיוגנזה מיקרו-וסקולרית עינית. הבדיקה כוללת תרבית של צמחי עין עכבר המכילים את רקמת הכורואיד המחוברת ללובן העין ולאפיתל פיגמנט הרשתית בתנאים ספציפיים המקדמים הנבטה מיקרו-וסקולרית כורואידית.

בדיקת הנבטת כורואיד לחקר התפשטות כלי דם עיניים Ex Vivo

הרשתית העכברית הילוד מספקת מודל מאופיין היטב פיסיולוגי של אנגיוגנזה, המאפשר חקירה של התפקידים של גנים או תרופות שונים המווסתים אנגיוגנזה...

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

הפרוטוקול מתאר את assay micropocket הקרנית כפי שפותח בעכברים.

קרנית Micropocket Assay: דגם של אנגיוגנזה בעין העכבר

אנגיוגנזה כוללת אינטראקציות רב-תאיות ורב-מערכתיות שיש לחקור בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. מטרת מחקר זה היא להדגים את יכולתו של מודל תרבית המזנטריה של חולדות לבצע השוואות זמן-lapse של רשתות מיקרו-וסקולריות שלמות במהלך אנגיוגנזה.

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; שיטת הדמיה זמן לשגות של רשתות כלי הדם Mesenteric עכברוש מתורבתות

מאמר זה מציג נוהל מקיף כדי להעריך במבחנה אם אנגיוגנזה קלאסי קיימת ב- hemangioblastomas (HBs) ותפקידו HBs. התוצאות להאיר את המורכבות של HB-כורוידאלית, מציע כי זו הצורה השכיחה של אנגיוגנזה הוא רק מנגנון משלים ב- HB-כורוידאלית.

נוהל מקיף כדי להעריך את ביצועי במבחנה כורוידאלית Hemangioblastoma בשם משתמש את ספרואיד הלבלוב Assay

שיטה זו מתארת את התרבות של תאים מבוססי iPSC-נגזרות כמו 40 מיקרוכלי תלת-ממד של מיקרו בפלטפורמת microfluאידיג מתוקננת. פלטפורמה זו מאפשרת לימוד של לבלוב אנגיוגנטית מונחה הדרגתי ב-3D, כולל השקה וייצוב של נבטי האנגיוגנטי באופן מדרגי ותפוקה גבוהה.

שיטת הלימוד הסטנדרטית והמדמדית למחקר בלבלוב אנגיוגנטית בתלת-ממד של התאים הנגזרים מתוך מבחנה

בדיקה זו משתמשת בתאי גזע עובריים של עכברים המתמיינים לגופי עובר בתרבית בג'ל קולגן תלת-ממדי כדי לנתח את התהליכים הביולוגיים השולטים באנגיוגנזה נובטת במבחנה. הטכניקה יכולה להיות מיושמת לבדיקת תרופות, מידול מחלות, ולחקר גנים ספציפיים בהקשר של מחיקות קטלניות עוברית.

במבחנה בדיקת הנבטה תלת מימדית של אנגיוגנזה באמצעות תאי גזע עובריים של עכבר לצורך מידול מחלות כלי דם ובדיקות סמים

מחקר זה מציג את בדיקת נדידת פצעי השריטה הדו-ממדית (2D) ואת בדיקת הנבטת הספרואידים התלת-ממדית (3D), יחד עם שיטות הניתוח שלהם במורד הזרם, כולל מיצוי RNA ואימונוציטוכימיה, כבדיקות מתאימות לחקר אנגיוגנזה במבחנה.

חקירת אנגיוגנזה ברמה תפקודית ומולקולרית על ידי מינוף בדיקת נדידת פצע השריטה ובדיקת הנבטת הספרואיד

הנבטת אנגיוגנזה, הבסיסית להתפתחות ומחלות, כרוכה בתהליכים מולקולריים ומכניים מורכבים. אנו מציגים מודל 2.5D ex vivo רב-תכליתי המנתח נביטה תאית מעורקי הצוואר החזיריים, וחושף אנגיוגנזה תלוית קשיחות ומכניקת תאים מובילה-עוקב מובהקת. מודל זה מסייע בקידום אסטרטגיות הנדסת רקמות וגישות לטיפול בסרטן.

מודל 2.5D לאפיון מכני ex vivo של אנגיוגנזה מונבטת ברקמה חיה

למדו שיטת אקס ויוו לחקר אנגיוגנזה מיקרו-וסקולרית עינית באמצעות מודל נבט כורואידי בעכברים. השיטה מאפשרת הערכת תרופות ומסלולי מולקולריים בניווסקולריזציה כורואידלית ובניוון מקולרי קשור לגיל.

אקס ויוו צ'רויד נבט א-סאי של אנגיוגנזה מיקרו-וסקולרית עינית

גלה סרטונים נוספים