אקס ויוו צ'רויד נבט א-סאי של אנגיוגנזה מיקרו-וסקולרית עינית
6 באוגוסט 2020
פרוטוקול זה מציג בדיקה נבטי choroid, מודל vivo לשעבר של התפשטות מיקרוווסקולרית. בדיקה זו יכולה לשמש כדי להעריך מסלולים המעורבים בהתרבות כלי מיקרו choroidal ולהעריך טיפולים תרופתיים באמצעות סוג פראי רקמת עכבר מהונדסים גנטית.
בדיקת כורואיד זו ניתנת לשחזור ורלוונטית למחקר אנגיוגנזה כורואידלית וניוון מקולרי הקשור לגיל, AMD זה יכול להחמיא למחקרי in vivo של התנהגות מיקרו-וסקולרית. בדיקה זו יכולה לשמש לסינון תרכובות כטיפולים פוטנציאליים ל-AMD ניאו-וסקולרי או להערכת מסלולים המעורבים בניאווסקולריזציה כורואידלית באמצעות רקמת עכבר מסוג בר ורקמת עכבר מהונדסת גנטית. כדי להתחיל, הוסיפו חמישה מיליליטר של פניצילין, סטרפטומיצין ו-10 וחמישה מיליליטר של תוספי מזון זמינים מסחרית ל-500 מיליליטר של מדיום קלאסי שלם עם סרום, ואז הפשירו 50 מיליליטר של המדיום להפשיר את תמצית קרום הבסיס או BME למשך הלילה במקרר בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס.
שים קרחון של מדיום קלאסי שלם על הקרח. נקה את המיקרוסקופ המנתח, המלקחיים והמספריים עם 70% אתנול. התכוננו לצלחות תרבית תאים ולהניח אחת על מיקרוסקופ הדיסקציה והשנייה על קרח.
לאחר מכן הוסיפו 10 מיליליטר של מדיום קלאסי שלם לכל מנה. שמור את העיניים במדיום קלאסי שלם על קרח לפני הניתוח. הסר את רקמת החיבור ועצב הראייה ולאחר מכן השתמש במספריים זעירים כדי לחתוך באופן היקפי 0.5 מילימטר אחורי לימבוס הקרנית.
הסר את קומפלקס הקשתית של הקרנית, הזגוגית ואל העדשה. בצע חתך של מילימטר אחד בניצב לקצה החתוך לכיוון עצב הראייה וכדי לחתוך פס היקפי ברוחב מילימטר אחד ואז להפריד בין האזורים המרכזיים וההיקפיים של המתחם. השתמש במלקחיים כדי לקלף את הרשתית מקומפלקס RPE כורואיד סקלרה.
שמור את רצועת הכורואיד ההיקפית במדיום קלאסי שלם על קרח. בודדו את העין השנייה וחזרו על התהליך כדי לחתוך רצועה שנייה. חותכים את הרצועה העגולה לחמש עד שש חתיכות מרובעות שוות בערך.
הוסף 30 מיקרוליטר של ה-BME המופשר למרכז כל באר של צלחת תרבית רקמות של 24 בארות. וודאו כי טיפת ה- BME יוצרת כיפה קמורה בתחתית הצלחת מבלי לגעת בקצוות. הנח את הרקמה באמצע ה-BME.
אין לשטח את צמח הכורואיד X. תן לרקמה להתרחב בתוך ה-BME. דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לתת לג'ל להתמצק, ואז הוסיפו 500 מיקרוליטר של מדיום קלאסי שלם לכל באר.
החלף את המדיום הקלאסי כל יומיים. ניתן לצפות בהנבטת כורואיד לאחר שלושה ימים במיקרוסקופ. פתח את תמונת הנביטה של הכורואיד עם תמונה J ובדוק תמונה, סוג ושמונה סיביות בקנה מידה אפור.
לאחר מכן מטב את הניגודיות על ידי בחירת תמונה, התאמה, ניגודיות בהירות והתאמתה. השתמש בפונקציית שרביט הקסמים כדי לשרטט ולהסיר את רקמת הכורואיד הנמצאת במרכז הנבטים. הסירו את הרקע של התמונה בעזרת כלי הבחירה החינמיים.
לאחר מכן, עבור לתמונה, התאם את הסף והשתמש בפונקציית הסף כדי להגדיר את הנבטים המיקרו-וסקולריים על הרקע בפריפריה. לחץ על F2 וסיכום יופיע. לחץ על שמור כדי לשמור תמונה של האזור שנבחר באותה תיקייה שבה נמצאת התמונה המקורית לעיון עתידי.
לאחר מדידת קבוצת דגימות, העתק את הנתונים המוקלטים לניתוח. פרוטוקול זה שימש לבחינה וכימות של נביטת כורואיד בעכברי C 57, שישה עכברי J שחורים מהיום השלישי עד היום השישי. במקרה מייצג, שטח ההנבטה הכורואידלי היה 0.38, 1.47, 5.62 ו-10.09 מילימטרים בריבוע בימים השלישי, הרביעי, החמישי והשישי, בהתאמה.
ההשפעות של אובדן FFAR4 על נביטת כלי דם כורואידליים הוערכו באמצעות מבחן הנבטת כורואיד בעכברי FFAR4 4 נוקאאוט ו-FFAR4 מסוג בר. אזור ההנבטה בעכברי נוקאאוט FFAR4 הגדיל את צמיחת כלי הדם הכורואידליים בהשוואה לסוג הבר FFAR4 ביום השישי. יתר על כן, טיפול באגוניסט FFAR4 מיקרו-מולרי אחד הפחית את אזור ההנבטה הכורואידלי בהשוואה לעכברים שלא טופלו ביום השישי.
בדיקה זו מאפשרת הערכה ניתנת לשחזור של הפוטנציאל האנטי-אנגיוגני של תרכובות פרמקולוגיות ושינוי התפקיד של מסלולים ספציפיים ב-Choroidal Neovascularization באמצעות רקמת עכברים מהונדסת גנטית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מציג בדיקת ניבוב כורואידית (choroid sprouting assay) כמודל ex vivo לחקר פרוליפרציה של מיקרו-כלי דם, במיוחד בהקשר של אנגיוגנזה כורואידית וניאובסקלריזציה של ניוון רשתית תלוי גיל (AMD). הבדיקה מאפשרת להעריך מסלולים המעורבים בפרוליפרציה של מיקרו-כלי דם בכורואיד ולבחון טיפולים תרופתיים באמצעות רקמות של עכברים מסוג בר (wild type) ועכברים שעברו שינוי גנטי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- אנגיוגנזה של הכורואיד
- ניוון רשתית תלוי גיל (AMD)
- התנהגות מיקרו-וסקולרית
רקע
- חשיבותה של אנגיוגנזה כורואידית במחלות עיניים
- מודלים ex vivo המשלימים מחקרים in vivo
- מודלים של עכברים שעברו שינוי גנטי להעמקת התובנות
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בדיקת נבטות של הכורואיד (Choroid sprouting assay)
- שימוש ברקמות עכבר מזנים מסוג wild type ומזנים שעברו מודיפיקציה גנטית
- מיקרוסקופיה לצפייה בנבטות של הכורואיד
תוצאות עיקריות
- הבדיקה מאפשרת מדידות הדירות של ניבצנות כורואידית לאורך מספר ימים
- אובדן של FFAR4 בעכברי knockout הגביר את הצמיחה הווסקולרית הכורואידית בהשוואה לסוג הפרא (wild type)
- טיפול עם אגוניסט של FFAR4 הפחית את שטח הניבצנות הכורואידית בעכברי knockout
מסקנות
- המחקר מדגים את יעילות הבדיקה בהערכת הפוטנציאל האנטי-אנגיוגני של תרכובות פרמקולוגיות
- הוא מדגיש את תפקידן של מסלולי איתות ספציפיים בנאווסקולריזציה של הכורואיד (choroidal neovascularization)
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקת הניבוב של הכורואיד ex vivo מספקת מודל הניתן לשחזור להערכת פרולפרציה של מיקרו-כלי דם בכורואיד, הרלוונטית ישירות לגילוי תרופות עבור ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD) נאווסקולרי. היא מאפשרת הפחתת סיכונים מנגנונית של מסלולים אנגיוגניים באמצעות רקמות עכבר מסוג wild-type ורקמות שעברו שינוי גנטי, ובכך תומכת בתיקוף מטרות ובזיהוי מועמדים מובילים (leads) בקווי פיתוח אופתלמולוגיים. הבדיקה מגשרת בין ביולוגיה של גילוי להערכה פרה-קלינית על ידי כימות דינמיקת הניבוב במערכת של נתח רקמה (explant) רלוונטית פיזיולוגית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטי
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי מדידת ניבוב כורואידי (choroidal sprouting) בתגובה למודולציה גנטית או פרמקולוגית של מסלולים אנגיוגניים.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות כגון FFAR4 בהקשר של רקמה רב-תאית הכוללת אנדותל, מקרופאגים, פריציטים ו-RPE.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי כימות השפעות תלויות-מינון של תרכובות על ניבוב מיקרו-וסקולרי לאורך זמן.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר תוצאות כמותיות מבוססות דימוי של שטח הנביטה המשקפות היווצרות של רשת מיקרו-וסקולרית תחת תנאים מבוקרים.
- ערך תפעולי: משתמש בזריעה סטנדרטית של רקמות (explants) ב-BME עם ריכוז מופחת של גורמי גדילה ובלוחות זמנים מוגדרים להחלפת המצע, כדי להבטיח הדירות בין ניסויים.
- יכולת הרחבה: תואם לפורמט של פלטה בעלת 24 בארות ולניתוח חצי-אוטומטי ב-ImageJ לצורך סריקת תרכובות בתפוקה בינונית עד גבוהה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על המבנה הטבעי של הכוראודה-RPE-סקלרה, ובכך משמר אינטראקציות בין-תאיות הקריטיות למידול של אנגיוגנזה פתופיזיולוגית.
- ערך תפעולי: מאפשר השוואה ישירה בין רקמות מסוג wild-type לרקמות knockout (למשל, FFAR4) כדי לבודד תרומות גנטיות לפנוטיפים של ניבוב (sprouting).
- ערך חיזוי: מאפשר הערכה של השפעות אגוניסט/אנטגוניסט על ניבוב, ובכך מספק ראיות פרה-קליניות למודולציה של המסלול.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי בתחום האופתלמולוגיה, החל מתיקוף המטרה, דרך אופטימיזציה של המולקולה המובילה, ועד לבדיקות יעילות פרה-קליניות, ובמיוחד עבור אסטרטגיות אנטי-אנגיוגניות ב-AMD.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי רגולטורים אנגיוגניים על ידי כימות שינויים בבקיעה (sprouting) בתגובה לעיכוב או הפעלה של מסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מספק מדדי בקיעה כמותיים וניתנים לשחזור, המאפשרים דירוג של השפעות תרכובות בפורמט מבוסס רקמה.
- אנליטיקה: מספק מדידות מבוססות שטח ברזולוציית זמן (למשל, מיום 3 ליום 6), התומכות בניתוח קינטי של תגובות מיקרו-וסקולריות.
- מחקר תרגומי: משתמש בנתיחים (explants) רלוונטיים למחלה כדי למדל נאו-וסקולריזציה של הכורואיד, ובכך מקל על האקסטרפולציה למודלים של AMD in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר להערכת תרכובות מרובות או מודלים גנטיים לאורך פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי קישור הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות לתוצאות ניבט (sprouting) כמותיות בהקשר של רקמה טבעית.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים לבידוד רקמה, זריעה על BME, החלפת מצע ודימוי.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות של go/no-go על ידי אספקת ראיות מוקדמות מבוססות רקמה לפעילות אנטי-אנגיוגנית לפני בדיקות in vivo.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות בהתאם לסיכון, על בסיס נתוני תגובה למנה ותיקוף גנטי.
שיקולים ליישום
- נדרשת מומחיות בדיסקציה של רקמות עכבר ובידוד אקספלנטים בתנאים סטריליים.
- תלוי בגישה לתמצית ממבנה בסיס (BME) עם רמה מופחתת של גורמי גדילה ובמיקרוסקופיית ניגודיות פאזה (Phase-contrast).
- מחייב תהליכי עבודה סטנדרטיים לניתוח תמונות (למשל, מאקרו של ImageJ) לצורך כימות עקבי של הניצצים (sprouting).
- יש להתחשב בשונות בגודל האקספלנט ובחיוניות הרקמה בעת פרשנות מדדי הניצצים.
- מוגבל לרקמות עכבר; הבדלים בין מינים עשויים להשפיע על היכולת להשליך את הממצאים על ביולוגיה של הכורואיד האנושי.
