Name: הדמיה חיה של קולטני כימוקין בנויטרופילים של דגי זברה במהלך תגובות לפצעים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: חקור דינמיקת קולטני כימוקין בנויטרופילים של דגי זברה בתגובה לפצעים. השיטה משתמשת במיקרוסקופיה קונפוקלית לניתוח פנימול קולטנים CXCR1 ו-CXCR2 בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לכריסטין הולט וביל האריס על העזרה במיקרוסקופיה קונפוקלית. אנו מודים לדארן גילמור על מבני עמוד השדרה של הטיימר הפלואורסצנטי ואנה הוטנלוצ'ר על וקטור עמוד השדרה של טול 2-ליז. אנו מודים לסטיב רנשו על קו Tg (mpx:GFP)i114 . עבודה זו נתמכה על ידי MRC (MR/L019523/1), קרן Wellcome [204845/Z/Z/16/Z]; אייזק ניוטון נאמנות [12.21(א)i] ומענק אייזק ניוטון נאמנות 19.23(n). C.C נתמך על ידי סטודנטית MRC DTP ובחלקו על ידי קרן Wellcome [204845/Z/Z/16/Z]; אייזק ניוטון נאמנות [12.21(א)i] מענק. H.W. נתמך על ידי סטודנטיות DTP MRC. H.P. נתמך על ידי מענק לדוקטורט של Wellcome Trust (105391/Z/Z/14/Z) ובחלקו על ידי קרן Wellcome [204845/Z/Z/Z/Z]; אייזק ניוטון נאמנות [12.21(א)i] מענק MRC (MR/ L019523/1).

<ol><li>Rot, A., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+innate+and+adaptive+host+defense%3A+basic+chemokinese+grammar+for+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells.</a> Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).</li>
<li>Cotton, M., Claing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptors+stimulation+and+the+control+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration.</a> Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+regulation+of+neutrophil+migration+by+mitogen-activated+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases.</a> Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).</li>
<li>Wen, X., Jin, T., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+G+Protein-coupled+Receptor-mediated+Chemotaxis+and+its+Signaling+Events+in+Neutrophil-like+HL60+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54511(2016).</li>
<li>Arnon, T. I., et al. GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArnon%2C+TI+%22Science%22">Science</a>. 333 (6051), 1898-1903 (2011).</li>
<li>Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+CCR2+Activation+in+the+Bone+Marrow+Niche+Mobilizes+Monocytes+by+Desensitizing+CXCR4%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4.</a> PloS One. 10 (6), 0128387(2015).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Donà, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+tissue+migration+through+a+self-generated+chemokine+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient.</a> Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).</li>
<li>Venkiteswaran, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+dynamics+of+an+endogenous%2C+self-generated+signaling+gradient+across+a+migrating+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue.</a> Cell. 155 (3), 674-687 (2013).</li>
<li>Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+receptor+internalization%2C+signaling+level%2C+and+precise+arrival+at+the+target+in+guided+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration.</a> Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).</li>
<li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microtubules+in+neutrophil+polarity+and+migration+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish.</a> Journal of Cell Science. 125, Pt 23 5702-5710 (2012).</li>
<li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+protrusion+and+polarity+by+PI3K+during+neutrophil+motility+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish.</a> Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).</li>
<li>Buchan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+line+for+in+vivo+visualisation+of+neutrophil+myeloperoxidase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase.</a> PLoS One. 14 (4), 0215592(2019).</li>
<li>Coombs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+trafficking+coordinates+neutrophil+clustering+and+dispersal+at+wounds+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish.</a> Nature Communications. 10 (1), 5166(2019).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42(2007).</li>
<li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li>
<li>Khmelinskii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+fluorescent+protein+timers+for+in+vivo+analysis+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio)</a>. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), 1115(2009).</li>
<li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDetrich%2C+HW+%22The+Zebrafish%3A+Genetics%2C+Genomics+and+Informatics%22">The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics</a>. , Elsevier. Burlington. (2004).</li>
<li>Le Guyader, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111 (1), 132-141 (2008).</li>
<li>Chan, T. F., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+contours+without+edges%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">Active contours without edges.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 10 (2), 266-277 (2001).</li>
<li>Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Textural+features+for+image+Classification%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Systems%2C+Man%2C+and+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">Textural features for image Classification.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).</li>
<li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+bacterial+infection+induces+systemic+activation+of+neutrophils+through+Cxcr2+signaling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).</li>
<li>Torraca, V., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+infection%3A+From+pathogenesis+to+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology.</a> Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).</li>
<li>Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+innate+immune+cell+sensing+of+transformed+cells+in+zebrafish+larvae%3A+parallels+between+tumor+initiation+and+wound+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation.</a> PLoS Biology. 8 (12), 1000562(2010).</li>
<li>Poplimont, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarming+in+damaged+tissue+is+orchestrated+by+connexins+and+cooperative+calcium+alarm+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals.</a> Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).</li>
<li>Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Zebrafish+and+CRISPR%2FCas9%3A+Toward+a+more+efficient+drug+discovery+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 703(2018).</li>
<li>Kienle, K., Lämmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarming%3A+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li>
<li>Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+tissue+repair+in+zebrafish+larvae+with+time-lapse+brightfield+stereomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52654(2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים

השיטה המתוארת מאפשרת הדמיה חיה של דינמיקת הקולטן בתגובה לליגנדים אנדוגניים במקום במהלך תגובה דלקתית לנזק לרקמות. השימוש בכתבי נויטרופילים Cxcr1/Cxcr2 יכול להיות מורחב להגדרות פיזיולוגיות אחרות, כגון זיהום, מודלים של גידולים או סוגים אחרים של נזק לרקמות 14,25,26,27. בנוסף, קווי הצלה מהונדסים, שבהם הקולטן האנדוגני מדוכא ומציל על ידי קולטן מוטציה אקסוגנית, יכולים לספק כלים שימושיים לנתח את החשיבות של דפוסי נדידת נויטרופילים ספציפיים בתגובות חיסוניות. לדוגמה, מוטציות קולטן Cxcr1 אשר לקוי desensitization לגרום קיבוץ נויטרופילים בולט יותר באתרים דלקתיים14. רווח זה של פנוטיפ פונקציה יכול לשמש כדי להבין את התפקיד של קהילת נויטרופילים בתהליכים פיזיולוגיים שונים, למשל, תיקון פצעים, מחלה זיהומית, או התפתחות הגידול, ולהשלים את הקולטן knockdown / ניסויי נוקאאוט. המתודולוגיה מספקת גם בסיס להרחבת מגוון הכתבים הזמינים. הבחירה של כתב פלואורסצנטי חשוב לשקול ותלוי בשאלה הביולוגית. מצאנו כי המחזור המכונן של קולטני כימוקין אלה בנויטרופילים היה גבוה, בהשוואה לתאי אפיתל, וכי כתבים עם התבגרות מהירה (למשל, sfGFP) נדרשו לדווח על רמות הממברנה במצב יציב ולפתור הבדלים על גירוי נויטרופיל 8,14. לכן, יחסי ממברנה של sfGFP / tagRFP אינם ישימים למדידת הפנמה הנגרמת על ידי ליגנד בסוג תא זה, אבל התבנית של tagRFP מאפשר מעקב אחר גורלות תאיים של הקולטן, אשר יכול להיות שימושי במחקרים מסוימים. מצאנו גם כי האות התאי המרוכז יותר של tagRFP שימושי לסינון זחלים בודדים. גישה חלופית למדידת רמות הקולטן בקרום הפלזמה תהיה לבטא במשותף סמן קרום פלואורסצנטי בנויטרופילים או באותו טרנסג'ן9 או בטרנסג'ן עצמאי14. בתרחיש הקודם הטרנסג'ן יספק אמצעי נוסף לסינון הדגים ורמות הביטוי יהיו דומות בין הסמן לקולטן. הגישה השנייה תהיה מודולרית יותר, בכך שקו דגי זברה עם כתב קולטן יכול להיות משולב עם קווים עיתונאיים שונים. בכל מקרה, ראוי לציין כי כימות הממברנה של רמות הקולטן מאתגר נויטרופילים מקובצים באשכולות (ראה להלן). לבסוף, נציין כי הרחבה אפשרית של פרוטוקול זה תהיה לעקוב אחר ההדמיה החיה על ידי אימונוהיסטוכימיה לניתוחי לוקליזציה מפורטים יותר.
מערכת Transgenesis Tol2 מבוססת היטב7 ומקדם lysozyme C שימש בהרחבה לביטוי נויטרופיל11,15. הגישה הטרנסגנזה היא, אם כן, פשוטה יחסית ורמת הביטוי שהושגה עם מקדם זה גבוהה מספיק כדי לספק ניגודיות מספקת לניתוח דינמיקת הקולטן. מגבלה אפשרית היא שרמת הביטוי אינה מסכמת מחדש את רמות הביטוי של קולטן אנדוגני. טכנולוגיות CRISPR חדשות ניתן לפרוס כדי להקים קווי נוק-אין עבור קולטנים של עניין מסוים28. טכנולוגיות אלה עדיין מסורבלות וייתכן שאינן מבטיחות את רמות הביטוי הנדרשות להדמיה תת-תאית, אך פיתוחן המוצלח יהווה פריצת דרך חשובה להבנת דינמיקת האיתות האנדוגנית. אימותים פונקציונליים חשובים לפענוח נתונים עם מבני קולטן מהונדסים. לדוגמה, ניתן להשתמש בבדיקות זיהוי ליגנד כדי לקבוע כי חלבון ההיתוך הפלואורסצנטי הוא פונקציונלי והצלה של פנוטיפים נוקאאוט יכול לשמש כדי לקבוע כי רמות ביטוי נויטרופיל מהונדס תואמות לפונקציונליות14. לבסוף, דרך ישירה יותר לאמת את היתוך הקולטן יהיה לנצל בדיקה פונקציונלית במבחנה עם קולטן מתויג לצד גרסאות שאינן מסומנותבתווית 14.
גישת הכימות מטפלת בקשיים ספציפיים בפילוח ממברנות מדויק בנויטרופילים ב- vivo. בתאים של טבע אפיתל, כימות של רמות הקולטן יכול להתבצע באופן אוטומטי על ידי נרמול רמות קולטן הממברנה לסמן בקרה, אשר יכול לבוא לידי ביטוי יחד או בנפרד9. אכן, יישמנו גישה כזו, כאשר אנו משתמשים בבדיקת זיהוי ליגנד בעובריםגסטריים 14. עם זאת, נויטרופילים עוברים שינויים מורכבים ומהירים בצורת התא ב- vivo, מה שהופך את פילוח הממברנה לקשה הן בדו-ממד והן בתלת-ממד14. זה אפילו יותר מאתגר כאשר נויטרופילים אשכול, אשר מתרחשת בהגדרות פיזיולוגיות רבות29. מדד הניגודיות מתגבר על מגבלה זו מכיוון שהוא אינו דורש פילוח ממברנות אלא משקף את המצב הכולל של התפלגות הקולטן בתא (membranous/smooth vs vesicular/dotty). חשוב לציין כי מדד הניגודיות יכול להיות מושפע מהניגודיות הכוללת של התמונה, ולכן נדרשת נורמליזציה של ערכי תאים בודדים להפניה פנימית כדי להסביר את השונות של האות בעוברים/דגימות שונים. לדוגמה, השתמשנו בערך הניגודיות הממוצע לתאים של נויטרופילים שאינם מגיבים ב- CHT (כלומר, נויטרופילים שנשארים נייחים ואינם נודדים לסנפיר הגחון)14. אפשרות נוספת תהיה לנרמל עם ערכי ניגודיות של סמן בקרה באותו תא. זה יספק פתרון כאשר הפניה פנימית של תאים שאינם מגיבים אינה זמינה ועשויה לפתור הבדלים כמותיים עדינים יותר בדינמיקת הקולטן בין תנאים שונים.
מיקום ההדמיה הוא משתנה נוסף שיש לקחת בחשבון. הסיבה לבחירת פצע הסנפיר הגחוני כאן, בניגוד לפצע סנפיר הזנב הנפוץ יותר מודל16,30, היא כי האתר של פציעה נמצא בקרבת האתר של מגורים נויטרופילים / מקור נודד. זה מאיץ את ציר הזמן של הבדיקה, כפי שלוקח יחסית מעט זמן עבור נויטרופילים להגיע. בנוסף, הוא מספק את ההזדמנות ללכוד את התנהגות התא הן במקור ההעברה (CHT) והן במיקום היעד של עניין (פצע). זה רלוונטי כאן, כי הרזולוציה המרחבית והזמן הנדרשת להדמיה תת-תאית קשה לשלב עם שדה ראייה גדול או סריקה מרובת מיקומים. לפיכך, בדיקת פצע הסנפיר הגחוני מאפשרת מעקב אחר התפתחות התגובה הנודדת ממקור הנדידה ולכידה סימולטנית של תנודות קולטן לא ספציפיות בתאים שאינם מגיבים. כפי שהוזכר לעיל, האחרון שימושי למטרות כימות כפי שהוא מספק התייחסות פנימית עבור דינמיקה לא ספציפית. במערכות אחרות, ייתכן שלא ניתן יהיה לקבל התייחסות פנימית כזו, ובמקרה זה ערכי הניגודיות של סמן קרום מבוטא במשותף יספקו שליטה חלופית.
לסיכום, אנו צופים כי המתודולוגיה חלה על מערכות אחרות וניתן לפרוס אותה למגוון מטרות. לדוגמה, אותם כתבים יכולים להיות מנוצלים בהגדרות דלקתיות אחרות, כגון הגדרות זיהום או מודלים אחרים של מחלות. הרפרטואר של קווי הכתב קולטן דגי הזברה יכול להיות מורחב לקולטני איתות אחרים, כדי להבין מנגנוני איתות או לדווח על דינמיקה ליגנד ב vivo. הגישה יכולה להיות משולבת עם טכניקות נוקאאוט / נוקאאוט כדי לחקור את הבסיס המכני של דינמיקה נצפית. לדוגמה, הפרעה של ביטוי ליגנד יכול להצביע על התלות ligand עבור דינמיקה קולטן נצפתה. בעתיד, אנו צופים כי המערכת יכולה להיות מעודנת עוד יותר לשלב נוק-אין החדרה של כתבים. בסופו של דבר, ממצאים המשתמשים במתודולוגיה זו יספקו תובנות חדשניות בעלות ערך מעבר לקהילת דגי הזברה, בהתחשב בשימור קולטני האיתות האלה ביונקים ובאתגר היחסי של עריכת מחקרים אלה באורגניזמים גדולים יותר.

נדידת לויקוציטים היא בעלת חשיבות עליונה לתגובות חיסוניות. תאי מערכת החיסון הם תאי נדידה טיפוסיים, המסוגלים להפליא לחצות רקמות וכלי דם ולחוש מגוון של רמזי הדרכה כימיים לנדוד לכיוון חיידקים או תאים מארחים אחרים בעלי חשיבות. הדרכה נכונה מסתמכת על ההכרה של כימותרפיה, ביניהם כימותרפיה מייצגת את הקטגוריה הבולטת ביותר1. כימותרפיה מזוהה על ידי קולטנים ספציפיים מאוד של חלבון 7 transmembrane G. עם כריכת כימוקין, קולטני כימוקין משנים קונפורמציה המובילה להפעלה של חלבוני G טרימריים הקשורים ואת הניתוק שלהם לתת-יחידות איתות פונקציונליות המקדמות שינויים ציטו-שלדיים ונדידה מכוונת1. משנית, קולטני chemokine הם זרחן, ושינוי זה מוביל desensitization למשוך, אשר יכול להיות ואחריו רגישות מחדש מהירה / מיחזור או השפלה תאית ורגולציה למטה מפני השטח של התא2. דינמיקה קולטן אלה להשפיע על משך ומינון של איתות שהתקבלו על ידי התאים אבל איך הם משפיעים על התנהגות הגירת לויקוציטים היה קשה להבהיר ב vivo.
מעקב אחר דינמיקת קולטנים בלוקוציטים חיים במערכות יונקים מסורתיות מתמודד עם מספר אתגרים. עבור מחקרים חיים, היתוך קולטן עם חלבונים פלואורסצנטיים חייב לבוא לידי ביטוי בתאים. זה מאתגר בלוקוציטים ראשוניים, במיוחד בנויטרופילים, ומחקרים עד כה השתמשו בקווי תאי נויטרופיל פונדקאיים כדי לבטא קולטני כימוקין 3,4. דור של מודלים עכבר מהונדסים, שבו לויקוציטים מבטאים קולטן פלואורסצנטי או קולטנים מוטנטיים עם פגמים מסחריים אינפורמטיביים 5,6, כרוך בהשקעה ניכרת של זמן ומשאבים. גם במקרים אלה, רזולוציית ההדמיה והניגודיות לדינמיקה של קולטן הדמיה בבעלי החיים יכולה להיות מוגבלת ומחקרים השתמשו באימונוהיסטוכימיה בקטעי רקמות קבועות5. בהתחשב באתגרים טכניים אלה, ההבנה שלנו כיצד דינמיקת קולטנים כימותרפיים משפיעה על התנהגות התאים בסביבת רקמות חיות מוגבלת כיום.
כאן אנו מספקים מתודולוגיה לניטור סחר בקולטן בנויטרופילים של דגי זברה. דגי זברה ניתנים למתיחה גנטית, כמו עכברים, אך טרנסגנזה היא יחסית פשוטה יותר באמצעות שימוש במערכות טרנספוזון יעילות ומניפולציה ישירה של זיגוטה7. הזחל השקוף מקובל באופן אידיאלי על הדמיה. הדינמיקה קולטן chemokine כבר דמיינו בתאי נבט קדמוניים ואת פרימוריום הקו לרוחב על ידי ביטוי של היתוך המתאים עם כתבים פלואורסצנטיים 8,9,10. זחלי דגי זברה מצוידים בנויטרופילים בוגרים בעלי תכונות גנטיות ותאיות שמורות מאוד ביחס לנויטרופילים של יונקים. דינמיקת איתות תת-תאית כגון דינמיקת שלד ציטוספת שלד ורגולטורים של קוטביות כבר דמיינו בתאים אלה על ידי הדור של קווים מהונדסים מתאימים 11,12,13. לאחרונה, דמיינו וניתחנו פונקציונלית דינמיקה של קולטן כימוקין בנויטרופילים במהלך תגובות דלקתיות לנזק לרקמות14. כאן, אנו מתארים את הדור של קווי כתב מהונדסים לאיתות כימוקין בנויטרופילים, הכנת עוברים להדמיה חיה, בדיקת פצעים לחקר איתות נויטרופילים והפרוטוקול לרכישה וניתוח של תמונות. אנו מספקים גם פרוטוקול צדדי כדי לבדוק תגובות קולטן chemokine ליגנדים מועמדים, אשר שימושי בעת ניסיון להקים דפוסי זיהוי ליגנד בקולטנים לא אופייניים. טכניקות אלה ניתן להשתמש בשילוב עם מניפולציות גנטיות נוספות, כגון עיכוב של ביטוי כימוקין אנדוגני או דור של קולטנים מוטנטיים עם סחר מושרה ליגנד שונה, כדי לחקור כיצד דינמיקת איתות ספציפית להשפיע על התנהגות לויקוציטים ב vivo. הקווים הטרנסגניים המבטאים קולטני chemokine מתויגים פלואורסצנטית יכולים לשמש גם ככתבים עבור שיפועים כימוקין אנדוגני, אשר אחרת קשה לזהות על ידי כתמי נוגדנים ישירים. המתודולוגיה המתוארת מספקת היקף להרחבת דור הכתבים לקולטנים אחרים של איתות חיסוני.

<table><tbody><tr><td>1-phenyl-2-thiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-25G</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל CellStar צינור צנטריפוגה</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>קלארק נימי זכוכית</td><td>הרווארד מכשיר</td><td>30-0020</td><td></td></tr><tr><td>Cleanline דק אקונומיקה</td><td>מדעית מעבדה אספקה</td><td>CLE0301</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח היקף</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>תנור חימום</td><td>Dri Block Techne</td><td>FDB02AD</td><td></td></tr><tr><td>המכונים</td><td>הלאומיים לבריאות פיג'י, בת'סדה, MD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים, תכשיטנים Dumont מס '5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>כלי מיקרובאר תחתונים מזכוכית</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה פסטור זכוכית</td><td>Fisherbrand</td><td>11795098</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 ערכת תמלול</td><td>Invitrogen</td><td>10391175</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>נקודת התכה נמוכה</td><td>agarose Invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>מעמד מגנטי</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתילן כחול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>מערכת מיקרו-הזרקה</td><td>פרקר</td><td>פיקוספריצר III</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה מיקרו-מעמיס</td><td>אפנדורף</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה</td><td>סאטר מכשיר חברה</td><td>בוער/חום P-97</td><td></td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופ</td><td>תרמו-מדעי</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PerkinElmer מסתובב דיסק UltraVIEW ERS, אולימפוס IX81 דיסק מסתובב מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>אולימפוס</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי (120 מ"מ)</td> <td>Grenier Bio-One Limited</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>פנול אדום</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>פולי (A) ערכת זנב</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>פריזמה</td><td>GraphPad תוכנה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מברשת צבע קטנה</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחקר יישומי ספקטרלי LMM5 מודול</td><td></td> לייזר <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>להב אזמל כירורגי מס' 23</td><td>Swann-Morton</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine MS222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת Volocity</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Yokogawa CSU10 סורק קונפוקלי דיסק מסתובב</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה חיה של קולטני כימוקין בנויטרופילים של דגי זברה במהלך תגובות לפצעים

Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

הדרכת לויקוציטים על ידי שיפועים כימיים חיונית לתגובות חיסוניות. נויטרופילים הם התאים הראשונים שגויסו לאתרים של נזק לרקמות שבהם הם מבצעים פונקציות מיקרוביאלית קריטיות. הסחר שלהם בלוקים אלה מתוזמר על ידי כמה כימותרפיה דלקתית, כולל כימותרפיה. ברמה המולקולרית, איתות כימותרפי מוסדר על ידי סחר תאי של הקולטנים המתאימים. עם זאת, עדיין לא ברור כיצד שינויים תת-תאיים בקולטני כימוקין משפיעים על דינמיקת נדידת לויקוציטים ברמת התא והרקמות. כאן אנו מתארים מתודולוגיה להדמיה חיה וניתוח כמותי של דינמיקה קולטן כימוקין בנויטרופילים במהלך תגובות דלקתיות לנזק לרקמות. כלים אלה חשפו כי דיפרנציאל chemokine קולטן סחר נויטרופילים נויטרופילים מתאם קיבוץ נויטרופילים ופיזור באתרים של נזק לרקמות. יש לכך השלכות על הבנתנו כיצד תגובות דלקתיות נפתרות מעצמן. הכלים המתוארים יכולים לשמש להבנת דפוסי נדידת נויטרופילים במגוון הגדרות פיזיולוגיות ופתולוגיות וניתן להרחיב את המתודולוגיה לקולטנים אחרים של איתות.

פציעת סנפיר גחון מלווה בהתגייסות מהירה של נויטרופילים מה-CHT לסנפיר הגחון והתקבצות בשולי הפצע, תוך 30-60 דקות (איור 1). דמיינו את ההפצה של שני קולטני כימוקין, Cxcr1 ו- Cxcr2, המתבטאים על ידי נויטרופילים של דגי זברה24 ומכירים Cxcl8a ו- Cxcl8b14, באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב. יצרנו שני קווים מהונדסים מתאימים, Tg(lyz:Cxcr1-FT) ו- Tg(lyz:Cxcr2-FT), שבהם נויטרופילים מבטאים מבנה טיימר פלואורסצנטי (FT) של הקולטן, כלומר היתוך עם טנדם של sfGFP ו- tagRFP (איור 2 והפניה14). השימוש בשני הפלואורופורים נועד לאפשר ניטור של מגוון רחב של גורלות קולטנים ולספק הערכות של זמן תחלופת חלבונים בקרום הפלזמה, שכן קולטנים מסונתזים חדשים היו פלואורסצצים בירוק והופכים בהדרגה לאדומים ככל שהם מתבגרים 8,14. עם זאת, קולטנים אלה נמצאו בעלי מחזור מכונן מהיר בקרום פלזמה נויטרופיל וכי זמן המגורים היה קצר יותר מאשר זמן ההתבגרות של tagRFP, עם sfGFP מראה לוקליזציה ממברנה ו tagRFP מראה לוקליזציה של כלי רכב במצב יציב (וידאו משלים 1 ושופט14). לכן, התמקדנו בהפצה של sfGFP כדי לפקח על הפנמה הנגרמת על ידי ליגנד באתרים של נזק לרקמות. דפוס התפלגות הקולטן כונתה באמצעות מדד הניגודיות, המדווח על הבדלים בעוצמה בין הפיקסלים הסמוכים. הרציונל הוא שכאשר התפלגות הקולטן היא מממברנית וחלקה, ערך הניגודיות נמוך. כאשר התפלגות הקולטן היא שלפוחית ונקבה יותר, אז ערך הניגודיות גבוה (איור 3).
שיטה חלופית היא לכמת את היחס בין רמות הקולטן (עוצמת sfGFP) על פני רמות של סמן קרום בקרה למשל CFP ממברנה (mCFP) (איור 3). שתי השיטות יכולות לזהות הפנמת קולטן, כפי שצוין על ידי דפוס הפצת קולטן שלפוחית יותר ברחבי העולם בתא (ערך ניגודיות גבוה יותר) או רמות קולטן נמוכות יותר בקרום (יחס sfGFP / mCFP נמוך יותר). עם זאת, מדד הניגודיות יכול היה לזהות גם הפנמת קולטן באשכולות נויטרופילים בפצע, שבהם פילוח הממברנות היה פחות מדויק ולא ישים (איור 3). באמצעות מדד זה, הצלחנו לכמת את ההבדלים הנראים לעין בין סחר Cxcr1 ל- Cxcr2 בנויטרופילים בפצעים (איור 4 ווידאו משלים 2). Cxcr1-FT מופנם בתאים הממוקמים בפצע ואילו Cxcr2-FT נשאר מממברני בנויטרופילים בפצע (איור 4A-C, וידאו משלים 2 ווידאו משלים 3). דיכוי של Cxcl8a ו- Cxcl8b, באמצעות טיפול מורפולינו, השפיע באופן דיפרנציאלי על הפנמה Cxcr1-FT בפצעים (איור 4C,D). כדי לאמת עוד יותר כי Cxcr1-FT מגיב Cxcl8a, ביצענו בדיקות תגובה chemokine בעוברים מוקדמים. מצאנו כי Cxcr1-FT מופנם באופן משמעותי בעוברים שבהם Cxcl8a התבטא במשותף (איור 5). בסך הכל תוצאות אלה מצביעות על כך שניתן לפרוס את השיטות המתוארות כדי למדוד הפנמה של קולטן המושרה על ידי כימוקין בנויטרופילים ולבסס את זהותו של ליגנד המתווך תופעות אלה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> איור 1: נדידת נויטרופילים לפצעי סנפיר גחון. (A) (משמאל) קריקטורה של 3 זחלים dpf המציג את המיקום של רקמת המטופויאטית caudal (CHT), מחזור ונוס (VC, כחול), סנפיר הגחון (VF) ואתר הפצע. (מימין) קריקטורה המתארת את אזור הפצע (W) עם נויטרופילים מקבל מגויס מן CHT ו קיבוץ על הפצע. מקלעת הוורידים (CVP) של רקמת ה- CHT מצוירת בכחול. (B) תמונת שדה בהירה (משמאל) והקרנה קונפוקלית (מימין) המציגה את פצע הסנפיר הגחוני ואת התפלגות הנויטרופילים בזחלי Tg(mpx:GFP) בשעה 2 שעות לאחר הפציעה. קווים מקווקווים מציגים קווי מתאר של VF ו- CHT. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. תמונה מצוירת ופלואורסצנטית שונה משופט 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> איור 2: הדמיה חיה של סחר בקולטן כימוקין בנויטרופילים. (A) מבנים המשמשים לביטוי מהונדס ספציפי לנויטרופילים של Cxcr1-FT (טיימר פלואורסצנטי) ו- Cxcr2-FT. תחזיות קונפוקליות של נויטרופילים בראש זחל מהונדס 3 dpf (Tg(lyz:Cxcr1-FT), למעלה; Tg(lyz:Cxcr2-FT), למטה) המציג ערוצי tRFP (מגנטה) ו- sfGFP (ירוק). סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (ב) ערכה אנטומית של זחל 3 dpf כמו באיור 1A. מתחת לזחל יש תוכניות המתארות את אזור הפצע (W) עם נויטרופילים שמתגייסים מה- CHT (למעלה) או מבצעים כימוטקסיס עם הכניסה לסנפיר הגחון (למטה). ריבוע מקווקו מציין אזור בתמונה בתצלומי בזק מימין. (C) נויטרופילים בזחלי Tg(lyz:Cxcr1-FT) (מוצג sfGFP) בעת גיוס מ- CHT (לוחות עליונים) או כימוטקסיס לכיוון הפצע (לוחות תחתון). החצים מציגים את אותם תאים לאורך זמן. נקודות זמן בתמונה הימנית הן דקות שחלפו לאחר התמונה משמאל. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (D) ייצוג סכמטי של גישה ניסיונית להדמיה חיה של סחר בקולטן כימוקין. לוחות A-C ששונו מ- ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> איור 3: דוגמאות לכימות של דינמיקת קולטן. נויטרופילים בודדים (כחולים) או מקובצים באשכולות (ירוק) בפצעים או נויטרופילים לא מגויסים ב- CHT (אדום, כתום) חולקו ונותחו בשיטות שונות כדי להשוות תוצאות. אותם תאים לדוגמה המוצגים נותחו בשתי שיטות כדי לקשר את מה שנראה בתמונה עם טווח הערכים שחולצו. (א) פני השטח של התאים לדוגמה שנבחרו היו מפולחים בהתבסס על הגדרת מתאר בערוץ sfGFP. (B) ניגודיות חושבה מהתאים לדוגמה המוצגים ב- A. (C) הממברנה של התאים לדוגמה שנבחרו היו מפולחים בהתבסס על הגדרת מתאר בערוץ CFP. לאחר מכן בוצע ניתוח יחסי של sfGFP/CFP. (ד) היחס בין sfGFP/CFP חושב על התאים לדוגמה המוצגים ב- C. קווי שגיאה מייצגים S.E.M. מתאים בודדים, במקרים של n&gt;1, הערכים כאן לא שימשו לניתוח סטטיסטי אלא רק כדי להדגים מדידות שהושגו בשיטות הכימות השונות. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. איור שונה משופט 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> איור 4: דינמיקה דיפרנציאלית של Cxcr1 ו- Cxcr2 בתגובה לפציעה. (A) הקרנה קונפוקלית של נויטרופילים ב Tg(lyz:Cxcr1-FT) או Tg(lyz:Cxcr2-FT) זחלים בפצע ב 80 דקות לאחר פציעה (ערוץ sfGFP מוצג). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר.  (B) נויטרופיל Cxcr1-FT מוגדל (משמאל) ו- Cxcr2-FT (מימין) בפצע. קולטן ירוק מוצג באפור. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. (C) ניגודיות מנורמלת (ניגודיות לנויטרופיל בודד מנורמלת לניגודיות הממוצעת של תאים שאינם מגויסים ב- CHT). cxcl8a מתייחס הזרקה של חסימת חיבור יחד עם מורפולינו חוסם תרגום עבור cxcl8a. cxcl8b מתייחס הזרקה עם מורפולינו חוסם חיבור עבור cxcl8b. עבור Tg(lyz:Cxcr1-FT): n = 24 תאים (CHT), n = 47 תאים (פצע) מ 8 זחלים. עבור Tg(lyz:Cxcr1-FT) עם מורפולינוס: n = 28 תאים (Cxcl8a-MO) מ 5 זחלים, n = 16 תאים (Cxcl8b-MO) מ 5 זחלים. עבור Tg(lyz:Cxcr2-FT): n = 10 תאים (CHT) ו n = 20 תאים (פצע) מ 3 זחלים. הנתונים אוגדו מזחלים עצמאיים שנרכשו ב-1-5 מפגשי הדמיה. מבחן קרוסקל-וואליס עם מבחן ההשוואות המרובה של דאן עבור Tg(lyz:Cxcr1-FT), מבחן מאן-ויטני דו-זנבי לא מזווג עבור Tg (lyz:Cxcr2-FT). (D) הקרנה קונפוקלית של נויטרופילים ב- Tg (lyz:Cxcr1-FT) זחלים מהונדסים שטופלו ב - cxcl8a morpholino (MO) (משמאל) ו - cxcl8b MO (מימין) מגיבים לפצעי סנפיר (ערוץ sfGFP המוצג בירוק). תמונה שצולמה בנקודות זמן של הצטברות נויטרופילים שווה ערך (85 דקות לאחר פציעה בתמונה השמאלית ו -45 דקות לאחר פציעה בתמונה הימנית). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. איור שונה משופט 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> איור 5: בדיקת תגובה של צ'מוקין בעוברים מוקדמים. פרוסות קונפוקל סריקת לייזר של עוברים gastrulating מראה ביטוי והפצה של Cxcr1-FT. 100 pg של Cxcr1-FT mRNA הוזרק לתוך אחד ביצי תא שלב עם או בלי 150 pg Cxcl8a mRNA. קולטנים ירוקים ואדומים מוצגים בערוצים נפרדים. סמן CFP קרום בקרה (mCFP) מוצג בערוץ ציאן. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. איור שונה משופט 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
סרט משלים 1: נויטרופילים מהונדסים בראש זחל Tg(lyz:Cxcr1-FT) (משמאל) ו- Tg(lyz:Cxcr2-FT) (מימין) ב-3 dpf. sfGFP(ירוק), tagRFP (מגנטה). מרווח המסגרות הוא 30 שניות וקצב הפריימים הוא 5 fps. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. מקורו של הסרטון הוא בפסוק 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.</a>
סרט משלים 2: נויטרופילים ב- Tg(lyz:Cxcr1-FT) (משמאל) ו- Tg(lyz:Cxcr2-FT) (מימין) זחלים מהונדסים המגיבים לפצעי סנפיר. הסרט מתחיל תוך 10 דקות לאחר הפציעה ונמשך 60 דקות. sfGFP (ירוק), tagRFP (מגנטה). מרווח המסגרות הוא 30 שניות וקצב הפריימים הוא 10 fps. CHT = רקמת המטופויאטית caudal. VF = סנפיר גחון. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. מקורו של הסרטון הוא בפסוק 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.</a>
סרט משלים 3. דוגמאות נוספות של נויטרופילים מ זחלים מהונדסים Tg(lyz:Cxcr1- FT) מהונדסים (זחלים שונים מאלה המוצגים בסרטון 2), שנרכשו ברזולוציה גבוהה יותר, המציגים הפנמת קולטן (ערוץ sfGFP המוצג בירוק) עם התגייסות ב- CHT או עם הכניסה וכימוטקסיס בסנפיר הגחוני. מרווח המסגרות הוא 30 שניות וקצב הפריימים הוא 2 fps. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. מקורו של הסרטון הוא בפסוק 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.</a>
קובץ משלים 1: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 2: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 3: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 4: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

כאן אנו מתארים פרוטוקולים לביצוע הדמיה חיה וניתוח כמותי של דינמיקת קולטן כימותרפיה בנויטרופילים של דגי זברה

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

נויטרופילים הם תאים דלקתיים חשובים החודרים לפצעים בתגובה לליגנדים כימיים המיוצרים מקומית. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של דינמיקת קולטנים בתגובה לליגנדים כאלה in vivo. ניתן להרחיב את השימוש בקולטני כימוקין למסגרות פיזיולוגיות אחרות, כגון מודלים של זיהום וגידול ולתאים חיסוניים אחרים.השיטה מאפשרת לעקוב אחר מתי והיכן ברקמה לויקוציטים חשים מולקולות מושכות כימיות. זה יכול לאפשר הבנה טובה יותר של האופן שבו תגובות חיסוניות מתפתחות ונפתרות. ביצוע פציעת סנפיר גחון בזחלי דג זברה דורש מניפולציה עדינה של זחלים, ולכן נדרש תרגול מסוים על זחלים שאינם מיועדים למטרות ניסוי.ביום 2.5 עד 3.5 לאחר ההפריה, הניחו את זחלי דג הזברה המורדמים תחת טווח חיתוך פלואורסצנטי ובחרו זחלים עם ביטוי קולטן טרנסגני. העבירו את הזחלים שנבחרו לצלחת פטרי בגודל 120 מילימטר המכילה טריקאין בינוני E3 והשתמשו באזמל סטרילי כדי לחתוך את סנפיר הגחון של כל זחל עמוק מספיק כדי לגרום לגיוס נויטרופילים משמעותי מבלי לחתוך את כלי הרקמה ההמטופויאטית הזנבית. מוסיפים 500 מיקרוליטר של 2X טריקאין לכלי תחתית זכוכית, ואז מוסיפים 500 מיקרוליטר תמיסת אגרוז ומערבבים על ידי ערבוב עדין עם קצה הפיפטה.השתמש בפיפטה כדי להעביר את זחלי דג הזברה המורדמים הפצועים לתוך הצלחת ולכוון את העובר לרוחב תוך דחיפה עדינה כלפי מטה כך שהחלק הזנבי של הדג יהיה קרוב ככל האפשר לתחתית הזכוכית. כאשר העובר נמצא במקומו, הניחו לאגרוז להתקרר. לאחר חמש עד 10 דקות, גע בעדינות בג'ל עם מברשת קטנה כדי לאשר את ההתמצקות והוסף לצלחת שני מיליליטר מדיום E3 בתוספת 0.2 מיליגרם למיליליטר טריקאין.דמיין את אתר הפצע באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב. בהקדם האפשרי, לאחר שהאגרוז מתייצב, העבירו את העובר לפלטפורמת הדיסק המסתובב להדמיה קונפוקלית והשתמשו בג'ויסטיק הבמה ובמיקרוסקופ כדי לאתר את הדג. באמצעות המטרה של 30 עד 40X, התמקד באזור הפצע ובחר את השדה לתמונה סביב הפצע.בחר את הלייזר והתאם את זמן החשיפה, ולאחר מכן הגדר Timelapse כל 30 שניות למשך הזמן הרצוי וקבל תמונת Brightfield כדי לתעד את שדה הראייה. כדי לכמת את הפנמת קולטני הנויטרופילים באתר הפצע, פתח את מערכי הנתונים של התמונות בפיג'י והשתמש במחוון הזמן כדי לבחור מסגרת זמן מייצגת של עניין עבור כל מערך נתונים. ב-MATLAB, צור סקריפט חדש וכלול פונקציות לקריאת תמונות, פתיחה ובחירה ידנית של נקודות העניין.הפעל את הסקריפט כדי לפתוח את מסגרת העניין ולחץ על הנויטרופילים לניתוח. רשום הערכה של הצנטרואידים שלהם, הן בפצע סנפיר הגחון והן ברקמה ההמטופויאטית הזנבית. פלח את הנויטרופילים בכל מסגרת באמצעות טכניקת קווי המתאר הפעילים וצור את התסריט להוספת חישוב מטריצת ההתרחשות המשותפת ברמה האפורה עבור כל נויטרופיל, כולל חישוב הניגודיות של הנויטרופילים על סמך מטריצת ההתרחשות המשותפת ברמה האפורה.הוסף פקודות לשמירת הערכים בנפרד עבור נויטרופילים בודדים בסנפיר הגחון, כולל חישוב ערך הניגודיות הממוצע של נויטרופילים מכל הנויטרופילים של הרקמה ההמטופויאטית הזנבית. כלול את הנורמליזציה של ערך הניגודיות של נויטרופילים בודדים באתר הפצע לניגודיות הממוצעת המחושבת של הנויטרופילים של הרקמה ההמטופויאטית הזנבית כדי להשיג ניגודיות מנורמלת המשקפת עד כמה המראה של קולטן בתוך תאים מגיבים בודדים ביחס לתאי הביקורת שאינם מגיבים. לאחר מכן לחץ על הפעל כדי להפעיל את קובץ ה- Script.פציעה בסנפיר הגחון מלווה בגיוס נויטרופילים מהיר מהרקמה ההמטופויאטית הזנבית לתוך סנפיר הגחון והתקבצות בשולי הפצע תוך 30 עד 60 דקות מרגע השראת הפציעה. בניתוח זה, קולטני הכימוקין CXCR1 ו-CXCR2 המתבטאים על ידי נויטרופילים של דג הזברה צולמו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב. דפוס התפלגות הקולטנים כומת באמצעות מדד הניגודיות, המדווח על הבדלים בעוצמה בין פיקסלים שכנים.שיטה חלופית היא לכמת את היחס בין רמות הקולטן לרמות של סמן ממברנה מבוקר. באמצעות מדד הניגודיות לזיהוי הפנמת קולטנים באשכולות נויטרופילים בפצע, ניתן לכמת הבדלים גלויים בין סחר CXCR1 ו-CXCR2 בנויטרופילים באתר הפצע. לדוגמה, בניתוח זה, הפנמת CXCR1 מתויגת פלואורסצנטית בתאים הממוקמים באתר הפצע גדלה עם הזמן, בעוד ש-CXCR2 מתויג פלואורסצנטי נשאר על ממברנות הנויטרופילים בפצע.דיכוי של ליגנדים CXCR1 ו-CXCR2 באמצעות טיפול במורפולינו מביא להפנמת CXCR1 מתויגת פלואורסצנטית דיפרנציאלית באתר הפצע. בנוסף, בעוברים מוקדמים, CXCR1 המתויג פלואורסצנטי מופנם באופן ניכר בעוברים שבהם ליגנד הקולטן מתבטא במשותף. בעת ניסיון פרוטוקול זה, זכור כי יש לבצע את ההדמיה במהירות האפשרית לאחר הפציעה כדי ללכוד את דינמיקת הקולטן במהלך גיוס נויטרופילים לפצעים.בעקבות הדמיה של קולטני כימוקין בזחלים רגילים, חוקרים יכולים לבצע הדמיה השוואתית בזחלים מוטנטיים עם דלקת לא מווסתת.

live-imaging-chemokine-receptors-zebrafish-neutrophils-during-wound

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

ההתפתחות המהירה, גודל קטן השקיפות של דג הזברה הם יתרונות עצומים למחקר שליטה החיסון המולדת של...

הדמיה לא פולשנית של פטרת מופצת הזחלים דג הזברה

כאן אנו מתארים assay הרומן גבוהה תוכן דלקת הנגרמת כימית מכוון לזיהוי modulatory החיסון bioactives. יש לנו שילוב בהצלחה מיקרוסקופ עם אוטומטיות מותאמות אישית סקריפטים תוכנה שפותחו המאפשרים כימות אוטומטי של התגובה הדלקתית כמו גם עוד עיבוד נתונים, ניתוח, כרייה, ואחסון.

גילוי תרופות בהנחיית: Assay אוטומטי גבוהים תוכן דלקת דג הזברה

סרטון זה מדגים מעקב אחר גיוס לויקוציטים באמצעות זחלי דגי זברה טרנסגניים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק הניתן להמרה פוטו-מיטבית. הזרקה מראש של חיידקים בעלי תווית צבע פלואורסצנטי אדום לתוך שלפוחית העין וגרימת המרת אור מאפשרת תצפית על נדידת לויקוציטים, פגוציטוזה ופיזורם בכל הגוף, ומספקת תובנות חשובות לגבי דינמיקת התגובה החיסונית.

מעקב לויקוציטים מבוסס פוטו-המרה בדגי זברה טרנסגניים נגועים בחיידקים

הסרטון מדגים טכניקת פציעה ולכידה של דגי זברה לצפייה בזיהום פתוגן פטרייתי המסומן באופן פלואורסצנטי בזחלי דגי זברה. זיהום ראשוני מושך מקרופאגים, וככל שהזיהום נמשך, גיוס נויטרופילים מתקדם באתר ההזרקה.

טכניקת zWEDGI להמחשת זחלי זברה נגועים בפתוגן פטרייתי

לומד את האירועים המוקדמים ביותר של התפתחות תא preneoplastic ואינטראקציה תא חיסון מולדת הוא מרכזי להבנה ולטיפול בסרטן. כאן אנו מתארים שיטה לגרום לתנאי תמורות תאי אפיתל והדמית החיה הבאה של אינטראקציה תא חיסון מולדת עם G12V HRAS לבטא בתאי עור בזחלי דג הזברה.

הדמיה חיה של אינטראקציות תא של מערכת חיסון המולדת וPreneoplastic שימוש מערכת ביטוי / כטב&quot;מ העין מתנהלת Gal4 בעור הזחל דג הזברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירה והדמיה של זיהום חיידקי מקומי בשלפוחית האוטית של דג הזברה.

הדמיה לא פולשנית של התגובה החיסונית המולדת בדגם דג הזברה הזחל של<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; זיהום

מודלים מערכתיים ומקומיים של זיהום דג זברה לנגיף שפעת אנושי A. באמצעות מודל זיהום מערכתי, ניתן להשתמש בדג הזברה לבדיקת תרופות אנטי-ויראליות. באמצעות מודל זיהום מקומי, ניתן להשתמש בדג הזברה כדי לאפיין את תגובות תאי החיסון של המארח.

באמצעות מודלי דג זברה של נגיף שפעת A האדם למסך תרופות אנטי ולאפיין מארח תגובות תא חיסון

Microinjection של דג זברה עוברי וזחלים היא טכניקה חיונית ומאתגרת המשמשים דגמים רבים של דג זברה. כאן, אנו מציגים מגוון רחב של כלים microscale כדי לסייע ייצוב והכיוון של דג זברה הן microinjection והן הדמיה.

Microstructured מכשירי Microinjection אופטימיזציה והדימות של הזחלים דג זברה

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הדמיה לחיות הפצע ותיקון ההיענות דלקתיות המשויך ברזולוציה גבוהה-עתיים ויוו. שיטה זו משתמשת השלב הגולמי של פיתוח דרוזופילה כדי לאפשר לטווח ארוך הדמיה ומעקב של אוכלוסיות תאים מסוים לאורך זמן והוא תואם עם איון יעיל מציאה RNAi בתיווך גנים.

לטווח ארוך In Vivo מעקב של תאים דלקתיים הדינמיקה בתוך דרוזופילה הגלמים

כדי לבדוק את ההשפעה של כימוקין על גיוס מקרופאג ב vivo, את כל הר היברידיזציה באתרו שימש כדי לזהות את הביטוי החוץ רחמי של כימוקין, וכתמים חיסוני שימש תוויות מקרופאגים. הדמיה חיה שימש התבוננות בזמן אמת של הגירה מקרופאג.

כימוקין חוץ רחמי ביטוי מודל לבדיקת גיוס מקרופאג ב Vivo

דגי זברה המכוונים לאלקטרופילים ומחמצנים תגובתיים (Z-REX) היא שיטה מבוססת ביולוגיה כימית לחקר איתות תגובתי של מולקולות קטנות. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על דגים חיים בשלבי התפתחות שונים. כאן, אנו משלבים בדיקות סטנדרטיות בדגי זברה עם Z-REX לניתוח מסלולי איתות.

ניטור תגובות איתות ממוקדות בדגי זברה זחלים - Z-REX חושף מנגנונים מדויקים של תרופות אלקטרופיליות ומטבוליטים

חקור דינמיקת קולטני כימוקין בנויטרופילים של דגי זברה בתגובה לפצעים. השיטה משתמשת במיקרוסקופיה קונפוקלית לניתוח פנימול קולטנים CXCR1 ו-CXCR2 בזמן אמת.

הדמיה חיה של קולטני כימוקין בנויטרופילים של דגי זברה במהלך תגובות לפצעים

גלה סרטונים נוספים