אופטימיזציה של צמיחת קריסטל עבור קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית נויטרון

ישנן גישות התגבשות שונות להשגת גבישים גדולים ואיכותיים הן עבור רנטגן והן עבור קריסטלוגרפיה נויטרונית. אחת הגישות הללו היא שימוש בשיטת דיאליזה. בטכניקה זו, פתרון החלבון מופרד מתמיסת משקעים על ידי קרום חדיר למחצה.

מולקולות המשקעים מפוזרות על פני הממברנה לתוך תא החלבון. כאשר תושג רוויית-העל הנכונה לגרעין ספונטני, הגרעינים הראשונים יופיעו. כאן, אנו נדגים פרוטוקול שיכול לשמש את OptiCrys מכשיר אוטומטי לחלוטין שפותח במעבדה שלנו המשתמש בהתגבשות דיאליזה מבוקרת טמפרטורה, וכפתורי הדיאליזה המיקרו שלנו לגידול גבישים גדולים ואיכותיים לקריסטלוגרפיה מקרומולקולרית טבעית המבוססת על ידע בתרשים שלב התגבשות.

עבור כפתור מיקרו דיאליזה עם פיפט נפח microliter מסוימים 35 microliters של פתרון lysozyme לתוך תא הדיאליזה. נפח נוסף זה יוצר צורת כיפה קלה על גבי תא הדיאליזה ומונע היווצרות בועת אוויר. קח מוליך ומניחים את האלסטי או הטבעת בקצה של זה.

מניחים את הממברנה על גבי התא ולתקן אותו על ידי העברת אלסטי או טבעת מן המוליך לגרוב של כפתור הדיאליזה. מעבירים את הכפתור לבאר המכילה את פתרון ההתגבשות. מכסים את הבאר עם תלוש כיסוי זכוכית או חתיכת קלטת.

שמור את הדגימה ב 293 קלווין באינקובטור ווסת תרמי ללא רטט. הידיעה כי התגבשות הדיאליזה מציעה יתרונות מנקודת המבט של צמיחת גביש ספסל התגבשות מה שנקרא OptiCrys תוכנן ופותח במעבדה שלנו להציע שליטה משולבת אוטומטית לחלוטין של טמפרטורה הרכב כימי של ניסוי התגבשות biomolecular. אופטימיזציה של צמיחת הגביש על ידי OptiCrys מבוסס על דיאגרמות שלב ריכוז משקע הטמפרטורה.

התגרענות מתרחשת באזור התגרענות בקרבת האזור metastable וצמיחת גביש ואז מתרחשים באזור metastable לאחר דיאגרמת שלב, עד ריכוז החלבון מגיע עקומת המסיסות המייצג את שיווי המשקל התרמודינמי בין פתרון גבישים. על ידי הפחתת הטמפרטורה במקרה של החלבון עם מסיסות ישירה או על ידי הגדלת ריכוז המשקעים במקרה של מלח החוצה להגיע, פתרון התגבשות נשאר באזור metastable ולא מתרחשת גרעין. גבישים גדלים עד שיווי המשקל של תמיסת הגביש השנייה להשיג ואחרי זה, אין עלייה נוספת בגודל של גבישים נצפתה.

הפחתת הטמפרטורה או הגדלת ריכוז המשקעים חוזרת על עצמה מספר פעמים עד שהקריסטלים מגיעים לגודל הרצוי. מוסיפים את תמיסת החלבון לתא הדיאליזה של הטמפרטורה מבוקרת זורם להגדיר, לכסות את תא מעל עם קרום הדיאליזה ולתקן את הממברנה עם אלסטי או טבעת. הופכים את תא ההשתלטות ומניחים אותו על תא הדיאליזה.

לחץ עליו בעדינות ובאיטיות כדי להסיר את כל האוויר לכוד בין שתי חתיכות, לתקן את המאגר במיקום שלו על ידי בעדינות דופק אותו על גבי התא מעל. מוסיפים את תמיסת ההתגבשות לתא המאגר ומכסים אותה בכובע האטום. העבר הרכבה זו והכניס אותו לתוך התמיכה בשד של ספסל התגבשות OptiCrys קריסטל צמיחה היא תוכנת פיקוח של OptiCrys ספסל התגבשות.

הוא כולל ארבעה ממשקים גרפיים שונים או תצוגות שונות. תצוגת הבית מכילה לחצנים לניווט לתצוגות האחרות. מטרת ממשק ההתקנה היא להגדיר תרחיש ניסוי שניתן להפעיל באופן אוטומטי בתצוגת הבדיקה.

התצוגה האחרונה היא תצוגת התחזוקה. כדי להפעיל מחדש ניסוי, תצוגת התחזוקה חייבת להיות פתוחה במקום שבו נמצאים כל הפרמטרים החיוניים עבור החלקים הפועלים מניסויי ההתגבשות. הגדל את הזוהר ממקטע האור, האור יכול לגדול מאפס, ללא אור ל-100 בהירות מרבית.

לשליטה וניטור הטמפרטורה, נעשה שימוש בסעיף וסת הטמפרטורה. לחץ על הכפתור כדי להפעיל אותו. קבעו את הטמפרטורה במקטע נקודת ההגדרה והקש Enter.

מתחת ללחצן זה, ישנם שני גרפים. האדום מציג את הסופי, טמפרטורת הסדר והגרף הצהוב מציגים את הטמפרטורה הנוכחית. ערבוב פתרונות מלאי, הזרקה של פתרון התגבשות לתא המאגר נשלטת על ידי סעיף פאלם.

הוסף את הריכוז של פתרון המניה בשלב הראשון. לאחר מכן למצוא את הריכוז הסופי של כל פתרון לוקוס חדש ולהוסיף אותם למקטע הריכוז הסופי. לאחר לחיצה על כפתור החישוב, לגלות נפח של פתרון מלאי יחושב יוסיף בלוח נפח מול כל לוח ריכוז.

לחץ על כפתור ההכנה להפעלה והמתן עד שהפתרון הראשי החדש יהיה מוכן. להחלפת פתרון ההתגבשות, לחצו על כפתור הזנת הפתרון. כדי לעצור את התהליך, לחץ על לחצן הפסק הפצה.

בצד ימין של סעיף המיקרוסקופ, ישנם מספר לוחות לתיעוד מידע חשוב מכל ניסוי צמיחת גביש. הוסף שם חלבונים מתאים, משקל מולקולרי ומצב התגבשות בסעיף זה. הגדר שם לניסויים שלך פשוט על-ידי הקלדתו בשם התיקיה.

במקטע תמונות nb, בחר את מספר התמונות שיש לצלם במהלך הניסוי. הוסיפו את מספר התמונות ומהחלונית מימין, בחרו בסולם שעון העצר. לחץ על לחצן התיקיה כדי לפתוח את התיקיה.

בתיקיה זו, קיים קובץ טקסט המכיל את כל המידע שהגדרת קודם לכן עבור הניסוי שלך. תמונות המוכנות לכל טיפול נוסף נשמרות גם בתיקייה זו. זום את המיקרוסקופ יכול גם להיות מגוון באופן אוטומטי.

משנה את גודל התצוגה באמצעות לחצן הפלוס והמינוס בחלק העליון של מקטע המיקרוסקופ כדי להגדיל או להקטין את ההגדלה בהתאמה. ישנן שלוש דרכים שונות למדוד את גודל הגביש. למדידת האורך או הרוחב השתמשו בווקטור הרוחב.

בהתאם לצורת הגביש, ניתן לבחור את הכלים הספציפיים מהחלק השמאלי של מקטע המיקרוסקופ. כגון מלבני או מצולע. הערכים יופיעו במקטע המידה.

בסט הניסויים הראשון, כפתורי מיקרו-דיאליזה היו שקועים בפתרונות התגבשות עם ריכוזי מלח שונים. בניסוי רשת התגבשות פשוט זה, המשתנה היחיד הוא ריכוז משקעים. בעוד הטמפרטורה נשמרת קבועה.

שינויים קלים בריכוז המלח מאפשרים לחקור את דיאגרמת שלב ההתגבשות על ידי הגדלת ריכוז המלח מ-0.7 ל-1.2 עליות רוויה טוחנות והפתרון באזור הגרעין מתרחק מהאזור המגושה. כתוצאה מכך, וריאציה בגודל ובמספר הגבישים נצפית כאשר מספר הגבישים גדל וגודלם הולך ופוחת. בניסוי הראשון עם OptiCrys במצב ניסיוני נתון, לאחר שיווי המשקל בתא הדיאליזה להגיע, פתרון התגבשות הוא באזור התגרענות בקרבת האזור metastable של תרשים שלב התגבשות.

כתוצאה מכך, רק גרעינים בודדים נוצרים בשלב הראשון של הניסוי. על מנת לשמור על צמיחת גבישים באזור metastable ולשלוט בתהליך צמיחת הגביש, הטמפרטורה שונתה במרווחי זמן שונים. בכל פעם שיווי המשקל של תמיסת הגביש הושלם, הטמפרטורה הייתה מגוונת.

לכן הטמפרטורה ירדה ל 291 קלווין, 288 קלווין ולבסוף 275 קלווין כדי לשמור על הצמיחה של גביש נבחר באזור metastable. התוצאה של ניסוי זה היא גביש אחד גדול, עם הנפח הנדרש עבור קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית טבעית. שני הניסויים הבאים מדגימים את היפוך ניסויי הדיאליזה מבוקרי הטמפרטורה לגרעין, צמיחת גביש, פירוק וצמיחה מחדש.

בניסוי השני עם OptiCrys ההרכב הכימי של פתרון ההתגבשות נשמר קבוע באמצעות הניסוי והטמפרטורה השתנתה. הטמפרטורה הראשונית נקבעה על 291 קלווין. בשל רוויית-על גבוהה, מספר רב של גבישים קטנים הופיעו בתא ההתגבשות.

בהתאם למושג מסיסות חלבון ישירה, על ידי הגדלה הדרגתית של הטמפרטורה ל 313 קלווין כל הגבישים היו מומסים. לבסוף, על ידי הורדת הטמפרטורה ל 295 קלווין, הגרעין השני יזם בקרבת האזור metastable ואפשר לשלוט בתהליך הגרעין וכתוצאה מכך להרכיב מספר נמוך יותר של גרעינים. צמיחת גבישים נוספת אפשרה ליצור אוכלוסייה אחידה של גבישים גדולים יותר.

בניסוי זה, שינוי ההרכב הכימי של פתרון ההתגבשות בטמפרטורה מתמדת מוביל להשגת אוכלוסייה אחידה של גבישים גדולים יותר. מצב ההתגבשות היה דומה לניסוי הקודם. המסת הגבישים הושגה על ידי הורדת ריכוז NaCl בהדרגה מ 0.9 טוחנת לאפס.

הפחתת ריכוז המלח שומרת על הפתרון באזור התת-רווי של דיאגרמת הפאזה שמובילה לפירוק הגבישים. ואז פתרון התגבשות חדש עם חוזק יוני נמוך יותר מאשר בעבר הוזרק לתוך תא המאגר. בריכוז משקעים זה מופיע המספר הנמוך יותר של גבישים והקריסטלים מגיעים לנפח גדול יותר מבעבר.

כאן סיפקנו פרוטוקול מפורט המתאר הכנת מדגם והתאמת תוכנת הבקרה לגידול גבישים גדולים ואיכותיים עבור קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית טבעית באמצעות מכשיר אוטומטי לחלוטין שפותח במעבדה שלנו. הליך שלב אחר שלב זה תוכנן ונהנה מהידע של דיאגרמת שלב ההתגבשות על מנת להפריד בין התגרענות לצמיחת הגבישים. יתר על כן, פרוטוקול לגידול גבישים עם דפוסי microcytosis מוצג גם באמצעות לחצני מקרוציטוזיס כחלופה כאשר OptiCrys אינו זמין.

בנוסף לאסטרטגיות שציינתי עבור OptiCrys שינוי ההרכב הכימי של פתרון התגבשות וטמפרטורה וצילום תמונות צריך להיעשות באופן ידני. שימוש ברטט התרמי המווסת עבור החממה כדי לשמור על הטמפרטורה קבועה נדרש, וזה צעד קריטי במתודולוגיה שהוכח.