הדמיה של מפגשים רפליזומיים עם נגע חוסם מתויג אנטיגן

טכניקה זו מקלה על הדמיה של מפגשי DNA מתויגים אנטיגן replisome וניתן להרחיב אותה לאינטראקציות של כל חלבון עם מבנה DNA או נגע מקובל על immunodetection. שיטה זו יכולה לשמש להערכת תדרי אינטראקציה בתוך תאים בודדים, ולא על פני אוכלוסייה, ומאפשרת הדמיה של אינטראקציות תלויות מחזור התא באתרן מבלי לפגוע בתאים. מי שידגים את ההליך יהיה אישני מג'ומדר, פוסט-דוקטורנט ממעבדת זיידמן.

ביום שלפני הניסוי, זרעו 1.5 כפול 10 לתאים החמישיים בשני מיליליטר של בינוני על צלחת תרבית תחתית זכוכית 35 מ"מ שטופלו מראש בתמיסת דבק תאים. למחרת, החליפו את הסופרנאטנט בכל צלחת ב-37 מעלות צלזיוס ב-5 תרביות תאים בנפח 50% עד 70% והחזירו את הצלחות לאינקובטור תרביות התא למשך 30 דקות כדי לאפשר ל-Dig TMP להתאזן. בזמן שהתאים דוגרים, מחממים מראש קופסת UV ל -37 מעלות צלזיוס.

בתום שיווי המשקל, מעבירים את הצלחות לקופסה המחוממת מראש כדי לחשוף את התאים למנת אור UVA של שלוש דקות של שלושה ג'אול לסמ"ר ומחליפים את הסופרנאטנטים בשני מיליליטר של מדיום תרבית טרי שחומם מראש לפני החזרת הצלחות לאינקובטור תרביות התאים למשך שעה. בסוף הדגירה, שטפו בעדינות את התרביות עם PBS וקיבעו את התאים עם מיליליטר אחד של 0.1% פורמלדהיד ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, שטפו את התאים פעם אחת עם PBS לפני שטיפלו בתאים פעמיים עם 80 מיקרוליטר של חיץ מיצוי שלד ציטו-שלד בתוספת RNase במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לכל טיפול כדי להסיר את הציטופלסמה.

לאחר הדגירה השנייה, שטפו את התאים עם שני מיליליטר PBS שלוש פעמים לפני קיבוע התאים עם מיליליטר אחד של 4% פורמלדהיד ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הקיבוע השני, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS כפי שהודגם, ולאחר מכן טיפול עם מיליליטר אחד של מתנול קר 100% במשך 20 דקות במינוס 20 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים בשני מיליליטר של PBS, ולאחר מכן דגירה של 10 דקות ב 80 מיקרוליטר של חמישה מילימולרים טריטון X-100 בארבע מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, לטפל בתאים עם 100 מיקרוליטר של חמישה מילימולר EDTA ב PBS, בתוספת מיקרוליטר אחד של 100 מיליגרם למיליליטר של RNase A במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, שטפו את התאים שלוש פעמים ב-PBS לפני אחסונם באלבומין בסרום בקר 5% ובסרום חמור 10% ב-PBS בתא לח למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לביצוע בדיקת קשירת קרבה, מוסיפים 40 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים הראשונית המעניינת למרכז כל צלחת ודגרים על הצלחות בתא הלח למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

בתום הדגירה, שטפו את התאים שלוש פעמים עם שני מיליליטר PBST לפני הוספת 40 מיקרוליטר של תמיסת בדיקת PLA טרייה שהוכנה לכל צלחת לדגירת שעה באינקובטור תרביות התא. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים עם שלוש שטיפות של 10 דקות בשני מיליליטר של חיץ A על פלטפורמת הטיה בטמפרטורת החדר. לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו 40 מיקרוליטר של תערובת קשירה טרייה לכל צלחת לדגירת 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שלוש שטיפות של שתי דקות בחיץ A על משטח ההטיה.

לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו 40 מיקרוליטר של תמיסת הגברה טרייה לכל צלחת לדגירה של 100 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא לח. בתום הדגירה, שטפו את התאים שש פעמים עם חיץ B טרי במשך 10 דקות לכל שטיפה על משטח ההטיה. לאחר שטיפת החיץ B האחרונה, שטפו את התאים פעם אחת עם חיץ B 0.01x למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר לפני התיוג עם הנוגדנים המשניים המתאימים בתא הלח למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, שטפו את הדגימות בשלוש שטיפות של 10 דקות על משטח הטיה ב-PBST בטמפרטורת החדר לפני הרכבתן באמצעי הרכבה בתוספת DAPI. בתוך ארבעה ימים מרגע ההרכבה, צלם לפחות 100 תצפיות לכל דגימה או התנה תאים במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי או קונפוקלי, תוך שימוש באותן הגדרות חשיפה הן עבור דגימות ניסוי והן עבור דגימות ביקורת. התג Dig ניתן לדמיין על ידי immunofluorescence כדי לחשוף את נוכחותם של crosslinks interstrand ברחבי הגרעין.

כדי להמחיש את האינטראקציה של replisomes עם crosslinks interstrand, PLA יכול להיות מיושם כדי לדמיין את תדירות האסוציאציה של MCM5 ואת התג Dig, שעה לאחר הצגת interstrand crosslink. כאשר לחץ השכפול מפעיל ATR קינאז, ה-PLA בין pMCM שני סרין 108 ותג Dig הוא גם חיובי. תוצאות PLA מגרעינים בודדים יכולות להיות מוצגות בשחזור תלת ממדי המאפשר הדמיה של מפגשי קישור בין-גדילי ברחבי הגרעין.

ניתוח Replication Fork מצביע על כך שמפגשים בין גדילי crosslink מדגימים תופעה בלתי צפויה של שכפול מחדש, מכיוון שהחלבונים של קומפלקס GINS אינם מצליחים להציג אות PLA עם הקרוסלינקים הבין-גדיליים. לעומת זאת, הבדיקה עם CD 45 היא חיובית, מה שמצביע על כך שהחלבון הנועל האחר נשמר. כאשר תאים מודגרים עם מעכב ATR, ההפעלה מחדש מדוכאת לחלוטין ואת GINS Dig PLA חיובי מאוד.

טיפול CSK+R חיוני להפחתת אות הרקע. הקפידו לצפות את הצלחות בדבק תאים ולבצע קידומת עם 0.1% FA, אחרת התאים יתקלפו מהצלחת.