Name: הדמיה של מפגשים רפליזומיים עם נגע חוסם מתויג אנטיגן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: חקור את האינטראקציות בין רפליזומים לנגעי DNA באמצעות שיטת proximity ligation assay בתאי אדם. שיטה זו מאפשרת הדמיה של מפגשים תלויי מחזור התא במצב in situ ללא פגיעה בתאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך, בחלקו, על ידי תוכנית המחקר האינטרמורלית של ה-NIH, המכון הלאומי להזדקנות, ארצות הברית (Z01-AG000746-08). J.H. נתמך על ידי הקרנות הלאומיות למדעי הטבע של סין (21708007 ו -31871365).

1. הכנת תאים
<ol><li>יום 1<ol><li>טפלו מראש בכלי תרבית בקוטר 35 מ"מ עם תחתית זכוכית בתמיסת הדבקת תאים.</li>
		<li>תאי צלחת במנות שטופלו מראש יום לפני הטיפול. התא צריך להתחלק באופן פעיל ו 50-70% במפגש ביום הניסוי. הערה: תאי HeLa שימשו בניסוי זה עם Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM, בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי, 1x פניצילין / סטרפטומיצין. אין הגבלה על קווי תאים דבקים. עם זאת, תאים שאינם דבקים חייבים להיות צנטריפוגות על שקופיות ולתקן לפני הניתוח על ידי PLA.</li>
	</ol></li>
	<li>יום 2<ol><li>הכן תמיסת מלאי של Digoxigenin Trimethyl psoralen (Dig-TMP) על ידי השעיה מחדש של aliquot קפוא של Dig-TMP מסונתז בעבר ב 1:1 EtOH:H 2 O. קבע את הריכוז על ידי מדידת OD ב 250 ננומטר של דילול 100x (ב H2O) של Dig-TMP מומס. מקדם ההכחדה של Dig-TMP הוא 25,000. ודא את הריכוז על ידי מדידת OD ב- 250 ננומטר לפני כל שימוש וחשב ריכוז במלאי: ABS x 100 x 106/25,000 = ריכוז (במיקרומטר). בדרך כלל, פתרון המניות הוא סביב 3 mM. הפתרון יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך כחודש. הערה: Dig-TMP חייב להיות מסונתז כימית מראש, בהתאם להליך המתואר כאן. ריפלוקס 4'-כלורומתיל-4,5',8-טרימתילפסוראלן עם 4,7,10-טריוקסה-1,13-טרידקנדי-אמין בטולואן תחת חנקן למשך 12 שעות. הסר את הממס ולשחזר את 4'-[N-(13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen המוצר על ידי כרומטוגרפיה ג'ל סיליקה. הצמידו את המוצר לדיגוקסיגנין NHS אסטר בדימתיל פורממיד וטריאתילאמין ב-50°C למשך 18 שעות. הסר את הממס ולטהר את השאריות על ידי הכנת שכבה דקה סיליקה ג'ל כרומטוגרפיה. יש להדליק את רצועת המוצר כלורופורם: מתנול: 28% תערובת אמוניום הידרוקסיד (8:1:0.1). אידוי הממסים והמסת הגלולה ב-50% EtOH:H2O.</li>
		<li>הוסף את מניית Dig-TMP ב-50% EtOH:H2O למדיום תרבית התאים לריכוז סופי של 5 מיקרומטר. הבא את המדיום ל-37°C. שאפו את התווך מהצלחות, הוסיפו את ה-Dig-TMP שחומם מראש והניחו את הצלחות באינקובטור (37°C, 5% CO2) למשך 30 דקות כדי לאפשר ל-Dig-TMP להתאזן.</li>
		<li>בזמן שהתאים דוגרים, חממו מראש את קופסת ה-UV (ראו טבלת חומרים) ל-37°C.</li>
		<li>הניחו את הצלחות בקופסת UV מחוממת מראש וחשפו את התאים למינון של 3 J/cm2 של אור UVA למשך 5 דקות עבור ניסוי זה. לוחות הונחו על גבי בלוק תרמי שנשמר ב 37 מעלות צלזיוס, במהלך הקרנה. חשב את הזמן באמצעות הנוסחה: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61689/61689equ01.jpg"></li>
		<li>שואפים את המדיום באמצעות פיפטה, מוסיפים מדיום טרי שחומם מראש ומניחים את הצלחות בחזרה באינקובטור בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2 למשך שעה אחת.</li>
		<li>יש להסיר את המדיה ולשטוף כלים פעם אחת בעדינות במי מלח חוצצים פוספט (PBS).</li>
		<li>הסר PBS והוסף 0.1% פורמלדהיד (FA) ב- PBS למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). זה מונע ניתוק תאים במהלך CSK-R (cytoskeleton extraction buffer containing RNase, המתואר ב-1.2.9.) טיפול מקדים הנדרש כדי לחלץ את האלמנטים הציטופלזמיים ולהפחית את רקע ה-PLA.</li>
		<li>שאפו לצאת מה-FA ולשטוף כלים עם PBS פעם אחת.</li>
		<li>הוסף חיץ CSK-R ודגור במשך 5 דקות ב- RT כדי להסיר ציטופלסמה [מאגר CSK-R: 10 mM PIPES, pH 7.0, 100 mM NaCl, 300 mM סוכרוז, 3 mM MgCl2, 0.5%Triton X-100, 300 מיקרוגרם / מ"ל RNase A]. שאפו את החיץ, הוסיפו CSK-R טרי ודגרו במשך 5 דקות ב-RT. הערה: ניתן לאחסן מלאי של מאגר CSK בטמפרטורה של 4°C, ולהוסיף Triton X ו-RNaseA ממש לפני השימוש.</li>
		<li>יש לשטוף עם PBS שלוש פעמים.</li>
		<li>תקן תאים עם 4% פורמלדהיד ב- PBS למשך 10 דקות ב- RT.</li>
		<li>לשטוף תאים עם PBS. בצע שלב זה שלוש פעמים.</li>
		<li>מוסיפים 100% מתנול קר ודגורים במשך 20 דקות בטמפרטורה של -20°C.</li>
		<li>לשטוף תאים עם PBS שלוש פעמים. בשלב זה ניתן לאחסן תאים PBS בתא לח ב 4 ° C למשך עד שבוע.</li>
		<li>לדגור על תאים ב 80 μL של 5 mM TritonX-100 במשך 10 דקות ב 4 ° C.</li>
		<li>לדגור על תאים עם 100 μL של 5 mM EDTA ב PBS בתוספת 1 μL של 100 מ"ג / מ"ל RNase A במשך 30 דקות ב 37 ° C.</li>
		<li>לשטוף תאים עם PBS שלוש פעמים.</li>
		<li>יש לאחסן תאים במאגר חוסם (5% BSA ו-10% סרום עיזים ב-PBS) בתא לח למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. בדיקת קשירת קרבה
הערה: בצע בדיקת קשירת קרבה ביום השלישי.
<ol><li>הכתמת נוגדנים<ol><li>הכינו 40 μL של תמיסת הנוגדנים הראשונית לכל צלחת: הוסיפו את הנפח המתאים של נוגדנים ראשוניים כדי להשיג את הדילול הרצוי (עכבר אנטי דיגוקסיגנין ונוגדן ארנב כנגד רכיב רפליזום כגון MCM5, CDC45, PSF1 או pMCM2, דילולים המפורטים בטבלת החומרים) למאגר חוסם (כדי להגיע לנפח סופי של 24 μL). ערבבו על ידי הקשה ותנו לו לעמוד במשך 20 דקות ב- RT. הכינו תערובת אב למספר דוגמאות וערבבו על ידי הקשה לפני החלת על הבארות.</li>
		<li>הוסף 40 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית למרכז הבאר ודגר בתא לח במשך 1 שעה ב 37 ° C. במהלך הצביעה, אפשרו לבדיקות ה-PLA ולמאגר החוסם להתחמם לטמפרטורת החדר.</li>
		<li>שטוף תאים עם PBS-T [PBS-T: 0.05% Tween-20 in 1X PBS] ב-RT. בצע שלב זה שלוש פעמים.</li>
		<li>בזמן השטיפה, הכינו 40 מיקרוליטר של תמיסת בדיקת PLA לכל צלחת (בדיקות PLA מורכבות מנוגדן משני המזהה IgG של ארנב או עכבר, הקשור באופן קוולנטי לאוליגונוקלאוטיד PLUS או מינוס): 8 μL של נוגדן PLA probe anti mouse-PLUS + 8 μL של נוגדן PLA probe anti rabbit-MINUS + 24 μL של חיץ חוסם. מערבבים ומניחים לו לעמוד במשך 20 דקות ב-RT. הכינו תערובת אב למספר דגימות וערבבו היטב לפני החלת על הבארות. מניחים את התמיסה באמצע הבאר בצלחת.</li>
		<li>הסר את השטיפה האחרונה, הוסף 40 μL של תמיסת בדיקה PLA למרכז הבאר, ודגר בתא לח במשך 1 שעה ב 37 ° C.</li>
		<li>יש לשטוף במאגר A שלוש פעמים, למשך 10 דקות כל אחת, על משטח הטיה ב-RT. במהלך השטיפה, הביאו את תערובת הקשירה ל-RT.</li>
	</ol></li>
	<li>קשירה והגברה<ol><li>מכינים 40 μL של תערובת קשירה לצלחת: 8 μL (5x) של ציר קשירה + 31 μL של מים מזוקקים + 1 μL של ליגאז. הכינו תערובת מאסטר למספר צלחות וערבבו היטב לפני החלת על הבארות.</li>
		<li>הוסיפו 40 מיקרוליטר של תמיסת קשירה לכל צלחת ודגרו בתא לח למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C.</li>
		<li>שטפו את התאים 3x עם חיץ A, כל אחד למשך 2 דקות, על משטח הטיה ב-RT.</li>
		<li>להכין 40 μL של תמיסת הגברה לכל מנה: 8 μL (5x) של מלאי הגברה + 31.5 μL של מים מזוקקים + 0.5 μL של DNA פולימראז. הכינו תערובת אב למספר דגימות וערבבו היטב לפני החלת הבארות.</li>
		<li>הוסיפו 40 מיקרוליטר של תמיסת הגברה לכל צלחת ודגרו בתא לח בטמפרטורה של 37°C למשך 100 דקות.</li>
		<li>יש לשאוף מתמיסת ההגברה ולשטוף עם חיץ B. לבצע 6 שטיפות כל אחת במשך 10 דקות, על משטח הטיה ב-RT.</li>
		<li>שטפו פעם אחת עם חיץ B 0.01x למשך דקה אחת ב-RT.</li>
		<li>שאפו חיץ B ודגרו על צלחות עם נוגדנים משניים, Alexa Fluor 488 Anti-mouse IgG ו-Alexa Fluor 568 Anti-rabbit IgG בתמיסת חסימה בדילול מתאים בחיץ חוסם, בתא לח, למשך 30 דקות ב-37°C או לילה ב-4°C.</li>
		<li>שטפו תאים שלוש פעמים עם PBS-T, למשך 10 דקות כל אחד על משטח הטיה ב-RT.</li>
		<li>שאפו PBS-T והרכבו בתווך הרכבה עם DAPI. ניתן לצלם את הלוחות המותקנים באופן מיידי או לאחסן בטמפרטורה של 4°C בחושך למשך לא יותר מ-4 ימים לפני ההדמיה.</li>
	</ol></li>
</ol>3. הדמיה וכימות
<ol><li>בצע הדמיה במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי או קונפוקלי (אם רצוי הדמיה תלת-ממדית, כסה לפחות 3 מיקרומטר ב-15 ערימות). בצע ניסויים במשולש וצלם מספר מספיק של שדות כדי לבצע לפחות 100 תצפיות לכל דגימה או תנאי. צייר את כל השדות והדגימות, כולל פקדים, באמצעות אותן הגדרות חשיפה.</li>
	<li>כימות באמצעות תוכנה מתאימה לניתוח תמונות (ראה טבלת חומרים עבור קוד פתוח ותוכנות מסחריות המסוגלות לבצע ניתוח זה בתמונות מישוריות בודדות או מרובות).<ol><li>גרעיני תאים מגזריים המבוססים על צביעת DAPI. בצע זיהוי של נקודות PLA גרעיניות. הקצה נקודות PLA לגרעין המתאים להם. ייצוא נקודות PLA לכל גרעין תוצאות כקובץ csv (ראה קובץ משלים 1 וקובץ משלים 2).</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח סטטיסטי (ראה טבלת חומרים לקבלת הצעות לקוד פתוח ולתוכנות מסחריות).<ol><li>יש לוודא אם הדגימות עוקבות אחר התפלגות תקינה באמצעות בדיקת שפירא-וילק.</li>
		<li>קבע אם יש הבדל משמעותי בין שתי דגימות באמצעות מבחן Student-t (אם הנחת ההתפלגות הנורמלית התקיימה) או מבחן Wilcoxon-Rank Sum (אם הנחת ההתפלגות הנורמלית מופרת עבור מדגם).</li>
	</ol></li>
	<li>תצוגה חזותית של נתונים: צור תרשימי נקודות בשילוב עם תרשימי תיבות כדי להציג באופן חזותי את התפלגות הנתונים, החציון (Q2), האחוזון ה-25 (Q1)והאחוזון ה-75 עבור הדגימותהשונות (ראה טבלת חומרים לקבלת קוד פתוח מוצע ותוכנה מסחרית).</li>
</ol>4.3D תצוגה של pMCM2: אינטראקציות כיל
<ol><li>תמונה לוחות PLA על מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב, באמצעות מטרת שמן צמצם מספרי Plan Fluor 60x/1.25. רכוש 16 ערימות המכסות 1.6 מ"מ וצור את השחזור התלת-ממדי באמצעות תוכנת ניתוח התמונה המתאימה (ראה טבלת חומרים).</li>
</ol>

<ol><li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).</li>
<li>Wright, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+reagents+and+protocols+for+engineering+zinc+finger+nucleases+by+modular+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).</li>
<li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+fidelity+of+the+repair+of+Cas9-induced+double-strand+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks.</a> Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).</li>
<li>Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+DNA+double-strand+break+repair%3A+An+ever-growing+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox.</a> Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24(2020).</li>
<li>Galbiati, A., Beausejour, C., d'Adda di, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single-cell+method+provides+direct+evidence+of+persistent+DNA+damage+in+senescent+cells+and+aged+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues.</a> Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).</li>
<li>Vitelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advancements+in+DNA+damage-transcription+crosstalk+and+high-resolution+mapping+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).</li>
<li>Canela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+breaks+and+end+resection+measured+genome-wide+by+end+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing.</a> Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).</li>
<li>Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+interstrand+crosslink+repair+in+mammalian+cells%3A+step+by+step%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).</li>
<li>Nejad, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstrand+DNA+cross-links+derived+from+reaction+of+a+2-aminopurine+residue+with+an+abasic+site%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site.</a> ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).</li>
<li>Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fanconi+anaemia+and+the+repair+of+Watson+and+Crick+DNA+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks.</a> Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).</li>
<li>Kaushal, S., Freudenreich, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+fork+stalling+and+DNA+structures+in+causing+chromosome+fragility%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility.</a> Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).</li>
<li>Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-coupled+DNA+interstrand+cross-link+repair+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).</li>
<li>Klein, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPF-ERCC1+acts+in+Unhooking+DNA+interstrand+crosslinks+in+cooperation+with+FANCD2+and+FANCP%2FSLX4%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4.</a> Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).</li>
<li>Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+RAD51-dependent+DNA+interstrand+cross-link+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair.</a> Science. 333 (6038), 84-87 (2011).</li>
<li>Benedetto, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+psoralens.+An+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cutis%22%5BJournal%5D)">The psoralens. An historical perspective.</a> Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+translocase+FANCM%2FMHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).</li>
<li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).</li>
<li>O'Donnell, M. E., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ring-shaped+hexameric+helicases+that+function+at+DNA+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).</li>
<li>Koos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+interactions+in+situ+by+proximity+ligation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+Interstrand+Crosslink+Proximal+Replisomes+Is+Dependent+on+ATR%2C+FANCM%2C+and+FANCD2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2.</a> Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+analysis+of+laser+localized+psoralen+adducts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55541(2017).</li>
<li>Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+kinase+ATR%3A+ensuring+faithful+duplication+of+a+challenging+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).</li>
<li>Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minichromosome+maintenance+proteins+are+direct+targets+of+the+ATM+and+ATR+checkpoint+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).</li>
<li>Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation+and+classification+of+cell+cycle+phases+in+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Image+Computing+and+Computer-Assisted%22%5BJournal%5D)">Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging.</a> Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, Pt 2 617-624 (2009).</li>
<li>Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+NPAT%2C+a+novel+substrate+of+cyclin+E-CDK2%2C+promotes+S-phase+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry.</a> Genes & Development. 12 (4), 456-461 (1998).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

למרות שה- PLA היא טכניקה חזקה מאוד, ישנם חששות טכניים שיש לפתור על מנת להשיג תוצאות ברורות וניתנות לשחזור. הנוגדנים חייבים להיות בעלי זיקה גבוהה וספציפיות. יתר על כן, חשוב להפחית את אותות הרקע הלא ספציפיים ככל האפשר. גילינו שקרומים ופסולת תאית תורמים לרקע, והסרנו אותם ככל האפשר. השטיפות עם חומר ניקוי המכיל חוצצים לפני הקיבוע, והשטיפה עם מתנול לאחר התיקון עוזרות להפחית את הקשירה הלא ספציפית. האזהרה היא שטיפול בחומרי ניקוי לפני הקיבוע עלול לגרום לניתוק תאים. אנו מוצאים כי טיפול בצלחות עם דבק תאים וקידומת עם 0.1% FA לפני הט...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/6517">Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion</a>.
The Authors section was updated from:
Jing Zhang*1 
Jing Huang*2 
Ryan C. James3 
Julia Gichimu1 
Manikandan Paramasivam4 
Durga Pokharel5 
Himabindu Gali6 
Marina A. Bellani1 
Michael M Seidman1 
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health 
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University 
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen 
5Horizon Discovery 
6Boston University School of Medicine 
* These authors contributed equally
to:
Jing Zhang*1 
Jing Huang*2 
Ishani Majumdar1 
Ryan C. James3 
Julia Gichimu1 
Manikandan Paramasivam4 
Durga Pokharel5 
Himabindu Gali6 
Marina A. Bellani1 
Michael M Seidman1 
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health 
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University 
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen 
5Horizon Discovery 
6Boston University School of Medicine 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/6517">Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion

התגובה התאית לשברים כפולים מתועדת היטב הודות לרצף של שיטות חזקות יותר ויותר להכוונת הפסקות לאתרים גנומיים ספציפיים 1,2,3. ודאות המיקום מאפשרת אפיון חד משמעי של חלבונים וגורמים אחרים המצטברים באתר ומשתתפים בתגובת הנזק לדנ"א (DDR), ובכך מניעים את מסלולי חיבור הקצה הלא הומולוגי (NHEJ) והקומבינציה ההומולוגית (HR) המתקנים שברים. כמובן, הפסקות רבות מוצגות על ידי סוכנים כגון קרינה ומינים כימיים שאינם תוקפים רצפים ספציפיים4. עם זאת, עבור אלה ישנם נהלים זמינים שיכולים להמיר את הקצוות למבנים מקובלים עבור תיוג לוקליזציה 5,6. הפסקות מוצגות גם על ידי תהליכים ביולוגיים, כגון סידור מחדש של אימונוגלובולינים, והטכנולוגיה העדכנית מאפשרת לוקליזציה שלהם, כמו גם7. לאחר מכן ניתן לקבוע את הקשר בין הגורמים המגיבים לבין אתרים אלה.
הפסקות מופיעות גם כתוצאה עקיפה של אדדוקציות הנוצרות על ידי תרכובות שאינן מפסקות אינהרנטיות אלא משבשות עסקאות DNA כגון שעתוק ושכפול. הם עשויים להיווצר כתכונה של התגובה התאית לחסימות אלה, אולי במהלך תיקון או משום שהם מעוררים מבנה פגיע להתקפת נוקלאז. בדרך כלל, הקשר הפיזי בין האדוקט, ההפסקה והקשר עם גורמים מגיבים הוא היסק. לדוגמה, כילים נוצרים על ידי כימותרפיות כגון ציספלטין ומיטומיצין C8 וכתוצר תגובה של אתרים בסיסיים9. מזלגות כיל ידועים כבלוקים חזקים למזלגות שכפול10, ובכך מעכבים מזלגות שניתן לבקע על ידי נוקלאזות11. הקישור הקוולנטי בין הגדילים מוקל לעתים קרובות על ידי מסלולים שיש להם הפסקות מחייבות כביניים 12,13, מה שמחייב רקומבינציה הומולוגית כדי לבנות מחדש את מזלג השכפול14. ברוב הניסויים עוקב החוקר אחר תגובת הגורמים המעניינים להפסקות הנוצרות במורד הזרם של התנגשות מזלג שכפול עם כיל. עם זאת, מכיוון שלא נמצאה טכנולוגיה ללוקליזציה של נגע פרובוקטיבי, ניתן רק להניח את קרבתו של הרפליזום, וחלקיו המרכיבים, לכיל.
פיתחנו אסטרטגיה המאפשרת ניתוח של אסוציאציות חלבוניות עם אדדוקטים קוולנטיים ספציפיים שאינם רצפים, כפי שמודגם כאן על ידי ICLs. במערכת שלנו אלה מוצגים על ידי psoralen, מוצר טבעי פוטואקטיבי המשמש במשך אלפי שנים כטיפול להפרעות עור15. הגישה שלנו מבוססת על שתי תכונות חשובות של פסאורלן. הראשון הוא התדירות הגבוהה שלהם של היווצרות crosslink, אשר יכול לעלות על 90% של adducts, בניגוד פחות מ 10% שנוצרו על ידי תרכובות פופולריות כגון cisplatin או Mitomycin C 8,16. השני הוא נגישות המתחם לצמידות ללא אובדן יכולת הצלבה. קישרנו באופן קוולנטי בין טרימתיל פסאורלן לדיגוקסיגנין (Dig), אימונוטאג ותיק. זה מאפשר זיהוי של adducts psoralen בדנ"א גנומי על ידי immunostaining של תג Dig, והדמיה על ידי immunofluorescence קונבנציונאלי17.
מגיב זה יושם, בעבודתנו הקודמת, לניתוח מפגשי מזלג שכפול עם כיל באמצעות בדיקה מבוססת סיבי DNA16. בעבודה זו מצאנו כי השכפול יכול להימשך מעבר לכיל שלמה. זה היה תלוי בקינאז ATR, אשר מופעל על ידי מתח שכפול. ההפעלה מחדש של השכפול הייתה בלתי צפויה בהתחשב במבנה של מנחת המסוקים המשוכפל CMG. זה מורכב מהטרו-הקסמר MCM (M) היוצר טבעת פעורת היסט סביב גדיל התבנית לסינתזה מובילה של גדיל אשר ננעל על ידי החלבונים של קומפלקס GINS (G, המורכב מ- PSF1, 2, 3 ו- SLD5) ו- CDC45 (C)18. ההצעה כי השכפול יופעל מחדש בצד הדיסטלי של כיל לצד ההתנגשות של הרפליזום טענה לשינוי במבנה הרפליזום. כדי לענות על השאלה אילו רכיבים היו בתשובה בזמן המפגש עם כיל פיתחנו את הגישה המתוארת כאן. ניצלנו את תג Dig כשותף ב-Proximity Ligation Assays (PLA)19 כדי לחקור את הקשר ההדוק של כיל עם חלבונים של replisome20.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 568, עיזים נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב</td><td>Invitrogen</td><td>A-10011</td><td>1 ב-1000</td></tr><tr><td>צלחות 35 מ"מ עם זכוכית 1.5 כיסוי</td><td>MatTek</td><td>P35-1.5-14-C</td><td>זכוכית תחתונה כלי מיקרווול 35 מ"מ צלחת פטרי Microwell</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488, עז נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב</td><td>Invitrogen</td><td>A-10001</td><td>1 ב-1000</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>SeraCare</td><td>1900-0012</td><td>פתרון חסימה, יש לאחסן ריאגנטים בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>CDC45 נוגדן (ארנב)</td> <td>Abcam</td><td>ab126762</td><td>1 ב 200</td></tr><tr><td>דבק תאים</td><td>מדעי החיים</td><td>354240</td><td>לתמיסת TAK</td></tr> תא <tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Nikkon</td><td>TE2000 מיקרוסקופ דיסק מסתובב</td><td>מצויד בתוכנת Volocity</td></tr><tr><td>נוגדן Digoxigenin (Dig) (עכבר)</td> <td>Abcam</td><td>ab420</td><td>1 ב 200</td></tr><tr><td>Dig-TMP</td><td>מסונתז ב ריאגנטים</td> להגברה Duolink של מעבדת <td></td><td></td>זיידמן</tr><tr><td>(5&)</td>יש לאחסן ריאגנטים <td>DUO82010</td> <td>של סיגמא-אולדריץ'</td><td>בטמפרטורה של -20 מעלות; יש</td></tr><tr>לאחסן<td>ריאגנטים לזיהוי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>DUO92007</td> C Duolink <td>בטמפרטורה של -20 ו-deg; C</td></tr><tr><td>Duolink באתרו אוליגונוקלאוטיד בדיקת PLA MINUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td>נגד עכבר MINUS, יש לאחסן ריאגנטים בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>Duolink באתרו אוליגונוקלאוטיד בדיקת PLA PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td>אנטי-ארנב PLUS, יש לאחסן ריאגנטים בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>Duolink במאגר כביסה באתרו A</td><td>מאגרי כביסה של Sigma-Aldrich</td><td>DUO82046</td><td>Duolink, יש לאחסן ריאגנטים בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>Duolink במאגר כביסה באתרו B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82048</td><td>Duolink Wash Buffers, יש לאחסן ריאגנטים בטמפרטורה של 4 מעלות; </td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי</td><td>C</td><td>מיקרוסקופ Zeiss Axiovert 200M</td><td>מצויד בחבילות התוכנה Axio Vision (Zeiss, גרמניה)</td></tr> <tr><td>פורמלדהיד 16%</td> <td>Fisher Scientific</td><td>PI28906</td><td>לתיקון תמיסת</td></tr><tr><td>סרום עיזים</td><td>Thermo</td><td>31873</td><td>תמיסת חסימה, יש לאחסן ריאגנטים בטמפרטורה של 4 מעלות; </td></tr><tr><td>C תוכנת ניתוח תמונה</td><td>בקוד פתוח</td><td>Cell profiler</td><td>עובד לניתוח תמונות מישור יחיד</td></tr><tr><td>נדרש רישיון</td><td>תוכנת ניתוח Bitplane</td><td>Imaris</td><td>מודול ביולוגיה של התא. יכול לכמת נקודות/גרעינים PLA בערימות תמונות (3D) ולבצע שחזורים תלת מימדיים</td></tr><tr><td>Ligase (1 יחידה/&mu; l)</td> יש לאחסן ריאגנטים <td>DUO82029</td> <td>של סיגמא-אולדריץ'</td><td>בטמפרטורה של -20 מעלות; מגיב קשירה C</td></tr><tr><td>(5&)</td>יש לאחסן ריאגנטים <td>DUO82009</td> <td>של סיגמא-אולדריץ'</td><td>בטמפרטורה של -20 מעלות; </td></tr><tr><td>C נוגדן MCM2 (ארנב)</td><td>Abcam</td><td>ab4461</td><td>1 ב-200</td></tr><tr><td>נוגדן MCM5 (חד-שבטי ארנב)</td><td>Abcam</td><td>Ab75975</td><td>1 ב-1000</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Lab ALLEY</td><td>A2076</td><td>טרום קר ב-20&deg; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>פוספוMCM2S108 נוגדן (ארנב)</td><td>Abcam</td><td>ab109271</td><td>1 ב-200</td></tr><tr><td>פולימראז (10 יחידות/&mu; l)</td> יש לאחסן ריאגנטים <td>DUO82030</td> <td>של סיגמא-אולדריץ'</td><td>בטמפרטורה של -20 ו-deg; C</td></tr><tr><td>להאריך את אמצעי ההרכבה מזהב עם נוגדן DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>PSF1 (ארנב)</td><td>Abcam</td><td>ab181112</td><td>1 ב-200</td></tr><tr><td>RNAse A 100 מ"ג/מ"ל</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>ריאגנטים צריכים להיות מאוחסנים ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>תוכנה לניתוח סטטיסטי והדמיית נתונים</td><td>בקוד פתוח</td><td>R studio</td><td>ggplot2 חבילה ליצירת תרשים נקודות ותיבה</td></tr> ניתוח <tr><td>סטטיסטי והדמיית נתונים תוכנת רישיון</td><td>Systat Software</td><td>Sigmaplot V13</td><td></td></tr><tr><td>TMP (trioxalen)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T6137_1G</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787_250ML</td><td></td></tr><tr><td>טווין 20</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P9416_100ML</td><td></td></tr><tr><td>תיבת UV</td><td>דרום ניו אינגלנד אולטרה סגול</td><td></td><td>הופסק. ראה תא בדיקת UV של Opsytec כתחליף אפשרי</td></tr><tr><td>תא בדיקת UV תא בדיקת UV</td><td>Opsytec</td><td>UV TEST CHAMBER BS-04</td><td></td></tr><tr><td>VE-821</td><td>Selleckchem</td><td>S8007</td><td>הריכוז הסופי הוא 1&micro; מ</td></tr></tbody></table>

הדמיה של מפגשים רפליזומיים עם נגע חוסם מתויג אנטיגן

Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion

תובנה משמעותית קיימת לגבי התגובה התאית לשברי גדיל כפול (DSB), הנגרמים על ידי נוקלאזות, קרינה ומפסקי דנ"א אחרים. בין השאר, הדבר משקף את זמינותן של שיטות לזיהוי אתרי הפסקה, ואת אפיון הגורמים שגויסו ל-DSB ברצפים אלה. עם זאת, DSBs מופיעים גם כמתווכים במהלך עיבוד של צינורות DNA שנוצרו על ידי תרכובות שאינן גורמות ישירות להפסקות, ואינן מגיבות באתרי רצף ספציפיים. כתוצאה מכך, עבור רוב סוכנים אלה, טכנולוגיות המאפשרות ניתוח של אינטראקציות קשירה עם גורמי תגובה וחלבוני תיקון אינם ידועים. לדוגמה, קישורים צולבים בין גדילי דנ"א (ICLs) יכולים לעורר שברים בעקבות מפגשי מזלג שכפול. למרות שנוצרו על ידי תרופות בשימוש נרחב כמו כימותרפיה סרטן, לא היתה מתודולוגיה לניטור האינטראקציות שלהם עם חלבונים שכפול.
כאן, אנו מתארים את האסטרטגיה שלנו לעקוב אחר התגובה התאית להתנגשויות מזלג עם adducts מאתגר אלה. קישרנו אנטיגן סטרואידים לפסורלן, היוצר כיל תלוי פוטואקטיבציה בגרעינים של תאים חיים. הכילים הודגמו על ידי אימונופלואורסנציה כנגד תג האנטיגן. התג יכול גם להיות שותף בבדיקת קשירת הקרבה (PLA) המדווחת על קשר הדוק של שני אנטיגנים. ה-PLA נוצל כדי להבדיל בין חלבונים שהיו קשורים קשר הדוק עם כיל מתויגת לבין חלבונים שלא. ניתן היה להגדיר חלבונים רפליזומיים שנשמרו לאחר מפגשים עם כיל ולזהות חלבונים אחרים שאבדו. גישה זו ישימה לכל מבנה או צינור DNA שניתן לזהות באופן אימונולוגי.

PLA של Dig-TMP עם חלבונים replisome המבנה של Dig-TMP מוצג באיור 1. פרטי הסינתזה, שבה טרימתיל פסאורלן צומד באמצעות מקשר גליקול לדיגוקסיגנין, נדונו בעבר17,21. דגירה של תאים עם התרכובת ואחריה חשיפה לאור 365 ננומטר (UVA) פוטואקטיבית את התרכובת ומניעה את תגובת הקרוסלינקינג. קצת יותר מ-90% מהחברות הן של כיל16. התג Dig יכול להיות מומחש על-ידי immunofluorescence אשר חושף את נוכחותם של ICL ברחבי הגר...

בעוד התנגשויות מזלג שכפול עם צינורות DNA יכול לגרום לשברים גדיל כפול, פחות ידוע על האינטראקציה בין replisomes וחסימת נגעים. השתמשנו במבחן קשירת הקרבה כדי להמחיש מפגשים אלה ולאפיין את ההשלכות על קומפוזיציה רפלימית.

Considerable insight is present into the cellular response to double strand breaks (DSBs), induced by nucleases, radiation, and other DNA breakers. In ...

טכניקה זו מקלה על הדמיה של מפגשי DNA מתויגים אנטיגן replisome וניתן להרחיב אותה לאינטראקציות של כל חלבון עם מבנה DNA או נגע מקובל על immunodetection. שיטה זו יכולה לשמש להערכת תדרי אינטראקציה בתוך תאים בודדים, ולא על פני אוכלוסייה, ומאפשרת הדמיה של אינטראקציות תלויות מחזור התא באתרן מבלי לפגוע בתאים. מי שידגים את ההליך יהיה אישני מג'ומדר, פוסט-דוקטורנט ממעבדת זיידמן.ביום שלפני הניסוי, זרעו 1.5 כפול 10 לתאים החמישיים בשני מיליליטר של בינוני על צלחת תרבית תחתית זכוכית 35 מ"מ שטופלו מראש בתמיסת דבק תאים. למחרת, החליפו את הסופרנאטנט בכל צלחת ב-37 מעלות צלזיוס ב-5 תרביות תאים בנפח 50% עד 70% והחזירו את הצלחות לאינקובטור תרביות התא למשך 30 דקות כדי לאפשר ל-Dig TMP להתאזן. בזמן שהתאים דוגרים, מחממים מראש קופסת UV ל -37 מעלות צלזיוס.בתום שיווי המשקל, מעבירים את הצלחות לקופסה המחוממת מראש כדי לחשוף את התאים למנת אור UVA של שלוש דקות של שלושה ג'אול לסמ"ר ומחליפים את הסופרנאטנטים בשני מיליליטר של מדיום תרבית טרי שחומם מראש לפני החזרת הצלחות לאינקובטור תרביות התאים למשך שעה. בסוף הדגירה, שטפו בעדינות את התרביות עם PBS וקיבעו את התאים עם מיליליטר אחד של 0.1% פורמלדהיד ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, שטפו את התאים פעם אחת עם PBS לפני שטיפלו בתאים פעמיים עם 80 מיקרוליטר של חיץ מיצוי שלד ציטו-שלד בתוספת RNase במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לכל טיפול כדי להסיר את הציטופלסמה.לאחר הדגירה השנייה, שטפו את התאים עם שני מיליליטר PBS שלוש פעמים לפני קיבוע התאים עם מיליליטר אחד של 4% פורמלדהיד ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הקיבוע השני, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS כפי שהודגם, ולאחר מכן טיפול עם מיליליטר אחד של מתנול קר 100% במשך 20 דקות במינוס 20 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים בשני מיליליטר של PBS, ולאחר מכן דגירה של 10 דקות ב 80 מיקרוליטר של חמישה מילימולרים טריטון X-100 בארבע מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, לטפל בתאים עם 100 מיקרוליטר של חמישה מילימולר EDTA ב PBS, בתוספת מיקרוליטר אחד של 100 מיליגרם למיליליטר של RNase A במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, שטפו את התאים שלוש פעמים ב-PBS לפני אחסונם באלבומין בסרום בקר 5% ובסרום חמור 10% ב-PBS בתא לח למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לביצוע בדיקת קשירת קרבה, מוסיפים 40 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים הראשונית המעניינת למרכז כל צלחת ודגרים על הצלחות בתא הלח למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.בתום הדגירה, שטפו את התאים שלוש פעמים עם שני מיליליטר PBST לפני הוספת 40 מיקרוליטר של תמיסת בדיקת PLA טרייה שהוכנה לכל צלחת לדגירת שעה באינקובטור תרביות התא. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים עם שלוש שטיפות של 10 דקות בשני מיליליטר של חיץ A על פלטפורמת הטיה בטמפרטורת החדר. לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו 40 מיקרוליטר של תערובת קשירה טרייה לכל צלחת לדגירת 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שלוש שטיפות של שתי דקות בחיץ A על משטח ההטיה.לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו 40 מיקרוליטר של תמיסת הגברה טרייה לכל צלחת לדגירה של 100 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא לח. בתום הדגירה, שטפו את התאים שש פעמים עם חיץ B טרי במשך 10 דקות לכל שטיפה על משטח ההטיה. לאחר שטיפת החיץ B האחרונה, שטפו את התאים פעם אחת עם חיץ B 0.01x למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר לפני התיוג עם הנוגדנים המשניים המתאימים בתא הלח למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, שטפו את הדגימות בשלוש שטיפות של 10 דקות על משטח הטיה ב-PBST בטמפרטורת החדר לפני הרכבתן באמצעי הרכבה בתוספת DAPI. בתוך ארבעה ימים מרגע ההרכבה, צלם לפחות 100 תצפיות לכל דגימה או התנה תאים במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי או קונפוקלי, תוך שימוש באותן הגדרות חשיפה הן עבור דגימות ניסוי והן עבור דגימות ביקורת. התג Dig ניתן לדמיין על ידי immunofluorescence כדי לחשוף את נוכחותם של crosslinks interstrand ברחבי הגרעין.כדי להמחיש את האינטראקציה של replisomes עם crosslinks interstrand, PLA יכול להיות מיושם כדי לדמיין את תדירות האסוציאציה של MCM5 ואת התג Dig, שעה לאחר הצגת interstrand crosslink. כאשר לחץ השכפול מפעיל ATR קינאז, ה-PLA בין pMCM שני סרין 108 ותג Dig הוא גם חיובי. תוצאות PLA מגרעינים בודדים יכולות להיות מוצגות בשחזור תלת ממדי המאפשר הדמיה של מפגשי קישור בין-גדילי ברחבי הגרעין.ניתוח Replication Fork מצביע על כך שמפגשים בין גדילי crosslink מדגימים תופעה בלתי צפויה של שכפול מחדש, מכיוון שהחלבונים של קומפלקס GINS אינם מצליחים להציג אות PLA עם הקרוסלינקים הבין-גדיליים. לעומת זאת, הבדיקה עם CD 45 היא חיובית, מה שמצביע על כך שהחלבון הנועל האחר נשמר. כאשר תאים מודגרים עם מעכב ATR, ההפעלה מחדש מדוכאת לחלוטין ואת GINS Dig PLA חיובי מאוד.טיפול CSK+R חיוני להפחתת אות הרקע. הקפידו לצפות את הצלחות בדבק תאים ולבצע קידומת עם 0.1% FA, אחרת התאים יתקלפו מהצלחת.

visualization-replisome-encounters-with-an-antigen-tagged-blocking

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Visualization of Viral Double-Stranded RNA and Host Pattern Recognition Receptors in Infected Epithelial Cells

אנו מתארים כאן מערכת המשתמשת בבלוק חלבון in vivo ספציפי לאתר, הפיך כדי לעכב ולמוטט מזלגות שכפול ב-Escherichia coli. הקמת בלוק השכפול מוערכת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל אגרוז ניטרלי-ניטרלי משמשת להדמיית חומרי ביניים לשכפול.

התרמת סתימה שכפול לאתרים ספציפיים ב<i&gt; E. coli</i&gt; באמצעות מערכת מפעיל פלורסנט מדכא

הנה, הוא הוכיח כיצד באתרו Proximity Ligation Assay (PLA) ניתן להשתמש כדי לזהות ולחזות אינטראקציות חלבונים ישיר חלבון בין כספומט p53 בתרביות תאים ההשעיה חשופים ללחץ genotoxic.

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

Microirradiation לייזר הוא כלי שימושי עבור מחקרים של תיקון ה-DNA בתאים חיים. בגישה מתודולוגי לשימוש של לייזרים UVA לזירוז נגעים דנ א שונים מוצג. לנו יש אופטימיזציה שיטה microirradiation המקומי המתחזק מחזור תא נורמלי; לפיכך, תאים לקרינה להמשיך לעבור מיטוזה.

מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון וקינטיקה ב DNA נגעים מתקדמות

לומד DNA נזק תיקון קינטיקה דורש מערכת לזירוז נגעים ב גרעיני תת אזורים מוגדרים. אנו מתארים שיטה ליצור מעברי גדילי זוגיות המותאמות לשפות אחרות באמצעות סריקה בלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד 405 ננומטר לייזר ולספק שגרות אוטומטיות כדי לכמת את הדינמיקה של הגורמים תיקון הפצעים כאלה.

חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה

תיקון של זוגיות-גדיל DNA מעברי הוא תהליך דינמי, הדורשים לא רק היווצרות תיקון מכלולי השברים, אבל גם הרזולוציה שלהן לאחר הנגע הוא ממוען. כאן, אנו משתמשים מיקרוסקופ immunofluorescence עבור ארעי לטווח ארוך כפול גדילי ומעברי ככלי לנתח מנגנון תחזוקה זה הגנום.

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א על ידי מיקרוסקופ פלורסצנטיות גמורה (TIRFM) באמצעות מצע DNA λ ששונה site-specifically נקודה קוונטית הנקרא חלבון.

להמחיש את האינטראקציה בין התווית על-ידי Qdot חלבונים ו- DNA λ ששונה Site-specifically ברמת מולקולה בודדת

בעקבות נזק DNA, תאים אנושיים להפעיל מסלולי תיקון חיוניים כדי לשחזר את שלמות הגנום שלהם. כאן, אנו מתארים את השיטה של חיסון עקיף כאמצעי לזיהוי חלבוני תיקון DNA, לנתח את הגיוס המרחבי והזמני שלהם, ולעזור לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון באתרים של נזק DNA.

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

מבחני לכידת לולאת D (DLC) והרחבת לולאת D (DLE) משתמשים בעקרון קשירת הקרבה יחד עם PCR כמותי כדי לכמת היווצרות לולאת D, הרחבת לולאת D והיווצרות מוצרים באתר של שבר דו-גדילי אינדוקטיבי ב- Saccharomyces cerevisiae.

איתור מתווכי רקומבינציה הומולוגיים באמצעות קשירת קרבה ו-PCR כמותי ב-Saccharomyces cerevisiae

הפרוטוקול הבא מציג זיהוי של מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא תוך שימוש בסנכרון מחזור התא ואחריו צביעה אימונופלואורסצנטית RPA2.

הדמיה של מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא

חקור את האינטראקציות בין רפליזומים לנגעי DNA באמצעות שיטת proximity ligation assay בתאי אדם. שיטה זו מאפשרת הדמיה של מפגשים תלויי מחזור התא במצב in situ ללא פגיעה בתאים.

הדמיה של מפגשים רפליזומיים עם נגע חוסם מתויג אנטיגן

גלה סרטונים נוספים