Name: הכנת תאי אדיפוס אבות מרקמות שומן אפידימליות עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: למד לבודד תאי אדיפוס אבות מרקמת שומן אפידימלית בעכבר באמצעות מיון תאים פלואורסצנטי. השיטה מספקת תאים בעלי חיוניות גבוהה לניתוח RNA ברמת תא בודד ומחקרי ביולוגיה תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים את מאיו קליניק מיקרוסקופיה ניתוח תאים הליבה Cytometry מתקן לסיוע עם מיון FACS.

כל ההליכים הניסיוניים בבעלי חיים בוצעו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מאיו קליניק.
1. הכנת פתרון 
<ol><li>הכן קולאז 2% (w / v) פתרון על ידי המסת קולגנאז II 2 גרם ב 100 מ"ל הנקס' פתרון מלח מאוזן (HBSS). Aliquot 200 μL כל אחד לכל שימוש.</li>
	<li>הכן מדיום נטרול על ידי ערבוב 84 מ"ל F-12 בינוני, 15 מ"ל סרום סוס, ו 1 מ"ל פניצילין / סטרפטומיצין.</li>
	<li>הכן מאגר cytometry זרימה על ידי המסת 500 מ"ג של אלבומין סרום שור (BSA) ו 400 μL של 0.5 M EDTA ב 100 מ"ל של מלוחים אגירה פוספט של Dulbecco (DPBS).</li>
</ol>2. ניתוח של כרית שומן אפידילית ניתוק רקמות
<ol><li>המתת חסד אנושית (נקע isoflurane / צוואר הרחם) עכבר זכר אחד. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בעכבר FVB בן ארבעה חודשים.</li>
	<li>יש למרוח/לרסס 70% אתנול על הבטן ולחשוף את חלל הבטן התחתון באמצעות מספריים נקיים ומלקחיים.</li>
	<li>אתר כרית שומן אפידילית (פרוקסימלית / מחוברת לאשכים). להחזיק את הצומת בין האשכים כרית שומן epididymal עם מלקחיים קהים למשוך בעדינות כדי לשחרר את כרית שומן epididymal.</li>
	<li>הסר אשכים על ידי חיתוך באמצעות מספריים כרית שומן אפידילית דגירה ב 5 מ"ל של HBSS בתוספת 3% BSA בצינור חרוט 50 מ"ל בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 150 x גרם במשך 7 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>קח כרית שומן אפידילית צפה מצינור חרוט 50 מ"ל וטחון דק את הרקמה באמצעות מספריים נקיים.</li>
	<li>הוסף 200 μL קולגנאז 2% פתרון לתוך 3.8 מ"ל של HBSS בצינור תרבות 13 מ"ל. מוסיפים את הרקמה הטחונית ואת הדגירה באינקובטור מסתובב ב 5 סל"ד עבור 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס. במקום אינקובטור מסתובב, חממת תרבית תאים ב 37 °C (69 °F) ניתן להשתמש לחילופין עם תסיסה מדי פעם.</li>
	<li>מעבירים את כל התוכן לצינור חרוט של 50 מ"ל ומוסיפים 10 מ"ל של מדיום נטרול. מערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור 2-3 פעמים.</li>
	<li>הכן עוד צינור חרוט 50 מ"ל מצויד מסננת תאים 70 מיקרומטר. לסנן את הרקמה המתעכלת לתוך הצינור החדש באמצעות מסננת התא.</li>
	<li>להעביר את הזרימה דרך צינור חרוט 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 350 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בזהירות להסיר את כדורי תא supernatant ו resuspend עם 5 מ"ל של DPBS. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בזהירות להסיר את supernatant ולהוסיף 50 μL של מאגר cytometry זרימה. מערבבים היטב על ידי pipeting בעדינות ולשמור על התאים על הקרח. בשל נפח כדורי התא וכמות קטנה של supernatant שיורית, נפח כולל של תאים במאגר cytometry זרימה יהיה גדול מ 50 μL (כ 100 μL).</li>
</ol>3. תיוג נוגדנים ופלואורסצנטיות מופעל מיון תאים (FACS)
<ol><li>לאחר ערבוב התאים היטב עם pipetting עדין, להעביר 54 μL של המתלה התא לתוך צינור microcentrifuge 1.7 מ"ל. הוסף 6 μL של מגיב חסימת FcR ומערבבים היטב על ידי pipetting בעדינות. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. שמור את כל התאים שנותרו לאחר נטילת 54 μL ולשמור אותם בקרח להשתמש כשליטה מוכתמת בשלב 3.5 וצעד 3.6.</li>
	<li>במהלך הדגירה בשלב 3.1, הכינו קוקטייל נוגדנים על ידי שילוב של 11 μL כל אחד נוגדנים אנטי סקא1-APC, אנטי Ter119-FITC, אנטי CD31-FITC, נוגדנים נגד CD45-FITC בצינור microcentrifuge. מערבבים היטב על ידי צינור עדין ולשמור על קרח מוגן מפני אור.</li>
	<li>לאחר הדגירה עם FcR חסימת ריאגנט במשך 10 דקות, להוסיף 40 μL של קוקטייל הנוגדנים ומערבבים היטב על ידי pipetting עדין. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.</li>
	<li>הוסף 500 μL של מאגר cytometry זרימה בתוספת 1 מיקרוגרם / מ"ל של DAPI לתוך התאים המוכתמים. מערבבים היטב על ידי צינור עדין לתאי סינון באמצעות מבחנה 5 מ"ל עם כובע הצמדה מסננת תאים. שמור תאים על קרח.</li>
	<li>הוסף 500 μL של מאגר cytometry זרימה לתאים הנותרים בשלב 3.1 ומערבבים היטב על ידי pipetting עדין. סנן תאים באמצעות מבחנה של 5 מ"ל עם מכסה הצמדה למסננת תאים. שמור תאים אלה על הקרח ולהשתמש כפקד מוכתם בשלב הבא.</li>
	<li>קח את התאים המוכתמים ואת השליטה הבלתי מוכתמת לניתוח FACS או למכשיר מיון.<ol>
<li>זהה ובודד את אוכלוסיית APC+/FITC-/DAPI- עם אסטרטגיות גטינג המוצגות באיור 1. תאים אלה מייצגיםתאים מעשיים מסוג Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45. פסולת וצבירות תאים מתרוקנות באמצעות החלקות קדימה (FSC) ופיזור צדדי (SSC). לאחר מכן, DAPI- האוכלוסייה מגודרת, ואחריו gating של APC+/ FITC- אוכלוסייה. יש להשתמש בפקדים לא מוכתמים כדי לסייע בהגדרת פרמטרי gating.</li>
		<li>לאסוף את התאים לתוך 500 μL של חיץ cytometry זרימה בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. בהמשך, כל ההליכים צריכים להתבצע בתנאים סטריליים כדי למזער זיהום. כ 50,000 – 100,000 תאים נאספים מעכבר אחד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ספירת תאים באמצעות המוציטרומטר כדי להעריך את הכדאיות של התא. מאחר שצבירות תאים עלולות להפריע לניתוחים נוספים במורד הזרם, נוכחותם של צבירות תאים מוערכת גם היא כדי להבטיח נוכחות מינימלית (<5% ממספר התאים בר-הקיימא) של אגרגטים אלה.</li>
</ol>

<ol><li>Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+obesity+on+metabolism+in+men+and+women.+Importance+of+regional+adipose+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).</li>
<li>Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+obesity+in+man%3A+cellular+character+of+the+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).</li>
<li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).</li>
<li>Halberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1alpha+induces+fibrosis+and+insulin+resistance+in+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).</li>
<li>Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+as+a+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Obesity as a Disease.</a> Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).</li>
<li>Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+stem+cells+meet+preadipocyte+commitment%3A+going+back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future.</a> Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).</li>
<li>Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+the+adipose+progenitor+cell+landscape+in+healthy+and+obese+visceral+adipose+tissue+using+single-cell+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling.</a> Life Science Alliance. 2, 201900561(2019).</li>
<li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).</li>
<li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> eLife. 7, 39636(2018).</li>
<li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364, 2501(2019).</li>
<li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559, 103-108 (2018).</li>
<li>Raajendiran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Metabolically+Distinct+Adipocyte+Progenitor+Cells+in+Human+Adipose+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues.</a> Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).</li>
<li>De Matteis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+physiological+transdifferentiation+of+adult+adipose+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells.</a> Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).</li>
<li>Hanamsagar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+workflow+for+single-cell+transcriptomics+and+repertoire+profiling+of+purified+lymphocytes+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples.</a> Scientific Reports. 10, 2219(2020).</li>
<li>Marinovic, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crotamine+induces+browning+of+adipose+tissue+and+increases+energy+expenditure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice.</a> Scientific Reports. 8, 5057(2018).</li>
<li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+clinical+availability+of+adipose-derived+stem+cells+for+pelvic+dead+space+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).</li>
<li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li>
<li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

רצף RNA של תא יחיד (scRNA-seq) צובר תאוצה במהירות ככלי רב עוצמה לחקור בו זמנית אוכלוסיות תאים מגוונות ברמת התא הבודד. בשל עלויות גבוהות הקשורות להכנת מדגם רצף תפוקה גבוהה, זה הכרחי כדי לייעל את התשומות הסלולר (כדאיות גבוהה וטוהר) כדי להגדיל את הסבירות להצלחה ניסיונית. פרוטוקולים מסוימים להכנת תאים מסתמכים על הסרת תאים מתים ופסולת באמצעות שטיפות ספין נמוך והפרדה מבוססת עמודה ללאFACS מיון 14. עם זאת, רבות משיטות אלה מפחיתות באופן משמעותי את מספר התאים המשוחזרים, ובמקרים רבים, תאים מתים אינם מוסרים ל...

רקמת שומן ממלאת תפקיד מפתח בחילוף החומרים של האנרגיה. עודף אנרגיה מאוחסן בצורה של שומנים, ורקמת שומן מסוגל התרחבות משמעותית או נסיגה בהתאם למצב תזונתי וביקוש אנרגטי. הרחבת רקמת השומן יכולה לנבוע מגידול בגודל adipocyte (היפרטרופיה) ו/או מעלייה במספר adipocyte (היפרפלזיה); התהליך האחרון מוסדר בחוזקה על ידי התפשטות ובידול של תאים אב שומן1,2. במהלך השמנת יתר, רקמת השומן מתרחבת יתר על המידה, ותפקוד לקוי של רקמות – כולל היפוקסיה, דלקת ועמידות לאינסולין – מתפתח לעתיםקרובות 3,4. סיבוכים אלה הם גורמי סיכון למחלות כרוניות רבות כולל יתר לחץ דם, סוכרת, מחלות לב וכלידם, שבץמוחי וסרטן 5 . לפיכך, הגבלת הרחבת רקמת שומן בלתי מבוקרת והפתולוגיות של רקמת שומן מקלות הן בראש סדר העדיפויות המחקרי הביו-רפואי. במהלך הרחבת רקמת השומן, תאי גזע שמקורם ברקמת שומן (ASCs) מתרבים ומבדילים ברצף לתוך preadipocytes (תאי אב מחויבים) ולאחר מכן לתוך adipocytesבוגרת 6. מחקרים אחרונים על רצף רנ"א חד-תאי (scRNA-seq) מראים כי אוכלוסיות אלה של תאי אב שומן (APC) (ASCs ו preadipocytes) מפגינים הטרוגניות מולקולרית ופונקציונלית משמעותית7,8,9,10,11,12. לדוגמה, ASCs מציגים יכולת בידול אדיפוגנית מופחתת, תוך הפגנת יכולות התפשטות והרחבה גבוהות יותר, בהשוואה ל- preadipocytes7. הבדלים מולקולריים נוספים מדווחים בתוך ASC ואוכלוסיות preadipocyte, אם כי הרלוונטיות התפקודית של הבדלים אלה עדיין לא ברור7. יחד, נתונים אלה מדגישים את המורכבות של מאגר התאים האב השומן ומדגישים את הצורך לפתח ולתקנן כלים כדי להבין ולטפל טוב יותר באוכלוסיות תאים קריטיות אלה.
פרוטוקול זה מפרט את הבידוד של Sca1+ אוכלוסיות תאים אב שומן אדידימאלי העכבר המתאימים ניתוחים רגישים במורד הזרם, כולל מחקרים חד-תאיים (scRNA-רצף) ותרבות התא. בידוד ודיסוציאציה של רפידות שומן אפידיליות בוצעו כפי שתואר קודם לכן7,13 עם שינויים קלים המשפרים את הכדאיות של נגמ"שים מבודדים. בקצרה, תאים מנותקים מרפידות שומן אפידימליות מוכתמים בנוגדנים נגד Sca1, סמן הן עבור ASCs והן עבור preadipocytes6,7, וסמני שושלת אחרים (לין): Ter119 (תאי אריתרואיד), CD31 (תאי אנדותל), ו- CD45 (לויקוציטים). Sca1+/Ter119קיימא -/CD31-/CD45-/DAPI- תאים ממוינים לאחר מכן לפי מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS). חשוב לציין, פרוטוקול זה אומת על ידי בידוד וניתוח מוצלחים של Sca1+/ Linקיימא - תאי אב שומן דיווחו במחקר רצף RNA תא יחיד האחרון שזיהה תת-אוכלוסיות הטרוגניות תפקודית בתוך ASCs ו preadipocytes7.

<table><tbody><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>צינור תרבית 13 מ"ל</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>50-809-216</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור חרוטי</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>188 271</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל מבחנה עם מכסה הצמד מסננת תאים</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>70 ומיקרו; מסננת תאים m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Anti-CD31-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-519</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Anti-CD45-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-491</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Anti-SCA1-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-833</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Anti-Ter119-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-908</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-420-500</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-buffered Salt (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>F-12 בינוני</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>מגיב חוסם FcR</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>סרום סוסים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת יודיד פרופידיום</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת תאי אדיפוס אבות מרקמות שומן אפידימליות עכבר

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

השמנת יתר והפרעות מטבוליות כגון סוכרת, מחלות לב וסרטן, כולם קשורים לשיפוץ דרמטי של רקמת השומן. תאים אב שומן תושב רקמה (נגמ"שים) לשחק תפקיד מפתח הומאוסטזיס רקמת שומן והוא יכול לתרום פתולוגיה רקמה. השימוש הגובר בטכנולוגיות ניתוח תאים בודדים – כולל רצף רנ"א חד-תאי ופרוטאומיקה של תא יחיד – משנה את שדה תאי הגזע/אב בכך שהוא מאפשר רזולוציה חסרת תקדים של שינויים בודדים בביטוי התא בהקשר של שינויים באוכלוסייה או ברקמות. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים כדי לנתח רקמת שומן אפידימלית של העכבר, לבודד תאים בודדים שמקורם ברקמת שומן, ולבצע מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) כדי להעשיר עבור Sca1+/CD31קיימא -/CD45-/Ter119- נגמ"שים. פרוטוקולים אלה יאפשרו לחוקרים להכין נגמ"שים באיכות גבוהה המתאימים לניתוחים במורד הזרם כגון רצף RNA של תא יחיד.

בניסוי זה נעשה שימוש בעכברי FVB זכרים בני ארבעה חודשים. לאחר הדרה של פסולת וכפולים באמצעות חלקות FSC / SSC, תאים קיימא (DAPI- אוכלוסייה) היו מגודרים, ואחריו הבחירה של APC+/ FITC- אוכלוסייה (איור 1). שערי DAPI, APC ו- FITC צוירו בהתבסס על הפקד הבלתי מוכתם. אסטרטגיות גטינג מוצגות באיור 1.
לאחר שעה של מיון, איכות הבידוד הוערכה כמותית על ידי ניתוח ציטומטריית זרימה (איורים 2,3). התאים היו מ...

אנו מציגים שיטה פשוטה לבודד תאי אב שומן קיימא מאוד מרפידות שומן אפידיליות עכבר באמצעות מיון תאים המופעלים פלואורסצנטיות.

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

פרוטוקול זה מאפשר לבודד תאי אב שומן באיכות גבוהה מרקמת שומן אפידידימלית של עכבר לניתוח רגיש במורד הזרם. טכניקה זו מניבה תאי אב שומן ברי קיימא ביותר ואושרה במחקר ריצוף RNA של תא בודד שנערך לאחרונה. לאחר המתת חסד של העכבר הזכר, אתר את כרית השומן האפידידימלית ומשוך אותה בעדינות עם מלקחיים קהים כדי לכוון אותה.השתמש במספריים כדי להסיר את האשכים ולדגור את כרית השומן האפידידימלי בחמישה מיליליטר של HBSS בתוספת 3% BSA בצינור חרוטי של 50 מיליליטר למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הצינור ב-150 x גרם למשך שבע דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את כרית השומן האפידידימלית הצפה מהצינור החרוטי וטחון אותה דק במספריים נקיים.הוסף 200 מיליליטר של תמיסת קולגנאז 2% ל-3.8 מיליליטר HBSS בצינור תרבית של 13 מיליליטר. לאחר מכן מוסיפים את הרקמה הטחונה ודוגרים אותה בחממה מסתובבת בחמישה סל"ד למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס. העבירו את כל התכולה לצינור חרוטי של 50 מיליליטר והוסיפו 10 מיליליטר של מדיום נטרול.מערבבים בעדינות על ידי היפוך השפופרת פעמיים-שלוש. הכן צינור חרוטי נוסף של 50 מיליליטר המצויד במסננת תאים של 70 מיקרומטר וסינן את הרקמה המעוכלת לתוך הצינור החדש. העבירו את הזרימה לצינור של 15 מיליליטר וצנטריפוגות ב-350 x גרם ל-10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.הסר בזהירות את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא עם חמישה מיליליטר DPBS. ואז צנטריפוגה את הצינור למשך 10 דקות נוספות. הסר בזהירות את הסופרנטנט והוסף 50 מיקרוליטר של מאגר ציטומטריית זרימה.מערבבים את התאים על ידי פיפטינג בעדינות ושומרים אותם על קרח. הנפח הכולל של התאים במאגר ציטומטריית הזרימה יהיה כ -100 מיקרוליטר. לאחר ערבוב התאים, העבירו 54 מיקרוליטר של תרחיף התאים לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.7 מיליליטר.הוסף שישה מיקרוליטר של מגיב חוסם FCR ופיפטה בעדינות לערבוב. לאחר מכן דגרו את הצינור בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. שמור את שאריות התאים על הקרח לשימוש כבקרה לא מוכתמת.במהלך הדגירה, הכינו קוקטייל נוגדנים על ידי שילוב של 11 מיקרוליטר כל אחד של נוגדנים anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC ו-anti-CD45-FITC בצינור מיקרו-צנטריפוגה. פיפטה בעדינות את התערובת ושמור אותה על קרח מוגן מאור. לאחר הדגירה עם מגיב חוסם FCR, מוסיפים 40 מיקרוליטר מקוקטייל הנוגדנים ומערבבים היטב עם פיפטינג עדין.דגרו על התאים בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות נוספות. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר ציטומטריית זרימה בתוספת מיקרוגרם אחד למיליליטר DAPI לתאי הכתם. מערבבים היטב ומסננים את התאים באמצעות מבחנה של חמישה מיליליטר עם מכסה הצמד מסננת תאים.לאחר מכן שמור את התאים על קרח. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר ציטומטריית זרימה לתאים הלא מוכתמים וערבב על ידי פיפטינג בעדינות. השתמש במבחנה של חמישה מיליליטר עם מכסה הצמדה של מסננת תאים כדי לסנן את התאים ולהשאיר אותם על קרח.העבר את התאים המוכתמים והבקרה הלא מוכתמת למכשיר הניתוח או המיון של FACS. זהה ובודד את האוכלוסייה החיובית ל-APC, שלילית ל-FITC ו-DAPI שלילית באמצעות אסטרטגיות השער המתוארות בכתב היד הטקסטואלי. השתמש בפקדים הלא מוכתמים כדי לסייע בהגדרת פרמטרי שער.לאחר אי הכללת פסולת וכפילים באמצעות חלקות FSC-SSC, תאים ברי קיימא היו מגודרים ואחריהם נבחרה האוכלוסייה החיובית ל-APC ו-FITC שלילית. שערי DAPI, APC ו-FITC שורטטו על סמך הבקרה הלא מוכתמת. התוצאות הבאות מראות בידוד של תאי אב שומני מעכברי FVB זכרים בני ארבעה חודשים.לאחר שעה של מיון, איכות הבידוד הוערכה כמותית על ידי ניתוח ציטומטריית זרימה, שהראה כי התאים שמרו על כדאיות וטוהר גבוהים. ניתן לבצע ניתוח רגיש במורד הזרם לאחר פרוטוקול זה כגון ריצוף RNA של תא בודד, PCR כמותי בזמן אמת וציטומטריית זרימה. זה יאפשר אפיון נוסף של תאי האב השומני.תאי אב שומני הם אוכלוסיות הטרוגניות הדורשות מחקרים נוספים של תאים בודדים. שיטה זו מאפשרת לבודד את התאים המתאימים למחקרי תאים בודדים.

preparation-adipose-progenitor-cells-from-mouse-epididymal-adipose

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs) המסומנים באופן פלואורסצנטי מרקמת השומן של קשת פריאורטית. לאחר הבידוד, NCADSCs מזוהים, ממוינים באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות, ולאחר מכן תרבית על צלחת, קידום התפשטות תאים.

בידוד תאי גזע שמקורם בשומן מרקמת שומן פריאורטית מורין

כאן אנו מדווחים על שיטה לבידוד של אוכלוסיות תאי אב (APC) של אדיפוציטים (APC) מתוך רקמת אדיפוס (Perivascular Adipose Tissue) (PVAT) תוך שימוש במיון תאים מגנטיים המופעל (MCS). שיטה זו מאפשרת בידוד מוגבר של APC לכל גרם של רקמת השומן בהשוואה לפלואורסצנטי המופעל תא מיון (FACS).

הרחבת אדיפוגנזה השראה של אבות אדיפוציטים מ רקמות אדיבוס perivascular מבודדים על ידי מיון מגנטי המופעל תא

הבידול של adipocytes לבן ובייז של רקמת שומן אבות כלי הדם נושא פוטנציאל שיפור חילוף החומרים ההשמנה. נתאר פרוטוקולים של CD34 + CD31 + בידוד תאי אנדותל של שומן אנושי ואת הבאים במבחנה הרחבה, בידול לתוך לבן ובייז adipocytes. הם דנו מספר יישומים במורד הזרם.

בידוד, הרחבה, אינדוקציה Adipogenic CD34 + CD31 + תאי אנדותל של אדם עם פגיעה ו התת-עורית שומן

פרוטוקול זה מתאר את הגישה הטכנית לבידוד תת-אוכלוסיות תאי סטרומה אדיפוגניים ופיברו-דלקתיים ממחסני רקמת שומן לבן תוך בטני (WAT) על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות או הפרדת חרוזים אימונומגנטית.

בידוד תת-אוכלוסיות תאי סטרומה אדיפוגניים ופיברו-דלקתיים ממחסני שומן תוך-בטניים של מורין

דו"ח זה מתאר פרוטוקול לבידוד בו זמנית של preadipocytes חום ולבן ראשוני מעכברים שזה עתה נולדו. תאים מבודדים ניתן לגדל בתרבות המושרה להבדיל לתוך adipocytes לבן וחום בוגר לחלוטין. השיטה מאפשרת אפיון גנטי, מולקולרי ותפקודי של תאי שומן ראשוניים בתרבות.

בידוד ובידול של Preadipocytes לבן וחום ראשוני מעכברים שזה עתה נולדו

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של קדם-אדיפוציטים של עכברים משומן תת-עורי, התמיינותם לאדיפוציטים בוגרים והשראת תנגודת לאינסולין. פעולת האינסולין מוערכת על ידי זרחון / הפעלה של חברי מסלול איתות האינסולין דרך כתם מערבי. שיטה זו מאפשרת קביעה ישירה של תנגודת/רגישות לאינסולין באדיפוציטים ראשוניים.

אדיפוציטים מובחנים של עכברים בתרבית ראשונית: מודל של תנגודת לאינסולין

פרדיפוציטים מבודדים מהמקטע הווסקולרי של רקמת השומן החום הבין-סקפולרי מעכברים שזה עתה נולדו ומתמיינים לתאים שצוברים טיפות שומנים, מבטאים סמנים מולקולריים ומראים את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית של אדיפוציטים חומים בוגרים. תאים אלה מנותחים עוד יותר על ידי immunofluorescence ומיקרוסקופ אלקטרונים הולכה.

התמיינות והדמיה של אדיפוציטים חומים מהמקטע הווסקולרי של רקמת השומן הבין-סקפולרית מעכברים שזה עתה נולדו

רקמת השומן היא מקור מצוין לתאי גזע מזנכימליים. כאן, אנו מביאים את המיצוי, הטיפוח והאפיון שלב אחר שלב של תאי גזע שמקורם ברקמת שומן (ADSCs) מרקמת שומן אפידידימלית של עכברים שוויצרים.

בידוד, הרחבה חוץ גופית ואפיון תאי גזע מזנכימליים מרקמת שומן אפידידימלית של עכבר

הגודל והשבריריות של אדיפוציטים בוגרים הגבילו את הטכניקות והכלים הזמינים למחקר ולבידוד שלהם. כאן, מתואר פרוטוקול לבידוד של אדיפוציטים עכברים בוגרים, שניתן להתאים בקלות למחסני שומן שונים ולדיאטות עכברים.

בידוד ותרבות של אדיפוציטים עכבריים ראשוניים מעכברים רזים והשמנים

תאי גזע pluripotent מושרה קווים מניבים (iPSC) מייצרים שורות של פוטנציאל ההתפתחותי שונים גם כאשר הם עוברים בדיקות תקן לpluripotency. כאן אנו מתארים פרוטוקול לייצר עכברים נגזרים לחלוטין מiPSCs, המגדיר את קווי iPSC כבעל pluripotency...

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

למד לבודד תאי אדיפוס אבות מרקמת שומן אפידימלית בעכבר באמצעות מיון תאים פלואורסצנטי. השיטה מספקת תאים בעלי חיוניות גבוהה לניתוח RNA ברמת תא בודד ומחקרי ביולוגיה תאית.

הכנת תאי אדיפוס אבות מרקמות שומן אפידימליות עכבר

גלה סרטונים נוספים