מדידה של הפצות לחות תלת-ממדיות בתאים חיים באמצעות הדמיה וניתוח FRET היפרספקטרליים
27 באוקטובר 2020
בשל יחס אות לרעש נמוך (SNR) של חיישנים מבוססי העברת אנרגיית תהודה של Fӧrster (FRET), מדידת אותות המחנה הייתה מאתגרת, במיוחד בשלושה ממדים מרחביים. כאן, אנו מתארים מתודולוגיית דימות וניתוח FRET היפרספקטרלית המאפשרת מדידה של התפלגות המחנה בשלושה ממדים מרחביים.
פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מספק שיטה למדידה והדמיה של אותות FRET או AMP מחזוריים בשלושה ממדים מרחביים בתאים בודדים. התפלגויות AMP מחזוריות עשויות להתרחש באופן צירי בנוסף לרוחב, וחשוב לרכוש נתוני תמונת AMP מחזוריים של FRET בתלת מימד כדי לדגום את ההתפלגויות הללו. ביום ההדמיה, טירודס חם חוצץ ל-37 מעלות צלזיוס באמבט מים ומרכיב תלוש כיסוי שיושב עם התאים המעניינים לתוך תא תא.
אבטח את החלק העליון של החדר עם אטם הרכבה כדי למנוע דליפה והשתמש במגב משימות עדין כדי להסיר עודפי תאים בינוניים או דבקים מתחתית החלקת הכיסוי. הוסף 800 מיקרוליטר של חיץ עובד וארבעה מיקרוליטרים של תווית גרעינית של חמישה מילי-מולרית לתא התא ונדנד בעדינות את החדר למשך חמש עד 10 שניות. לאחר מכן מכסים את תא התא בנייר אלומיניום למשך 10 דקות דגירה בטמפרטורת החדר.
כדי לדמות את התאים, בחר את מטרת הטבילה במים פי 60 במיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בגלאי ספקטרלי והוסף טיפת מים למטרה. הנח את תא התא הטעון על המיקרוסקופtagה וכוון את כפתור המסנן כדי לבחור את ערכת המסננים המתאימה. בחר את מצב השדה הרחב הקרינה והשתמש בעיניות כדי לבחור שדה ראייה המכיל תאים המבטאים את חיישן ה-AMP המחזורי של FRET.
פתח את תוכנת ההדמיה, בחר את המצב הקונפוקלי ובטל את נעילת לחצן נעילת הלייזר. פתח את תפריט ההגדרות A1. סמן את התיבות המתאימות לקווי הלייזר 405 ו-561 ננומטר והגדר את הזיהויים הספקטרליים הללו ל-SD, את הרזולוציה ל-10 ואת הערוצים ל-32.
בחר את ערכי אורך הגל של ההתחלה והסיום כדי להגדיר את טווח אורכי הגל. פתח את תפריט הגדרות A1 כדי לבחור את סמל הדילוג על binning. בחר את התיבה מספר 15 ולחץ על אישור. הגדר את עוצמות הלייזר לשמונה אחוזים עבור לייזר 405 ננומטר ולשני אחוזים עבור לייזר 561 ננומטר.
הגדר את הגלאי ל-149 ואת רדיוס החור ל-2.4 יחידות דיסק אוירי. הגדר את מהירות הסריקה ל-25 פריימים ספקטרליים לשנייה, ובחר את כיוון הסריקה החד-כיווני. הגדר את הספירה לארבע ואת גודל הסריקה ל-1024 עד 1024.
להגדרת הפרמטרים של רכישת z-stack, לחצו על 'תצוגה', 'בקרת רכישה' ו'רכישת דחיסות נייטרלית', והזינו את יעד הקובץ ואת שם הקובץ בחלון הנפתח לשמירת קובץ הדחיסות הנייטרלית. לחץ על התיבה z-series ולחץ על Live בחלון הגדרות A1 Plus כדי לפתוח חלון צפייה חי. כוונן את כפתור המיקוד כדי להתמקד בתאים תוך כדי התבוננות בחלון התצוגה המקדימה.
כוונן את כפתור המיקוד במיקרוסקופ כדי לבחור את החלק העליון של התא ולחץ למעלה בחלון רכישת ND כדי להגדיר את המיקום הנוכחי כחלק העליון. כוונן את כפתור המיקוד במיקרוסקופ כדי לבחור את החלק התחתון של התא ולחץ על תחתון כדי להגדיר את המיקום הנוכחי כתחתית. הזן מיקרומטר אחד עבור גודל הצעד.
בחר למעלה למטה לכיוון סריקת z, ולחץ על הפעל כדי להשיג z-stack. לאחר השלמת רכישת מחסנית z, השתמש בפיפטה כדי להוסיף בעדינות את המגיב המעניין לתא מבלי להפריע לתאים. לאחר 10 דקות, שנה את שם הקובץ וקבל תמונת z-stack שנייה.
לאחר ההדמיה, צור תיקיות חדשות עם אותם שמות קבצים כמו תמונות ה-z-stack הספקטרליות ופתח את קובץ התמונה הספקטרלי המעניין. לחץ על File, Import/Export ו-Export ND Document. בחלון המוקפץ, בחר את התיקיה החדשה שנוצרה, TIFF עבור סוג הקובץ, תמונת מונו עבור כל ערוץ ושמור על עומק סיביות.
לחץ על ייצוא כדי לייצא את הקבצים הבודדים לתיקייה ולפתוח את תוכנת ביטול הערבוב הספקטרלי הליניארי. פתח את הניתוק הליניארי. m ולחץ על הפעל.
דפדף ובחר את התיקייה המכילה את רצף קבצי ה-TIFF המיוצא ולחץ על אישור כדי לפתוח את חלון אורך הגל ופרוסת z. העתק את שם הקובץ של הקובץ הראשון ללא פרוסת z ומספר הערוץ מהתיקייה, והדבק אותו בשלב הראשון של התיבה Enter של שם התמונה, הזן את מספר הערוצים בתיבה הזן את מספר רצועות אורכי הגל ואת מספר פרוסות z בתיבה הזן את מספר פרוסות Z ולחץ על OK. לאחר מכן, בחלון המוקפץ, דפדף ובחר את אורך הגל. mat ולחצו על Open.
דפדף ובחר את הקובץ Library. mat בחלון המוקפץ החדש ולחץ שוב על Open כדי להתחיל את ביטול הערבוב של הפרוסה. כדי לחשב את יעילות ה- FRET, פתח את multiFRRCF.
m תכנות והזן את מספר הניסויים הניסיוניים לניתוח בתיבה כמה תיקיות לפרוס מחדש. לחץ על OK. דפדף כדי לבחור את התיקיות הלא מעורבבות ולחץ שוב על אישור. בחלון המוקפץ החדש, הגדר את גורם קנה המידה ל-12.4, את הסף ל-56, את תדר X, Y ו-Z לחמש, חמש ואחד בהתאמה, ואת אלגוריתם ההחלקה לגאוס.
לאחר מכן לחץ על הפעל כדי לבצע את מדידות ה- FRET והחיתוך מחדש. כדי למפות את יעילות ה-FRET לרמות AMP מחזוריות, פתח את Mapping_FRET. Efficiency_to_cAMP_concentration. m ולחץ על הפעל.
נווט לתמונת FRET הראשונה בגווני אפור ובחר בה ולחץ על OK. לאחר מכן פתח את תמונות ה-AMP המחזוריות של FRET כדי לבדוק את התפלגות אותות ה-AMP המחזוריים בתלת מימד. בתמונות אלה ניתן לצפות בתצוגות תלת מימדיות של נתוני תמונה היפרספקטרלית גולמית בצבע כוזב שנרכשו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בנקודת ההתחלה ו-10 דקות לאחר הטיפול בפורסקולין. בניתוח זה, פלואורופור מקבל הושמד לחלוטין בתמונה ואפשר להשיג חתימות ספקטרליות של התורם והמקבל עם סטויכיומטריה אחד לאחד.
תאים לא טרנספטנטיים המסומנים בצבע גרעיני שימשו להשגת הספקטרום הטהור של הצבע פלואורופור. שילוב הספקטרום של התורם, המקבל והפלואורופורים של הצבע הגרעיני מאפשר יצירת ספרייה תלת-רכיבית. כאן ניתן לראות את המקורות של שלוש חתימות ספקטרליות רקע.
למרות שאותות אלה מופצים בצורה לא אחידה בתוך הדגימה ולא ניתן פשוט להחסיר אותם, הוספת החתימות הספקטרליות של אותות אלה לספרייה הספקטרלית ושימוש בפירוק ליניארי כדי להפריד את האותות מספקת גישה להסרת האותות המבלבלים הללו מאותות התורם והמקבל לפני חישוב יעילות ה-FRET שלהם. לאחר מכן ניתן להשתמש בספרייה הספקטרלית של ששת הרכיבים כדי לבצע פירוק ספקטרלי ליניארי עבור כל פרוסה בתמונה הצירית. כאן, ניתן לראות את השינויים ביעילות ה-FRET וברמות ה-AMP המחזוריות בפרוסות מישור XY שונות, מה שמאפשר השוואה בין תנאי הבסיס לתנאים 10 דקות לאחר הטיפול בפורסקולין.
טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי לכמת את יעילות ה-FRET של מדווחים אחרים בתלת מימד הן בתאים והן ברקמות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה עוסק באתגרים הכרוכים במדידת אותות cAMP בשלושה ממדים מרחביים באמצעות חיישנים המבוססים על העברת אנרגיה בתהודה של פירסטר (FRET). הוא מציג מתודולוגיית דימוי FRET היפר-ספקטרלית חדשנית המאפשרת ויזואליזציה ומדידה של התפלגות ה-cAMP בתוך תאים בודדים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המחקר
- סיגנלינג של cAMP מחזורי
- טכנולוגיית דימות FRET
- דינמיקה תאית בתלת-ממדי
רקע
- יחס אות-רעש (SNR) נמוך בחסני FRET מסורתיים
- חשיבותן של מדידות cAMP בתלת-ממד
- יישומים במסלולי איתות תאיים
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דימוי היפר-ספקטרלי לניתוח FRET
- מיקרוסקופיה קונפוקלית לדימוי
- טכניקות של הפרדה ספקטרלית ליניארית (Linear spectral unmixing)
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של התפלגות cAMP בשלושה ממדים
- ויזואליזציה של תגובות תאיות לטיפול בפורסקולין (forskolin)
- הדגמת התועלת של הפרדה לינארית (linear unmixing) להפרדת אותות
מסקנות
- מתודולוגיה זו מספקת מסגרת איתנה לחקר דינמיקת cAMP ברזולוציה גבוהה.
- היא משפרת את ההבנה של מסלולי איתות בביולוגיה תאית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיפוי מרחבי מדויק של דינמיקת השליחים השניים הוא קריטי להפחתת סיכונים באישור המטרה במסלולי GPCR ואדניליל ציקלאז. גישת FRET היפר-ספקטרלית זו מאפשרת רזולוציה תלת-ממדית של אותות cAMP, ובכך מפחיתה עמימות מכניסטית במחקרי מדוריזציה תת-תאית. השיטה תומכת בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור דפوسی cAMP מרחביים לתגובות תאיות תפקודיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות פיתרון של מדוררי cAMP בשלושה ממדים מרחביים.
- ערך תפעולי: מספק תיקוף של מטרות פונקציונליות באמצעות ויזואליזציה של דפוסי איתות ספציפיים למסלול בתאים חיים.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי קורלציה בין התפלגויות מרחביות של cAMP לבין תוצאות פנוטיפיות בעקבות הפרעה פרמקולוגית.
סינון ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מייצר קריאות כמותיות של יעילות FRET ברזולוציה מרחבית, המתאימות לפורמטים של סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening).
- שחזוריות: משתמש בפירוק ספקטרלי ליניארי (linear spectral unmixing) כדי למזער אוטופלורסצנציה וסמיכות ספקטרלית (spectral crosstalk), ובכך משפר את מהימנות האות בין חזרות שונות.
- מדרגיות: תואם להתאמה לפלטות עם מספר בארות לצורך סריקה של השפעות תרכובות על דינמיקת cAMP תת-תאית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: רלוונטי לתאי אנדותל מיקרווסקולריים ריאתיים, התומך במחקרים תרגומיים של מסלולי איתות כלי דם.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מבהיר האם שינויים נצפים ב-cAMP נובעים ממודולציה אמיתית של המסלול לעומת ארטיפקטים של דימוי הנובעים מחפיפה ספקטרלית.
- המשכיות פרה-קלינית: מאפשר מעקב אורך של דינמיקת cAMP משלב הגילוי ועד לאישור תפקודי במערכות הרלוונטיות למחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולות המובילות (lead optimization), על ידי אספקת קריאות כמותיות עם רזולוציה מרחבית של פעילות השליחים השניים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי מיפוי דינמיקת cAMP בתגובה לאגוניסטים של GPCR או למודולטורים של אדניליל ציקלאז.
- סריקה: מספק נתוני cAMP תלת-ממדיים המוכנים לבדיקה, עם הפחתה של תוצאות חיוביות שגויות הנובעות מהפרעה ספקטרלית.
- אנליזה: מפיק מפות של יעילות FRET וריכוזי cAMP המאפשרות השוואה בין תנאי טיפול ושיבושים גנטיים.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית באמצעות שימוש בתאי אנדותל ראשוניים והתאמה למודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת ליבה של דימיון הניתנת לשימוש חוזר לצורך חקר סיגנלינג מרחבי במערכות מרובות של שליחים שניים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית באיתות cAMP על ידי ביסוס ההתפלגויות האקסיאליות והלטרליות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של מדידות FRET באמצעות הפרדה ספקטרלית (unmixing) המבוססת על ספריית ספקטרום ופרמטרי רכישה הניתנים לשחזור.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות של go/no-go באמצעות אספקת נתוני מעורבות מטרה (target engagement) בהקשר מרחבי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות מותאם סיכון, בהתבסס על נאמנות האיתות התת-תאית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימות היפר-ספקטרלי, הפרדה ספקטרלית (spectral unmixing) ותיקוף של חיישני FRET ביולוגיים.
- תלוי במיקרוסקופיה קונפוקלית עם גלאי ספקטרלי ויכולת זיהוי של 32 ערוצים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית ליצירת ספרייה ספקטרלית ולהגדרת פרמטרי הפרדה.
- התאמה לסוגי תאים אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של צפיפות הסימון ושל פרמטרי ה-z-stack.
- מגבלות מעשיות כוללות סיכוני פוטובליצ'ינג (הבהרה פוטוכימית) במהלך רכישת z-stack ממושכת ודרישות חישוביות לעיבוד ספקטרלי.
