הכנת אינוקולום מועשר בנגיף לזיהום אוראלי של דבורי דבש (Apis mellifera)

הפרוטוקול שלנו מדגים כיצד לייצר חלקיקי נגיף דבורת דבש בהמוניהם לשימוש במבחנים ביולוגיים מבוקרים בעלי תפוקה גבוהה לבדיקה מהירה של יעילות הטיפול הנגיפי. הבדיקה משתמשת בגלמי דבורים קלים לתרבית במקום בתרבית תאים, מה שמפחית את העבודה של השגת נבדקים בניסוי. לאחר מכן ניתן להשתמש בנגיף כדי לייצר עקומות תמותה צפויות ומבחנים ביולוגיים הניתנים לחזרה.

יש עניין רב בהבנת האופן שבו מה שמכונה נגיפי דבורת הדבש משפיעים על טווח מארחים גדול יותר. ניתן לשייך את טכניקת ייצור הנגיפים הזו למערכות מאביקים אחרות כדי לבדוק את ההדבקה. למיצוי המוני של דבורים על ידי הסרה עצמית של זחלים, כלאו מלכת דבורי דבש על מסגרת לנגסטרות' ריקה וממושכת והחזירו אותה למושבה שלה.

לאחר שאפשרתם למלכה להטיל ביצים על המסגרת במשך 24 שעות, בדקו את המסגרת כדי לוודא שרוב תאי המסרק מכילים ביצים שזה עתה הוטלו ושחררו את המלכה. בדיוק 192 שעות לאחר כליאת המלכה, הסר את המסגרת מהמושבה והבריש את כל הדבורים הבוגרות. עם החזרה למעבדה, הניחו את המסגרת באינקובטור המוגדר לתנאים הפנימיים של כוורת ונקו היטב מיכלים באותו גובה ורוחב של המסגרת המלאה בזחלים עם סבון ומים רציפים, אקונומיקה ושטיפות אתנול.

מרפדים את תחתית המיכלים בכמה שכבות של מגבות נייר ומוסיפים כמה שכבות חופפות של חומר סופג דק יותר. כאשר המכולות מוכנות, הנח את המסגרת על זחלי המוקד של המיכל כלפי מטה והשתמש בחתיכת נייר אלומיניום אוהל כדי לכסות את המיכל והמסגרת. לאחר הדגירה של הלילה, הרם בזהירות מגבונים בודדים מהשכבה העליונה של כל מיכל כדי לאפשר לשפוך את הזחלים בעדינות על מגש העברה.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים קהים ורכים כדי לפזר את הזחלים על פני המגשים מבלי לגעת והנח את המגש המכוסה בנייר כסף לתוך החממה עד שהזחלים מתגלמים ומתבגרים לשלב העיניים הרחבות. להזרקת וירוס של הגלמים, ערבבו את חלקיקי הנגיף המעניינים בריכוז המתאים ב-PBS סטרילי בצינור של 15 מיליליטר והצמידו מכשיר מזרק למולטי-פיפטה ידנית. כדי לבדוק את יעילות המזרק, העמיסו על המזרק 100 מיקרוליטר מים והוציאו את המים במינונים של מיקרוליטר אחד.

אם ההזרקות מדויקות, העמיסו 100 מיקרוליטר מתמיסת חלקיקי הנגיף לתוך המזרק ותפסו בעדינות גולם אחד לאורך בית החזה, תוך הפעלת לחץ מספיק כדי לדחוף נוזלים פנימיים לתוך הבטן כדי להפוך את חלוקות הטרגיט לברורות יותר. ייצוב הזרוע המחזיקה את המזרק כנגד ספסל המעבדה לתמיכה, הכנס את המחט בדיוק לתוך הציפורן בין הטרגיט השלישי לרביעי בבטן והזריק מיקרוליטר אחד של תמיסת הנגיף. לאחר שכל הגלמים הוזרקו, כסו מחדש את המגש בנייר כסף לפני החזרת הגלמים לאינקובטור למשך שלושה עד חמישה ימים נוספים.

בתום הדגירה, אסוף את הגלמים לפי מקור המושבה בצינורות צנטריפוגה חרוטיים בודדים של 50 מיליליטר ומערבולת כדי להומוגניזציה של התוכן. כדי לבצע בדיקה ביולוגית של הזנה ויראלית, חבר את חורי ההזנה של כלובים נקיים עם צינור צנטריפוגה בגודל מתאים ומלא חלקית צינורות צנטריפוגה של 15 מיליליטר בתמיסת הזנה טרייה. לאחר מכן, הפוך את הצינורות והשתמש בנעץ אגודל כדי לתקוע חור אחד או שניים סביב הקצוות.

לאחר מכן, צחצחו את כל הדבורים החדשות שהגיחו מקופסאות הגיחה שלהן לכלי איסוף המצופה קלות סביב הקצוות בשמן צמחי וערבבו בעדינות את הדבורים ביד. העבירו 35 דבורים בודדות לכוס אחת משומנת והניחו את תכולת הכוס בכלוב אקרילי. כדי להכין את חיסון הנגיף, ערבבו כמות מתאימה של חלקיקי נגיף מופשרים ומרוכזים עם תמיסת סוכרוז 30% במיכל סטרילי אחד לכל סוג טיפול והוסיפו 600 מיקרוליטר של תמיסת וירוס על מגשי חיסון בודדים.

לאחר מכן, הכניסו בזהירות כל מגש חיסון לכלובים המתאימים להם, והקפידו לא לשחרר בטעות דבורים. לאחר שכל החיסון נצרך, החלף את צינורות הצנטריפוגה מחור ההזנה העליון בצינורות ההזנה המוכנים ורשום את התמותה בתוך כל כלוב במרווחים של 12 שעות במשך 72 השעות הראשונות של הניסוי וכל 24 שעות לאחר מכן. כדי להסיר דבורים מתות, החליקו את דלת הכלוב מספיק רחוק כדי לאפשר הכנסת זוג מלקחיים מעוקרים באלכוהול כדי להוציא את הדבורים המתות.

בהתאם לתכנון הניסוי, הנח דגימות חיות מכל כלוב לתוך צינורות צנטריפוגות בודדים על קרח יבש כדי לאפשר דגימה למדידות טיטר ויראלי. במאמץ מייצג זה של קצירת נגיף גדול יותר, כל גולם הוזרק תחילה בחיסון נגד נגיף השיתוק החריף הישראלי בכ-95%. למרות ש-10 מתוך 16 דגימות המושבה המעורבות במיצויים אלה הכילו נגיף טהור מאוד, דגימות אחרות השתנו בשיעור הנגיף שלהן, כאשר חלקן אפילו נשלטו על ידי נגיפים אחרים, כגון וירוס כנף מעוות.

כפי שמוצג בטבלה, ערכי מחזור סף יכולים לשמש כמנבא של פרופורציה. השוואת עקומות תגובת המינון-הישרדות של דבורי דבש שניזונו מאותם חלקיקי נגיף במהלך שנתיים שונות מגלה כי למרות פרמטרי בדיקה זהים, הניסויים שנערכו בשנים 2018 ו-2019 הניבו תגובות הישרדות שונות באופן ניכר בכל קבוצות הטיפול מלבד קבוצת הביקורת, שלא קיבלו נגיף בחיסון הסוכרוז שלהן. תגובות דבורי הדבש לזיהום נגיפי יכולות להשתנות מאוד בהתאם לעונה, לכוורת או אפילו לחלוקת החיסון בתוך כלובים בודדים.

לכן, גדלי מדגם גדולים הם קריטיים לאישור השפעות הטיפול. באמצעות מלאי של חלקיקי נגיף, ניתן להרחיב את הניסוי כך שיכלול זריקות של עובדי דבורי דבש בוגרים, מלכות או מזל"טים, או למינים אחרים של מאביקים כדי להעריך את טווח המארח. ניתן להשתמש במאגרים זיהומיים של וירוס כדי לבדוק כיצד הזיהום מקיים אינטראקציה עם גורמים אחרים, כמו תזונה, חשיפה לכימיקלים או סביבות חברתיות.