בידוד, שגשוג והתמיינות של תאי גזע שמקורם בשומן מקוק רזוס

בידוד ושגשוג של תאי גזע שמקורם בשומן מייצרים מספר רב של תאי גזע שיכולים לשמש למספר יישומים במורד הזרם וטכניקות ניסיוניות. שימוש עיקרי המיועד לאדיפוציטים מובחנים בפרוטוקול זה הוא מבחנים מטבוליים כגון ספיגת גלוקוז מגורה באינסולין, ליפוגנזה וליפוליזה מגורה. כדי להתחיל, ליצור סביבת עבודה סטרילית על ידי חיטוי מכסה המנוע biosafety וכל הכלים.

פיפטה של כ-10 מיליליטר מתוך חמישה חיץ PBS לתוך ארבע מנות של תרבית תאים בקוטר 100 מילימטר. מעבירים דגימת שומן של 50 גרם לתוך אחת הכלים ושוטפים אותה ארבע פעמים על ידי העברתה ברצף על פני הכלים האחרים המכילים חמישה PBS. לאחר מכן מעבירים את רקמת השומן השטופה לצלחת תרבית נקייה של 100 מילימטר וטוחנים אותה ביסודיות באמצעות מספריים או מלקחיים סטריליים.

מעבירים מקטע של סנטימטר אחד עד שלושה סנטימטרים של הרקמה הטחונה לצינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל 13 מיליליטר של מאגר קולגן. שטפו את הרקמה הנותרת מצלחת התרבית עם שני מיליליטר של מאגר קולגן כדי להבטיח נפח כולל של 15 מיליליטר. מערבבים היטב את הדגימה באמצעות פיפטה סרולוגית של 25 מיליליטר ודוגרים את הצינור ב 37 מעלות צלזיוס על נדנדה במשך 30 עד 60 דקות.

על מנת לנטרל את פעילות האנזים, הוסף 10 מיליליטר של מדיום גדילה ADSC לתוך הצינור לאחר הדגירה וערבב אותו היטב עם פיפטה כדי להפריד כל אגרגטים רקמות. מעבירים את החלק הנוזלי לצינור חרוטי סטרילי חדש של 50 מיליליטר, ומשאירים את הרקמה המוצקה. לשטוף את הרקמה שלוש פעמים באמצעות שבעה מיליליטר של שני PBS ולהעביר את הנוזל לצינור החדש.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור ב 500 פעמים G במשך חמש דקות בזהירות להסיר בזהירות supernatant ככל האפשר מבלי להפריע את הכדור. יש להשעות את הכדור במיליליטר אחד של 1X תאי דם אדומים או חיץ ליזיס RBC ולדגור אותו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים על ידי הוספת חמישה מיליליטר של מדיום צמיחה ADSC לצינור צנטריפוגה כדי להסיר את supernatant.

לאחר השטיפה האחרונה, יש למרוח את הכדור בשני מיליליטר של מדיום גדילה ADSC ולסנן אותו דרך מסננת תאים של 70 מיקרון לתוך צינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר. שוטפים את המסננת בשני מיליליטר נוספים של המדיום ומעבירים ארבעה מיליליטר מהתרחיף לצלחת תרבית סטרילית של 100 מיליליטר. שטפו את הצינור החרוטי פעמיים עם שלושה מיליליטר בינוני כדי לאסוף נפח כולל של 10 מיליליטר בצלחת התרבית.

התבונן בתאים שנאספו תחת מיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 10 כדי לבדוק אם יש תאים צפים. לדגור על התאים במשך 24 שעות בחממה של פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו-100% לחות יחסית. כדי להבטיח סטריליות של המדיה התרבותית, כלול צלחת עם מדיה בלבד.

לאחר 24 שעות, צפו בתאים שמתחת למיקרוסקופ ההפוך כדי לבדוק את היצמדות התאים. מוציאים ומחליפים את המדיום במדיום חם כל 48 שעות עד שהתאים נפגשים ב-80% עד 90%. לצורך התפשטות, הסר את מדיום הצמיחה מתאי ה- ADSC המפוחדים ושטוף אותם פעמיים עם שני מיליליטר של PBS בטמפרטורת החדר סטרילית.

שאפו את ה- PBS והוסיפו שני מיליליטרים של 0.25% טריפסין EDTA לכל צלחת תרבית, המכסים את כל שטח הפנים של הצלחת. יש לדגור על הצלחת במשך שבע דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני, ולאחר מכן לעקור באופן מכני את התאים הטריפסינים על ידי פיפטינג כוחני. מוסיפים שני מיליליטר של מדיום צמיחה ADSC ומערבבים בעדינות את התאים.

מעבירים את התאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר, ושוטפים את הצלחת בשני מיליליטר נוספים של מדיום כדי להבטיח התאוששות מקסימלית של התאים מהצלחת. לאחר מכן, צנטריפוגה של הצינור ב 500 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ו decant את supernatant כדי לקבל את כדור התא. יש להשעות את כדור התא בחמישה עד שישה מיליליטרים של מדיום גדילה ADSC למיליון תאים.

סופרים את התאים באמצעות המוציטומטר ולוחים אותם כמתואר בכתב היד של הטקסט. ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 80 עד 90%, שאפו את מדיום הצמיחה ושטפו את התאים ב-PBS סטרילי בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הוסיפו 10 מיליליטר של מדיום התמיינות ADSC. החלף את המדיום כל שלושה ימים במשך כ-14 עד 21 ימים.

התבונן בתאים לנוכחות טיפות שומנים מתחת למיקרוסקופ ההפוך בהגדלה של פי 40. אדיפוציטים בוגרים נצפים בדרך כלל לאחר 14 יום. ביום הציפוי, ה- ADSCs לא היו דבקים וצפים בתרבות.

התאים הפכו ל-80% לאחר 72 שעות והיו מוכנים להתמיינות אדיפוציטים. לאחר 14 ימים של התמיינות ADSC, אדיפוציטים בוגרים הפגינו מאפיינים אדיפוגניים חזקים שנצפו תחת הגדלה של 40X. ביום ה-14, התאים היו מוכתמים וקבועים בשמן אדום O ו-BODIPY להדמיית טיפות שומנים.

ניתן היה לראות אדיפוציטים מובחנים תחת הגדלה של פי 20. כאשר מנסים פרוטוקול זה, חשוב לזכור כי סביבת עבודה סטרילית היא קריטית לבידוד בריא, התרחבות נאותה והתמיינות יעילה של תאי גזע שמקורם בשומן. לאחר הליך זה, תאים אלה יכולים לשמש למספר בדיקות מטבוליות כגון ספיגת גלוקוז, ליפוגנזה וליפוליזה המהווה מוקד מרכזי של המחקר שלנו.

טכניקה זו מאפשרת לחקור כיצד אלכוהול כרוני ו- SIV משפיעים על היכולת המטבולית של אדיפוציטים.