דגימה קריוגנית נטענת לתוך זווית קסם ספינינג ספקטרומטר תהודה מגנטית גרעינית המשמרת את הכדאיות התאית

הרגישות של ספקטרוסקופיה MAS NMR בסיוע DNP מאפשרת לנו לאפיין חלבונים בתוך תאים שלמים בריכוז האנדוגני שלהם. יישום זה דורש טיפול זהיר במדגם. חלק מהמורפולוגיות נשמרות ותאים ברי קיימא כאשר הם מועברים באופן קריוגני לספקטרומטר באמצעות פרוטוקול זה.

הכנסת הרוטור הקר עלולה לגרום להצטברות לחות וקרח, מה שיכול למנוע מכנית את סיבוב הדגימה. הדגמה זו תנחה ניסויים לביצוע ההעברה הקריוגנית בביטחון. כדי להתחיל, הניחו כרית העשויה מפיסת טישו או מגבת נייר מתחת למכסה ובתחתית הבקבוקון הקריוגני.

הנח את רוטור הספיר בגודל 3.2 מילימטר לתוך הבקבוקון הקריוגני המרופד בנייר הטישו, כאשר הקצה המסומן פונה לתחתית הבקבוקון. הקפאה איטית של הרוטור על ידי הנחת הבקבוקון למיכל קירור בקצב מבוקר והנח את המיכל במקפיא של 80 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות לפחות. העבירו את הבקבוקון הקריוגני המכיל את הרוטור הקפוא לבקבוק ואקום קטן מלא בחנקן נוזלי.

השתמש בבקבוק הוואקום כדי לשאת את הדגימה למתקן הספקטרומטר. מלאו בקבוק ואקום קצף פה רחב יבש, מבודד תרמית עם 500 מיליליטר לליטר אחד של חנקן נוזלי. קח את הבקבוקון הקריוגני מבקבוק ההעברה והחזק אותו ממש מעל פני החנקן הנוזלי כדי להגן עליו מפני האטמוספרה.

תוך כדי החזקת הבקבוקון הקריוגני כשפיו של הבקבוקון פונה מעט כלפי מטה, פתח את המכסה ותן לרוטור להחליק לתוך אמבט החנקן הנוזלי. מצננים מראש צינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר על ידי טבילתו בחנקן הנוזלי. מתחת לפני השטח של אמבט החנקן הנוזלי, השתמש בפינצטה כדי להעביר את הרוטור לצינור המיקרו-צנטריפוגה כאשר קצה הכונן פונה לתחתית הצינור והסימונים פונים לפתח.

השתמש בפינצטה כדי להחזיק את הצינור המכיל את הרוטור מתחת לחנקן נוזלי בצווארו. בעזרת זוג פינצטה שני, החזק את לוכד דגימות ה-NMR מעל פני החנקן הנוזלי הנוטה בזווית חדה ביחס לצינור המיקרו-צנטריפוגה. כדי להעביר את הרוטור מלוכד הדגימות של NMR לספקטרומטר NMR, הנח את ארון הקריו במצב פליטה על ידי לחיצה על הוצאה.

הכנס את הקצה הפתוח של לוכד דגימות ה-NMR לתוך צינור המיקרו-צנטריפוגה כשהוא עדיין מתחת לפני השטח של החנקן הנוזלי. הרם גם את צינור המיקרו-צנטריפוגה וגם את לוכד דגימות ה-NMR כדי לאפשר לרוטור ליפול לתוך לוכד הדגימות. נער את לוכד הדגימות ואת הצינור אם הרוטור נתקע על השפה.

השאר את צינור המיקרו-צנטריפוגה הריק על גבי לוכד הדגימות של NMR כדי להגן על הרוטור מפני אוויר. הסר את לוכד הדגימות הריק השני מהגשושית והנח אותו על הרצפה. העבר את לוכד הדגימה של NMR המכיל את הרוטור ליד השנייה.

לאחר מכן הסר את צינור המיקרו-צנטריפוגה והכנס אותו מיד לתוך הגשושית. סמן לאדם המפעיל את ארון הקריו ללחוץ, עצור, הוצא והכניס. סובב את הדגימה לקצב הסיבוב הרצוי על ידי התאמת המיסב והנעת לחץ הזרימה.

שופכים 500 מיליליטר לליטר חנקן נוזלי לבקבוק ואקום קצף עם פה רחב ומניחים את האמבטיה מתחת לספקטרומטר. טבלו את הבקבוקון הקריוגני הריק המכיל פיסת נייר טישו באמבט החנקן הנוזלי. הפחת את קצב הסיבוב לאפס קילו-הרץ על ידי הגברת זרימת הגז המניע והמיסב, והוצא את הרוטור על ידי מעבר למצב פליטה.

תוך שמירה על מצב הפליטה, הסר את לוכד הדגימה מהגשושית והפיל את הרוטור ישירות לתוך בקבוק הקצף הרחב המכיל חנקן נוזלי. בעזרת פינצטה מקוררת מראש, העבירו את הרוטור לבקבוקון הקריוגני המקורר מראש מתחת לפני השטח של החנקן הנוזלי. מצננים מראש את מכסה הבקבוקון הקריוגני על ידי טבילתו בחנקן נוזלי.

הסר את הבקבוקון המכיל את הרוטור והחנקן הנוזלי מהאמבטיה, וכסה את הצינור עם המכסה המצונן. טבלו מחדש את הבקבוקון הקריוגני בחנקן נוזלי. ניתן להעביר את הדגימה לאחסון חנקן נוזלי לטווח ארוך יותר או לפרוק אותה מיד להמשך ניתוח.

החדרה קריוגנית של דגימות קפואות מראש של תאי יונקים לספקטרומטר NMR תומכת בכדאיות לאורך כל ניסוי ה-NMR. באמצעות פרוטוקול זה, החדירות הכחולה של תאי יונקים לאחר MAS NMR דומה לזו של תאים שאינם חשופים לשינוי טמפרטורה כלשהו. אם התאים קפואים לאט, ואז מחוממים לטמפרטורת החדר לפני ההחדרה, הכדאיות התאית יורדת לפחות מ-10%בינתיים, החדרה קריוגנית של דגימות קפואות של תאי יונקים תומכת בכדאיות התאים לאורך ניסוי ה-NMR.

כשאתה מנסה לעשות פרוטוקול, בקש סיוע בלחיצה על פליטה וסיבוב הדגימה כלפי מעלה כך שניתן יהיה להכניס את הדגימה לבדיקה לפני שהיא מתחממת, וודא שלא תוכנס לחות לבדיקה בטוח היטב שהספקטרומטר יתקרר במשך שבועות רבים. פרוטוקול זה ישים לכל מערכת שבה תנודות טמפרטורה עלולות לפגוע בשלמות הדגימה, כגון תגובות מרווה בהקפאה, או אפיון של חומרי ביניים של תגובה כלואה, אנזימולוגיה וקיפול חלבונים.