כימות ההשפעות של אנטי-מיקרוביאלים על ארכיטקטורת ביופילם במבחנה באמצעות תוכנת COMSTAT
14 בדצמבר 2020
שינויים אנטי-מיקרוביאליים בארכיטקטורת הביופילם Pseudomonas aeruginosa שונים בין מבודדים קליניים שגודלו בתרבית מחולים עם סיסטיק פיברוזיס וזיהום ריאתי כרוני. לאחר מיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתן להשתמש בתוכנת COMSTAT כדי לכמת וריאציות בארכיטקטורת ביופילם (למשל, שטח פנים, עובי, ביומסה) עבור מבודדים בודדים כדי להעריך את היעילות של חומרים אנטי זיהומיים.
המשמעות של פרוטוקול זה היא שהוא מציע מסגרת פשוטה וניתנת לשחזור לכימות מבני ביופילם במבחנה בתנאים אנטי-מיקרוביאליים משתנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מסייעת בביטול וריאציות סובייקטיביות הקשורות להפעלה הידנית של COMSTAT, מה שבסופו של דבר מקל על סטנדרטיזציה ושקיפות של ניסויים במרכזי מחקר. כדי לדמות את תרביות Pseudomonas aeruginosa, הנח את הצלחת על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקלי, המצויד באורכי גל עירור לייזר וערכות מסננים מתאימים.
והשתמש בעדשת טבילה במים של 20 עד 25x כדי לצלם לפחות שש תמונות z-stack שכבות מהשכבה התחתונה לחלק העליון של כל קטע ביופילם במרווחים של 0.3 מיקרומטר. לאחר מכן שמור את התמונות כ-OME-TIFF לניתוח COMSTAT. לאחר שכל התמונות נרכשו, פתח את חבילת COMSTAT2 ב-ImageJ וצור תיקיית מקור בשולחן העבודה.
הוסף OME-TIFF יחיד לתיקיה ופתח את OME-TIFF מתיקיית המקור. מחק את כל השכבות הריקות שאינן מכילות ביומסה. בחרו 'קובץ', 'ייבוא' ו'רצף תמונות' כדי לייבא את הקובץ ל- ImageJ.
אתר וסמן את תיקיית המקור מבלי לפתוח אותה ולחץ על בחר. יופיע חלון אפשרויות רצף, לחץ על אישור. בחרו 'תמונה', 'שינוי צורה' ו'הפוך Z' כדי להפוך את כיוון הביופילם כך שהתשתית תהיה בראש הערימה. כדי להגדיר את מאפייני התמונה, בחר תמונה ומאפיינים, יופיע חלון מקור.
ציינו את יחידת האורך כמיקרון, הגדירו את עומק הווקסל כ- 0.3 ולחצו על הלחצן 'אשר'. בחרו 'תמונה', 'כוונן' ו'סף'. כדי להתאים את סף התמונה בחלון הסף, מקם את המחוון התחתון בקצה הימני כדי להגדיר ידנית את ערך הסף המרבי והשתמש במחוון העליון כדי להגדיר את הסף המינימלי. לאחר מכן השתמשו במחוון בחלון התמונה כדי לגלול בכל אחת מהשכבות כדי לוודא שרעשי הרקע יוסרו במידה מספקת בכל הערימה, ובחרו 'קביעה' כדי לתקן את ערך הסף התחתון.
בחלון הגדרת רמות סף, בחר אישור והגדר ותקן את ערך הסף המרבי באופן דומה. בחר Apply, לחץ על OK בחלון המרת אוסף לבינארי שמופיע וצא מחלון הסף. בחר Plugins, Bio-Formats ו-Bio-Formats Exporter כדי לשמור את הקובץ בשם קובץ חדש בתיקיית המקור.
יופיע חלון ביו-פורמטים של מייצא קבצים מרובים, בחר אישור. יופיע חלון אפשרויות של Bio-Formats Exporter, בחר אישור שוב. כדי להפעיל את COMSTAT, בחר תוספים COMSTAT2, יופיע חלון אודות, בחר OK.In חלון הספריות שנצפו, בחר הוסף, אתר וסמן את תיקיית המקור, סמן ולחץ על בחר. יופיע חלון תמונות בספריות המפרט את קבצי OME-TIFF שיש לנתח.
בחלון COMSTAT2.1, בטל את הבחירה בסף אוטומטי בשיטה של Otsu ובסינון אמצעי אחסון מחובר כדי להבטיח שהתוכנה משתמשת בערכי סף מוגדרים מראש עבור OME-TIFF בודדים. בחלון COMSTAT2.1, בחר ביומסה, התפלגות עובי ושטח פנים ולחץ על עבור כדי להפעיל את התוכנית. נתוני הפלט יוצגו בחלון היומן.
המדידות יישמרו אוטומטית כקבצי TXT בתיקיית המקור. בניתוח מייצג זה, נעשה שימוש בבידוד Pseudomonas aeruginosa, שתורבת מחולה סיסטיק פיברוזיס נגוע, כדי להדגים את החוזקות של גישה זו, תוך כימות לא מדויק של שינויים אנטי-מיקרוביאלים המושרים בארכיטקטורת ביופילם במבחנה. הדמיית תאים חיים יכולה גם לדמיין שינויים במבנה הביופילם של Pseudomonas aeruginosa לפני ואחרי טיפול חד שבטי וטוברמיצין ספציפיים לביופילם.
ניתוח נתוני COMSTAT חשף הבדלים משמעותיים בין מבני ביופילם מטופלים בהשוואה לתרביות ביקורת. בתרביות שטופלו בטוברמיצין נצפתה ירידה ברורה בעובי הממוצע ובביומסה. עם זאת, בנוכחות נוגדנים, הביופילם P.aeruginosa היה עמיד לשינויים מבניים אלה שנגרמו על ידי טוברמיצין.
כאשר בוחנים את יחס פני השטח לנפח הביו, נצפתה ירידה משמעותית בנוכחות נוגדנים הן בביופילמים שנחשפו לטוברמיצין והן בביופילמים שלא נחשפו, מה שמעיד על היווצרות אגרגטים בתרביות שטופלו בנוגדנים. ניתן לבצע הליך זה כדי להעריך כמותית או להשוות את ההשפעות של אנטי-מיקרוביאלים שונים המשמשים לשיבוש מטריצות ביופילם. באמצעות טכניקה זו כמסגרת כללית, חוקרים יכולים לחקור דרכים שונות לחדד את הפרוטוקול כך שיכלול מודלים מתמטיים חדשים ותוספים אלגוריתמיים ב-ImageJ כדי לתאר טוב יותר הטרוגניות של ביופילם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג מסגרת הניתנת לשחזור לכימות מבני ביופילם של Pseudomonas aeruginosa תחת תנאים אנטימיקרוביאליים שונים. הפרוטוקול נועד להסדיר את הערכת ארכיטקטורת הביופילם, ובכך להגביר את השקיפות בין מרכזי מחקר.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מיקרוביולוגיה
- מחקר ביופילמים
- יעילות אנטימיקרוביאלית
רקע
- .Pseudomonas aeruginosa הוא פתוגן נפוץ בחולי סיסטיק פיברוזיס
- מבנה הביופילים עשוי להשפיע על תוצאות הטיפול.
- כימות מאפייני ביופילם חיוני להערכה של סוכנים אנטי-אינפקטיביים.
- תוכנת COMSTAT מספקת שיטה לניתוח אובייקטיבי של ביופילמים.
מטרת המחקר
- לכימות שינויים במבנה הביופילם בקרב בידודים קליניים.
- להערכת היעילות של חומרים אנטימיקרוביאליים שונים.
- לביטול השפעות של וריאציות סובייקטיביות בניתוח הביופילם.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיקרוסקופיה קונפוקלית לדמיון מבני ביופילם.
- תוכנת COMSTAT לכימות מאפייני ביופילם.
- שימוש בעדשת טבילה במים בעוצמה של 20 עד 25x לצורך הדמיה.
- רכישת תמונות z-stack במרווחים של 0.3 micrometer.
תוצאות עיקריות
- נצפו וריאציות במבנה הביופילם בין בידודים שונים.
- הפרוטוקול אפשר ביצוע של ניתוח סטנדרטי לאורך הניסויים.
- ניתוח COMSTAT סיפק מדדים אובייקטיביים להערכת הביופילם.
- יעילות האנטי-מיקרוביאלית הוערכה על בסיס מאפייני הביופילם.
מסקנות
- הפרוטוקול משפר את השחזוריות במחקרי ביופילם.
- סטנדרטיזציה משפרת את מהימנותם של תוצאות הניסויים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על מסגרת זו לצורך חקירות נוספות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות סטנדרטי של השפעות אנטימיקרוביאליות על ארכיטקטורת הביופילם תומך בתיקוף מטרות בפיתוח תרופות אנטי-אינפקציוביות. מדדי ביופילם אובייקטיביים מאפשרים הפחתת סיכונים מכניסטית של מועמדים טיפוליים על ידי קישור החשיפה לתרכובת לתוצאות מבניות. גישה זו משפרת את הביטחון החזוי בסינון פרה-קליני על ידי הפחתת השונות בהערכת הפנוטיפ של הביופילם בין מעבדות שונות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מנגנונים אנטי-מיקרוביאליים על ידי כימות שינויים בעובי הביופילם, במסה הביובית וביחס בין שטח הפנים לנפח הביולוגי.
- ערך תפעולי: מצמצם שונות סובייקטיבית בניתוח תמונות, ובכך תומך בהערכות הדירות של מעורבות המטרה באתרים שונים.
- ערך ניבוי: מסייע בקבלת החלטות של "המשך/עצור" (go/no-go) באמצעות אספקת ספי שכימות ליעילות אנטי-ביופילימית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר מדדים כמותיים וסטנדרטיים (ביומסה, התפלגות עובי, שטח פנים) עבור קמפיינים של סריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: מבסס תהליך עבודה לדימות וניתוח הניתן לשימוש חוזר, התואם לפלטפורמות קונפוקאליות בעלות תוכן גבוה (high-content).
- מוכנות הבדיקה: מכין מערכות ביופילם שעברו ולידציה להערכה המשכית של חומרים אנטימיקרוביאליים או אנטי-ביופילם.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשר בין פנוטיפים של ביופילם in vitro לבין בידודים של Pseudomonas aeruginosa בעלי רלוונטיות קלינית מזיהומים של סיסטיק פיברוזיס.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבדילה בין השפעות אנטימיקרוביאליות על מבנה הביופילם לבין חיות חיידקית, ובכך מבהירה את מנגנון הפעולה.
- קידום מותאם סיכון: תומכת בתעדוף של תרכובות המשבשות את ארכיטקטורת הביופילם ללא השראה של פנוטיפים של עמידות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולה המובילה, ומספקת פנוטיפ כמותי של הביופילם כדי לספק מידע על קשרי מבנה-פעילות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי קישור טיפול אנטימיקרוביאלי לשינויים מדידים במבנה הביופילם.
- סריקה: מאפשרת סטנדרטיזציה ושחזור של הבדיקה באמצעות הגדרות סף קבועות וביטול סגמנטציה תלויה-משתמש.
- אנליטיקה: מספקת פלטיים כמותיים ואובייקטיביים (ביומסה, עובי, שטח פנים) המאפשרים השוואה ישירה של תנאים אנטימיקרוביאליים.
- מחקר תרגומי: משתמשת בבידודים של P. aeruginosa הרלוונטיים למחלה כדי להגביר את הרציפות הפרה-קלינית והתאמה של סממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת מסגרת סטנדרטית הניתנת להתאמה עבור פתוגנים יוצרי ביופילם אחרים או מחלקות אנטימיקרוביאליות אחרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בפעילות אנטי-ביופיילמית על ידי מזעור של פרשנויות שגויות של מבני ביופילם הטרוגניים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה ואת היכולת להשוואה בין מעבדות על ידי ביטול וריאציות סובייקטיביות בהפעלה של COMSTAT.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות ההונית על ידי הפחתת כשלים במעברים פרה-קליניים הנובעים מהשפעות ביופילם שלא אופיינו כראוי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים המבוססות על ספי סף כמותיים של פירוק ביופילם.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית ובעיבוד תמונה עבור רכישת z-stack ועיבוד מקדים.
- תלוי בגישה למיקרוסקופים סורקים בלייזר מסוג קונפוקלי עם אורכי גל עירור מתאימים ועדשות שיקוע במים של 20–25x.
- מחייב פורמט תמונה סטנדרטי (OME-TIFF) וארגון תיקיות לצורך ניתוח COMSTAT2 של קבוצות תמונות.
- כולל שיקולי התאמה בעת היישום על מודלים שונים של ביופילם או מנגנונים אנטימיקרוביאליים.
- מוגבל על ידי השקעת הזמן הנדרשת לעיבוד מקדים ידני של התמונות לפני ניתוח COMSTAT אוטומטי.
