יצירת נוירונים אנושיים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים
9 בנובמבר 2020
האינטראקציות הנוירוניות-גליאליות בניוון עצבי אינן מובנות היטב בשל כלים ושיטות לא מספקים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים ממוטבים להשגת תאי עצב מושרים, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ומספקים דוגמאות לערכים של שיטות אלה בהבנת תרומות ספציפיות לסוג התא במחלת אלצהיימר.
הפרוטוקולים המתוארים כאן, צפויים להקל על מחקרים עתידיים על פגמים אוליגודנדרוגליאליים, בפתוגנזה של ניוון עצבי. זוהי שיטה משופרת שניתן להשתמש בה כדי ליצור תאי שושלת אוליגודנדרוציטים אנושיים פונקציונליים תוך שלושה עד ארבעה שבועות בלבד, ולהקים מערכת תרבית משותפת למודל קשרי האוליגודנדרוציטים של הנוירונים. ניתן להשתמש בפרוטוקול כדי לחקור לא רק את מחלת האלצהיימר, אלא כל היבט אחר הקשור למחלה של אינטראקציות אוליגודנדרוציטים של נוירונים.
כדי להתחיל, צלח כמיליון HEK293T תאים בכל בקבוק T75 כדי להשיג מפגש של 40%, ולאחר מכן העביר אותם עם פלסמידים המבטאים NGN2 המושרה טטרציקלין וגן טרנסאקטיבטור טטרציקלין עמיד לפורומיצין, יחד עם שלושת הפלסמידים המסייעים. השתמש ב-PEI לטרנספקציה. החלף את המדיה לאחר 16 שעות.
Harvest שחררה חלקיקים ויראליים על ידי איסוף מדיה תרבותית מדי יום והחלפתה במדיה טרייה למשך שלושה ימים. אסוף את המדיה שנאספה לטיהור, ואז סנן את הנגיף דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר וצנטריפוגה ב-49,000 פעמים G למשך 90 דקות. לאחר צנטריפוגה, השעו מחדש את הגלולה בנפח המתאים של גלוקוז PBS.
השתמש בתאי גזע אנושיים H1 הזמינים מסחרית לביצוע אינדוקציה של נוירונים. תרבית התאים על תמיסת מטריצה חוץ-תאית מצופה צלחות 6 בארות במדיום תחזוקה ESL ודגירה על הלוחות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. יומיים לפני השראת ההתמיינות יש לנתק תאי ES על ידי הוספת מיליליטר אחד של תמיסת ניתוק תאים ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
העבירו את התאים לצינור, ואז שטפו את הבאר בשני מיליליטר מדיה והוסיפו אותה לאותו צינור. צנטריפוגה של התאים ב -300 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה במדיה וצלחו את התאים על צלחות מצופות מטריצה של 6 בארות בצפיפות ישיבה של אחת כפול 10 עד התאים החמישיים לבאר.
למחרת, הוסף לנטי-וירוסים, המבטאים NGN2 בתוספת פורו. R, וטרנסאקטיבטור טטרציקלין יחד עם פוליברן במדיום תחזוקת תאי ES טריים. ביום האפס, הוסף שני מיקרוגרם למיליליטר דוקסיציקלין במדיום DMEM/F-12 בתוספת N2 וללא מורפוגנים.
ביום הראשון, הוסף פורומיצין ב-DMEM/F-12 טרי, בתוספת N2 ודוקסיציקלין לריכוז הסופי של מיקרוגרם אחד למיליליטר. בחר את התאים המומרים בפורומיצין למשך 24 שעות לפחות. ביום השני, נתק נוירונים מבדלים עם תמיסת ניתוק תאים וצלח אותם מחדש על צלחות של 24 בארות מצופות בתמיסת מטריצה.
שמור אותם במדיום MBA B27 ללא דוקסיציקלין. תרבית נוירונים מושרים טהורים על הצלחות, מצופים בתמיסות מבוססות מטריצה חוץ-תאית. כדי לבצע יצירת תאי אב עצביים, תרבית תאי גזע אנושיים H1 והפיכתם לתאי אב עצביים, כמתואר בכתב היד הטקסטואלי.
ביום השלילי הראשון, זרע 0.5 עד מיליון תאים במדיום תחזוקת תאי ES לכל באר של צלחת בת 6 בארות המצופה בתמיסת מטריצה מופחתת גורם גדילה. ביום האפס, יש לטפל בתאים במשך 24 שעות עם מדיום תחזוקת תאי ES בתוספת 2% DMSO. בימים הראשון עד השישי, החלף את המדיה המלאה עם מדיום אינדוקציה עצבי חם המכיל כמה מעכבי תוספת מערכה מסחרית.
ביום השביעי, עברו NPCs באמצעות תמיסת ניתוק תאים וצלחו אותם בצפיפות ישיבה של אחד עד פעמיים 10 עד 5 תאים לבאר של צלחת של 24 בארות. בדוק את יעילות ההתמיינות על ידי צביעה אימונוהיסטוכימית להיעדר סמן פלוריפוטנטי ונוכחות של סמני NPC. כדי ליצור את תאי המבשר של האוליגודנדרוציטים, צלחו את ה-NPCs במדיום אינדוקציה עצבית חם עם כמה מעכבי תוספת מערכה מסחרית.
ביום השמיני, הכינו תמיסה של 1% DMSO במדיום ההתמיינות OPC, וטפלו ב-NPCs המצופים למשך 24 שעות. ביום התשיעי, החלף את המדיה במדיום התמיינות OPC טרי ללא DMSO, ולאחר מכן הזין את התאים כל יומיים עד היום ה-15. אם התאים מגיעים למפגש לפני היום ה-15, העבירו אותם לצפיפות הישיבה של אחד עד פעמיים כפול 10 לתאים החמישיים לבאר.
ביום ה-14, OPCs צלחת במדיום התמיינות OPC בצפיפות של אחד עד פעמיים 10 עד התאים החמישיים לבאר, בצלחת של 24 בארות. תאי בדיקה לנוכחות סמנים ספציפיים ל-OPC על ידי צביעת IHC או qPCR, ולהיעדר סמני NPC. ביום ה-15, החלף את המדיה במדיום התבגרות OL.
שנה את המדיום כל יומיים או כל יום. כאשר התאים מגיעים למפגש של 90%, פצלו אותם ביחס של אחד לשלושה עד שני מעברים או עד שחלוקת התאים מאטה באופן משמעותי. אם OPCs מתחלקים מהר מדי ומגיעים למפגש תוך פחות משלושה ימים, הוסף Ara-C בריכוז של שניים עד חמישה מיקרומולר למשך יום עד שלושה ימים.
ביום ה-14, צלחו את ה-IOPCs בצפיפות של 1 כפול 10 עד 5 תאים לבאר בצלחת של 24 בארות במדיום התמיינות OPC. למחרת, נתק את הנוירונים האנושיים המושרים עם תמיסת ניתוק תאים. הוסף נוירונים ל-OPCs המתורבתים, ציפוי בצפיפות ישיבה של שניים כפול 10 עד חמישית תאים לבאר.
השתמש במדיום תרבית משותפת המכיל מדיום נוירו-בסיסי A, תוסף B27 של 2% ו-100 ננוגרם למיליליטר T3 טריודותירונין. החלף את המדיום למחרת ולאחר מכן כל יומיים. אם OPCs מתרבים מהר מדי ומגיעים למפגש תוך פחות משלושה ימים, הוסף שניים עד חמישה Ara-C מיקרו-מולרי.
חשוב שתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מתחילים יציגו רמה גבוהה של פלוריפוטנטיות ליצירה מוצלחת של נוירונים מושרים, או OPCs ואוליגודנדרוציטים. לכן, יש לצבוע תאים עבור סמנים ספציפיים, כגון OCT-4 ו-SOX2, לפני תחילת אחד מפרוטוקולי האינדוקציה. תאי H1 אנושיים שימשו להשגת נוירונים מעוררים במוח הקדמי.
נוירונים טהורים בתרבית החלו לבטא סינפסה באחת ביום 14 עד 16. IOPCs נוצרו תוך שבועיים ואוליגודנדרוציטים בוגרים תוך ארבעה עד חמישה שבועות. טיפול ב-DMSO העשיר את מספר התאים בשלב G1 המוקדם לאינטגרציה טובה יותר של איתות.
סמני OPC ספציפיים זוהו כבר שבועיים לאחר הציפוי של תאי ES H1. אוכלוסיית ה-IOPC לאחר שבועיים הייתה הומוגנית למדי, עם למעלה מ-95% מהתאים חיוביים לצביעה 04 ורמה גבוהה של תגובתיות חיסונית לסמנים אחרים. לאחר התחלת הבשלת האוליגודנדרוציטים, זוהו סמני אוליגודנדרוציטים ספציפיים החל מהיום ה-28.
יש לקבוע את צפיפות הציפוי האידיאלית עבור נוירונים מושרים, ו-IOPCs, עם סדרה של טיטרציות של מספר תאים כדי להשיג התמיינות נכונה. לאחר ארבעה שבועות, בתרביות משותפות, יש להבדיל את ה-IOPCs כראוי לאוליגודנדרוציטים חיוביים לסמנים ספציפיים כגון MBP. מערכת קו-תרבית זו יכולה להגדיל באופן משמעותי את מספר הסינפסות, מה שמצביע על כך שה-IOPCs מספקים תמיכה עצבית באמצעות מגע פיזי או שחרור של גורמים טרופיים.
הליך מתואר זה יכול להיות מתוחכם עוד יותר על ידי הוספת סוגים שונים של תאי מוח. לדוגמה, תאי גזע הפיקו אסטרוציטים אנושיים כדי לדגמן היבטים חדשים של אינטראקציות גליה נוירונים בבריאות ובחולי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן אינטראקציות בין נוירונים לתאי גליה בניוון עצבי, ובספציפיות במחלת אלצהיימר, באמצעות אופטימיזציה של פרוטוקולים להפקת נוירונים מושריים ותאי אב לאוליגונודרוसाइटים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. השיטות המתוארות מאפשרות לחקור תרומות ספציפיות לסוגי תאים לתהליכים של ניוון עצבי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ניורודגנרציה (ניוון עצבי)
- דיפרנציאציה של תאים
- אינטראקציות בין אוליגודנדרוציטים לנוירונים
רקע
- ההבנה הנוכחית של האינטראקציות בין נוירונים לתאי גליה במחלת אלצהיימר היא מוגבלת.
- הכלים והשיטות הקיימים לא היו נאותים לחקר ניוון עצבי.
- תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מהווים נתיב מבטיח למחקר.
- פרוטוקולים מותאמים משפרים את ייצורם של סוגי תאים ספציפיים הרלוונטיים לניוון עצבי.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקולים משופרים להפקה של נוירונים ואוליגודנדרוציטים מושראים.
- הבהרת התרומה של פגמים אוליגודנדרוגליאליים למחלות נוירודגנרטיביות.
- הקמה של מערכות שיתוף-תרבית (co-culture) לחקר אינטראקציות בין נוירונים לאוליגודנדרוציטים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקות לתרבית תאים באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.
- פרוטוקולים מפורטים לטרנספקציה ולאיסוף חלקיקים ויראליים לצורך השראת תאים.
- לוחות זמנים מרכזיים כוללים יצירה של תאי אב לאוליגודנדרוציטים תוך שבועיים ותאי אוליגודנדרוציטים בוגרים תוך ארבעה עד חמישה שבועות.
- שימוש במצעי בידול וטיפולים ספציפיים להגברת הבשלת התאים.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקולים מאפשרים יצירה יעילה של נוירונים ואוליגודנדרוציטים מושריים.
- הנוירונים יצרו סינפסות כבר ביום ה-14 עד ה-16 לאחר ההשראה.
- ניתן להבדיל תאי קדם של אוליגודנדרוציטים ולהעריכם באמצעות סממנים מרכזיים.
- הפרוטוקול מספק תובנות לגבי הבשלות והאינטראקציות הפונקציונליות בין נוירונים לאוליגודנדרוציטים.
מסקנות
- מחקר זה מאפשר הבנה מעמיקה יותר של אינטראקציות נוירון-גליאלית בניוון עצבי.
- את השיטות שפותחו ניתן ליישם במגוון מחלות המערבות אינטראקציות בין נוירונים לאוליגודנדרוציטים.
- הוא מדגיש את חשיבותם של האוליגודנדרוציטים במחלות כמו אלצהיימר ומתייחס לצורך במתודולוגיות מחקר יעילות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מידול של אינטראקציות בין נוירונים לאוליגודנדרוציטים נותן מענה לפער קריטי במחקר של מחלות נוירודגנרטיביות, ובמיוחד עבור מחלת אלצהיימר, שבה תפקוד לקוי של אוליגודנדרוגליה תורם לפתולוגיה. מערכת השיתוף-תרבית (co-culture) זו, הנגזרת מתאי גזע, מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות טיפוליות על ידי בידוד של הדיאלוג (crosstalk) הגליאלי-נוירונלי במערכת אנושית מוגדרת. היא תומכת בביטחון ניבוי בתיקוף המטרות על ידי אספקת פלטפורמה רדוקציוניסטית להערכת השפעות של תרכובות על שלמות הסינפסות והמיאליניזציה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של קשרי הגומלה בין נוירונים לאוליגודנדרוציטים במנגנונים של ניוון עצבי.
- ערך תפעולי: מספק מערכת רלוונטית לבני אדם לצורך תיקוף של מטרות המשפיעות על התמיינות ותפקוד של אוליגודנדרוציטים.
- ערך אסטרטגי: תומך בזיהוי מוקדם של מטרות לשינוי מהלך המחלה על ידי קישור של תפקוד לקוי של אוליגודנדרוציטים לאובדן סינפסות ולאמילואידוזיס.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר מדדים כמותיים כגון צפיפות סינפסות וביטוי של myelin basic protein לצורך סריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: מספק פורמט שבילי של תרבית משותפת (co-culture), הניתן להרחבה לפלטות בעלות 24 בארות לצורך שילוב במערכי בדיקה בעלת תפוקה בינונית.
- ערך אסטרטגי: מאפשר סריקה של מודולטורים להבשלה של אוליגודנדרוציטים ותמיכה טרופית של נוירונים-גליאלים.
מחקר תרגומי ופרקליני
- ערך מדעי: מדמה אינטראקציות בין נוירונים לאוליגודנדרוციטים בבני אדם הרלוונטיות לפתולוגיה של החומר האפור בניוון עצבי.
- ערך תפעולי: מאפשר הערכה אורך של התמיינות תאי קדם-אוליגודנדרוციטים ומיאליניזציה לאורך ארבעה עד חמישה שבועות.
- ערך אסטרטגי: תומך בגילוי ביומרקרים תרגומיים על ידי מתאם בין ביטוי של סמני אוליגודנדרוצית לתוצאות תפקודיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת תאים נוירונליים ואוליגודנדרוגליאליים אנושיים שעברו תיקוף, לצורך בדיקות של מעורבות מטרה וסריקת פנוטיפ.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי תרומת תאי גליה לניוון עצבי באמצעות אינטראקציות מוגדרות של תרבית משותפת.
- סריקה: מספקת תאים המוכנים לבדיקה עם פלטים מדידים, כולל נקודות סינפטיות (synaptic puncta) ומסמני הבשלה של אוליגודנדרוציטים.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה כמותית של ביטוי מסמנים ויצירת סינפסות בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין דינמיקת שורת האוליגודנדרוציטים לרצף פרה-קליני באמצעות מעקב אחר הבשלה ומסמנים בנקודות זמן מוגדרות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה מתחדשת המופקת מתאי גזע פלוריפוטנטיים, הישימה למספר רב של אינדיקציות לניוון עצבי.
השפעה תפעולית ואורגנית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית באינטראקציות נוירון-גליאה באמצעות מודל שיתוף-תרבית (co-culture) מבוקר.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של ייצור תאי קדם לאוליגודנדרוציטים תוך שבועיים, ואוליגודנדרוציטים בוגרים תוך ארבעה עד חמישה שבועות.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות מסוג go/no-go על ידי הפחתת סיכונים של מטרות באמצעות קריאות פנוטיפיות של שלמות הסינפסה והמיאלינציה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של תרכובות המווסתות תפקודי תמיכה גליאליים בניוון עצבי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים, טרנסדוקציה לנטיויראלית ואימונוציטוכמיה.
- תלוי בגישה לציוד לייצור נגיפים, לתשתיות צנטריפוגה ולערכות מצעים לדיפרנציאציה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לצורך הבטחת צפיפויות זריעה ולוחות זמנים של דיפרנציאציה עקביים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת המודל לשילוב אסטרוציטים או סוגי תאי גליה אחרים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון דיפרנציאציה א-סינכרונית והצורך בתיקוף מרקרים להבטחת טוהר התאים.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:37
Human Neuron Induction from Human Pluripotent Stem Cells
3:59
Human Oligodendrocyte Precursor Cell (OPCs) Induction from Pluripotent Stem Cells and Oligodendrocyte Maturation
7:05
Co-culturing of Human Induced Neurons (Ins) and Oligodendrocyte Precursor Cells (Iopcs)
8:06
Results: Direct Generation of Human Induced Neurons from Human Pluripotent Stem Cells
10:23
Conclusion
