Name: ניתוח רפרטואר חיסוני של קולטן תאי T ו- B באמצעות רצף הדור הבא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: למדו לבודד DNA מדגימי דם וביופסיות מעי, ליצור ספריות PCR של TCRβ ו-IGH, ולבצע ריצוף דור-הבא. שיטה זו מאפשרת לזהות שיבוטים ייחודיים של תאי T ו-B ולעקוב אחריהם באתרים אנטומיים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית במרכז הרפואי שיבא, והושגה הסכמה מדעת בכתב מכל הנושאים המשתתפים.
1. בידוד וכימות DNA
<ol><li>עיכול ותא תמוגה של ביופסיות מעיים<ol>
<li>יש לאחזר ביופסיות מעיים, שנאספו זה עתה או כאלה המאוחסנות ב-20°C או -80 °C (60 °F). אם משתמשים בביופסיות קפואות, מפשירים על קרח.</li>
		<li>הוסף 600 μL של תמיסת תמוגה גרעינית לצינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי 1.7 מ"ל, מקורר על קרח.</li>
		<li>מניחים ביופסיה לתוך צינור microcentrifuge עם פתרון תמיסת תמוגה דגירה ב 65 °C (65 °F) במשך 15-30 דקות.</li>
		<li>יש להוסיף 17.5 מיקרו-ל' של 20 מ"ג/מ"ל חלבון K ולהדגיר במשך הלילה ב-55°C, עם רעידות עדינות.</li>
		<li>אפשר מדגם להתקרר לטמפרטורת החדר במשך 5 דקות לפני שתמשיך לשלב 1.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תמוגה תאית של דם שלם<ol>
<li>השג 3 מ"ל של דם שלם בצינור המכיל EDTA, הפרין או ציטראט.</li>
		<li>בעדינות צינור רוק עד מעורבב ביסודיות, ולהעביר דם צינור סטרילי 15 מ"ל צנטריפוגה המכיל 9 מ"ל של פתרון תמוגה התא. הפוך מספר פעמים במהלך תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 2,000 x g במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להשליך כמה שיותר supernatant ככל האפשר מבלי להפריע גלולה לבנה גלוי. כ 50-100 μL של שאריות נוזל יישאר.</li>
		<li>צינור וורטקס במרץ במשך 15 שניות עד לשימוש חוזר לחלוטין. הוסף 3 מ"ל של תמיסת תמוגה גרעינית ו pipet מספר פעמים. הפתרון צריך להיות צמיג.</li>
	</ol>
</li>
	<li>משקעים בחלבון<ol>
<li>הוסף 200 μL של מאגר משקעים חלבון לרקמה, או 1 מ"ל לדם. וורטקס במרץ במשך 20 s ודגר על קרח במשך 5 דקות. גושי חלבון קטנים עשויים להיות גלויים לאחר מערבולת.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 16,000 x g במשך 4 דקות. גלולה הדוקה המכילה חלבונים מזורזים צריכה להיווצר.</li>
		<li>בזהירות להעביר supernatant, מבלי להפריע גלולה, לצינור חדש 1.7 מ"ל. הערה: אם גלולה אינה הדוקה, לשקול צנטריפוגה אחרת ב 16,000 x g במשך 4 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>משקעים והתייבשות DNA<ol>
<li>מוסיפים 1 מ"ל של 2-propanol לצינור המכיל את supernatant, בעדינות לערבב על ידי היפוך. הדנ"א צריך להיות גלוי כחומר צף לבן.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 16,000 x g במשך 1 דקות. הסר את supernatant לחלוטין באמצעות פיפטה.</li>
		<li>מוסיפים 1 מ"ל של 70% אתנול טרי, והפך צינור מספר פעמים. צנטריפוגה ב 16,000 x g במשך 1 דקות בטמפרטורת החדר. השלך על טבעי בזהירות.</li>
		<li>חזור על שלב 1.4.3.</li>
		<li>מניחים צינור פתוח הפוך על נייר סופג נקי במשך 10-15 דקות. הפוך מחדש את הצינור ואשר הידרציה מלאה. במידת הצורך, השאירו לייבוש אוויר למשך 10-15 דקות נוספות. הערה: זה חיוני עבור גלולה להתייבש לחלוטין.</li>
		<li>הוסף 50 μL של מים טהורים במיוחד (UPW). במידת הצורך, ניתן לדלל את הדנ"א יותר לאחר כימות.</li>
		<li>דגירה במשך 1 שעות על בלוק חום ב 65 מעלות צלזיוס, עבור התייבשות DNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כימות דנ"א הערה: הדנ"א כומת באמצעות מד פלואורומטר וריאנטים ייעודיים, כפי שצוין בטבלת החומרים.<ol>
<li>הביאו תקנים לטמפרטורת החדר והכינו את הערכה, כולל צינורות ייעודיים של 0.5 מ"ל.</li>
		<li>מכינים תערובת חיץ וצבע בצינור של 15 מ"ל, לפי מספר הדגימות. הוסף 200 μL של חוצץ ו 1 μL של צבע לכל מדגם. כלול 2 דגימות עבור תקנים. מומלץ לחשב מדגם נוסף כדי למנוע שהמאגר לא יספיק.<ol>
<li>עבור 2 סטנדרטים, מקום 190 μL של תערובת מעל מוכן בצינור 0.5 מ"ל. הוסף 10 μL של התקן.</li>
			<li>עבור כל מדגם, מקום 199 μL של תערובת שהוכנה לעיל בצינור 0.5 מ"ל. הוסף μL אחד של ה-DNA.</li>
		</ol>
</li>
		<li>קרא את הדגימות. התוצאה מצביעה על ריכוז הדנ"א של הדגימה.</li>
		<li>אם הדגימות נמצאות מעבר לגבול, לדלל את ה-DNA 1:10 עם UPW, ולחזור לקרוא.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנת הספרייה
הערה: הפרוטוקול הנוכחי משתמש בערכת מבחנים מבוססת PCR מרובת-פיקסלים התואמת לרצפי NGS. הערכה מכילה 24 מדדים שונים שכל אחד מהם מכוון לאזורים שמורים בתוךV β ובאזורי Jβ. פעולה זו מאפשרת תגובת PCR חד-שלבית ואיגום של דגימות שונות. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים.
<ol><li>הכינו דגימות דנ"א. להשיג 150 ng של DNA ולהוסיף UPW עבור סך של 5 μL. הערה: ניתן להשתמש פחות מ 150 ng של DNA להכנת הספרייה, עם ריכוז מינימלי של 10 ng / μL.</li>
	<li>מניחים פיפטות וטיפים במכסה המנוע עם אור UV במשך 15 דקות כדי לשבור את ה-DNA שיורית. בינתיים, לאפשר צינורות אינדקס שונים (להכנת הספרייה) ופולימראז DNA להפשיר על קרח.</li>
	<li>במכסה המנוע הביולוגי, להוסיף 45 μL מצינורות אינדקס שונים לתוך צינורות PCR. כדי לעקוב, להוסיף 0.2 μL של פולימראז DNA ו 5 μL של DNA מוכן בשלב 2.1 לתוך צינורות PCR.</li>
	<li>הפעל תגובת PCR באמצעות תוכנית מוגדרת מראש, בהתאם להוראות היצרן.</li>
</ol>3. טיהור וכימות הגברה
<ol><li>השתמש חרוזים מגנטיים להסרת פרייומרים עודפים, נוקלאוטידים, ואנזימים.<ol>
<li>מחממים את החרוזים לפחות 30 דקות לטמפרטורת החדר. הכן מספיק טרי 80% אתנול עבור 400 μL לכל מדגם.</li>
		<li>הוסף 50 μL (IGH) או 35 μL (TCRβ) של החרוזים לכל צינור PCR ומערבבים על ידי pipetting 10 פעמים. דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>מניחים את המדגם המעורב על המעמד המגנטי במשך 5 דקות.</li>
		<li>לשאוף 95 μL (IGH) או 80 μL (TCRβ) של נוזל שקוף להשליך. לשאוף נוזל שנותר באמצעות קצה μL 10.</li>
		<li>הוסף 200 μL של 80% אתנול לכל מדגם. דגירה 30 שניות. לשאוף 195 μL של אתנול ולהשליך. לשאוף נוזל שנותר באמצעות קצה μL 10.</li>
		<li>חזור על שלב 3.1.5. פותחים את כובעי הצינורות ומניחים לאוויר להתייבש במשך 5 דקות.</li>
		<li>מיד לאחר 5 דקות, להסיר מעמד מגנטי ולהוסיף 25 μL של מאגר elution (10 mM Tris-HCl, pH 8.0). מערבבים על ידי pipetting עד הומוגני. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות.</li>
		<li>מניחים את הצינורות על המעמד המגנטי במשך 5 דקות. העבר 22 μL לצינור PCR חדש. למדוד את ריכוז ה-DNA (שלב 1.5).</li>
	</ol>
</li>
	<li>כימות אמפרליקון הערה: הפרוטוקול הנוכחי משתמש במכונת אלקטרופורזה אוטומטית לבקרת איכות של ריכוז DNA, גודל ושלמות. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים.<ol>
<li>מניחים ריאגנטים וקלטת מסך בטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות.</li>
		<li>בצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של 1.7 מ"ל, בצע דילול של 1 ng/μL של דגימות הדנ"א שכומתו בשלב 3.1.8 עם UPW בנפח כולל של לפחות 3 μL.</li>
		<li>דנ"א מדולל של וורטקס לפני השימוש. מניחים 2 μL של חוצץ, יחד עם 2 μL של ה- DNA מדולל ברצועות PCR מיוחדות שכותרתו מראש (מסופק בערכה) ומניחים את הכובעים. מניחים על שייקר במשך דקה, ואחריו ספין למטה של רצועות PCR. הערה: בשל צמיגות המאגר, ודא שהמאגר העודף מוסר מהקצה לפני ההעברה לצינורות המדגם.</li>
		<li>במקום במכונה, רצועת המסך וה- PCR ללא הכובעים. פתח את המכסה של תיבת קצה בתוך המכונה. הקצה את המשרה עם התוויות המתאימות. תפעיל את המכונה. הערה: היסטוגרמה הפלט צריכה להיות שיא יחיד בגודל הרצוי של האמפליקונים (איור 1A). בדגימות באיכות ירודה, יצפו פסגות נוספות (איור 1B), המצביעות על ניקוי חרוזים לקוי או היווצרות של דימרים ראשוניים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. רצף הדור הבא
<ol><li>כימות ואיגום של ספריה<ol>
<li>חשב את ריכוז הדנ"א הסופי ב- nM, באמצעות ערך DNA משלב 3.1.8, ואת הגודל בזוגות בסיסים (bp) של שיא המוצר, המתקבל מתוצאות מכונת אלקטרופורזה (ראה איור 1).</li>
		<li>עבור כל דגימה, לחשב את נפח ה-DNA לקחת עבור ריכוז סופי של 4 nM, בנפח הסופי של 10-20 מאגר elution μL.</li>
		<li>הכינו תערובת דילול חדשה לכל דגימה וקחו ממנה 2 μL לתערובת בריכה חדשה. הערה: עבור דגימות הכוללות פחות מ- 4 ננומטר, הוסף את כמות הדגימה המרבית האפשרית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפעלת ספריה של NGS הערה: הפרוטוקול הנוכחי משתמש בפלטפורמת רצף ספסל עליון. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים.<ol>
<li>הכינו פתרון טרי של 0.2 N NaOH. הוסף 10 μL של 0.2 N NaOH לספריה מדוללת מוכן בשלב 4.1.3. הוסף 5% PhiX לצינור ומערבולת בקצרה. סובבו את הצינור כדי להבטיח שכל הפתרון התיישב בתחתית הצינור.</li>
		<li>דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי denature את ה-DNA תקוע כפול. הוסף 980 μL של חיץ מצונן מראש מן הערכה לצינור המכיל DNA ומערבולת בקצרה.</li>
		<li>מניחים את הספרייה המדוללת על הקרח, ומכינים את הספרייה כדלקמן. לקבלת שילוב של 17 pM, להוסיף 425 μL של DNA משלב 4.2.2 ו 575 μL של חוצץ. הפוך את הספריה מספר פעמים וסובב למטה. טען 600 μL של הספריה הסופית על המחסנית המיועדת, והנח דגימות במכונה.</li>
		<li>הפעל את ההפעלה בהתאם להוראות התוכנה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ניתוח רצף
<ol><li>הורד מדדי רצף מרצף וודא כי נתוני רצף נמצאים בטווחים הבאים (ספציפיים לערכה המשמשת בפרוטוקול הנוכחי). דוגמאות שאינן עומדות בקריטריונים אלה כפופות להפעלה חוזרת: צפיפות אשכול (צפיפות (K/mm2)): 945K – 1800K אחוז הקריאות העוברות מסנן (אשכולות PF (%)): >90% ציוני איכות (%>=Q30): >85% יישור PhiX (מיושר%): 1.5% - 10% שיעור שגיאות PhiX (%): <1.0%</li>
</ol>

<ol><li>Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+and+regulation+of+chromosomal+V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination.</a> Cell. 109, Suppl 45-55 (2002).</li>
<li>Roth, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V%28D%29J+Recombination%3A+Mechanism%2C+Errors%2C+and+Fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Spectrum%22%5BJournal%5D)">V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity.</a> Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).</li>
<li>Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+sequencing+of+the+T-cell+receptor+repertoire%3A+pitfalls+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities.</a> Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).</li>
<li>Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old+questions%2C+new+tools%3A+does+next-generation+sequencing+hold+the+key+to+unraveling+intestinal+B-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses.</a> Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).</li>
<li>Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+repertoire+analysis+in+polygenic+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases.</a> Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).</li>
<li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+T+and+B+cell+repertoire+diversity+in+patients+with+RAG+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency.</a> Science Immunology. 1 (6), (2016).</li>
<li>Werner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+T+and+B+Cell+Receptor+Repertoires+Patterns+in+Patients+With+IL10+Signaling+Defects+and+History+of+Infantile-Onset+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Immunology%22%5BJournal%5D)">Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD.</a> Frontiers Immunology. 11, 109(2020).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+receptor+repertoires+in+pediatric+and+adult+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia.</a> Genome Medicine. 11 (1), 73(2019).</li>
<li>Chapman, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+T-cell+Receptor+Repertoire+in+Inflamed+Tissues+of+Patients+with+Crohn%27s+Disease+Through+Deep+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn's Disease Through Deep Sequencing.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).</li>
<li>Werner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+T+cell+receptor+beta+repertoire+patterns+in+pediatric+ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis.</a> Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).</li>
<li>Bashford-Rogers, R. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+B+cell+receptor+repertoire+in+six+immune-mediated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases.</a> Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+TCRbeta+CDR3+clonotypes+distinguish+Crohn%27s+disease+and+ulcerative+colitis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients.</a> Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).</li>
<li>Rosati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+disease-associated+traits+and+clonotypes+in+the+T-cell+receptor+repertoire+of+monozygotic+twins+affected+by+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journam+of+Crohn%27s+and+Colitis%22%5BJournal%5D)">Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases.</a> Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).</li>
<li>Allez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+clonal+expansions+in+ileal+Crohn%27s+disease+are+associated+with+smoking+behaviour+and+postoperative+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence.</a> Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IMGT%2FHighV+QUEST+paradigm+for+T+cell+receptor+IMGT+clonotype+diversity+and+next+generation+repertoire+immunoprofiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling.</a> Nature Communications. 4, 2333(2013).</li>
<li>H, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+B-cell+receptor+repertoire+analysis+in+primary+immunodeficiencies%3A+from+severe+combined+immunodeficiency+to+common+variable+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Immunology%22%5BJournal%5D)">Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency.</a> Frontiers Immunology. 6, 157(2015).</li>
<li>Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+receptor+repertoire+sequencing+in+patients+with+primary+immunodeficiency%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review.</a> Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).</li>
<li>Zhuang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+immune+repertoire+sequencing+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy.</a> International Immunopharmacology. 74, 105688(2019).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+beta+repertoires+as+novel+diagnostic+markers+for+systemic+lupus+erythematosus+and+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis.</a> Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).</li>
<li>Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+dysregulation+in+immunodeficiency+disorders%3A+The+role+of+T-cell+receptor+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing.</a> Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).</li>
<li>Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+roadmap+towards+personalized+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+System+Biology+and+Applications%22%5BJournal%5D)">A roadmap towards personalized immunology.</a> NPJ System Biology and Applications. 4, 9(2018).</li>
<li>Laubli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T+cell+repertoire+in+tumors+overlaps+with+pulmonary+inflammatory+lesions+in+patients+treated+with+checkpoint+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1386962(2018).</li>
<li>Hogan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+Blood+TCR+Repertoire+Profiling+May+Facilitate+Patient+Stratification+for+Immunotherapy+against+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma.</a> Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).</li>
<li>Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+T-Cell+Repertoire+Analysis+as+Source+of+Prognostic+and+Predictive+Biomarkers+for+Checkpoint+Blockade+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).</li>
<li>Hirsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+and+prognostic+value+of+clone-specific+minimal+residual+disease+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).</li>
<li>De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Cell+T+Cell+Receptor+Sequencing%3A+Techniques+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges.</a> Frontiers Immunology. 9, 1638(2018).</li>
<li>Zemmour, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+gene+expression+reveals+a+landscape+of+regulatory+T+cell+phenotypes+shaped+by+the+TCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR.</a> Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).</li>
<li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+Infiltrating+T+Cells+in+Liver+Cancer+Revealed+by+Single-Cell+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing.</a> Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).</li>
</ol>

לכל המחברים אין מה לחשוף.

שינויים בשפע ובתפקוד של לימפוציטים B ו- T נתקלים לעתים קרובות בממאירות שונות18, הפרעות דלקתיות כרוניות (למשל, קוליטיס כיבית ודלקת מפרקים שגרונית)10,19, וב immunodeficiencies שונים17,20. השיטה הנוכחית משתמשת ב- NGS כדי להקל על תצוגה מעמיקה של רפרטואר TCR ו- BCR, ומאפשרת זיהוי של שינויים עדינים בשיבוט תאי T ו- B, שיתוף שיבוטים, שימוש בגנים V(D)J ומידע על מידת מוטציות ההיפר-מוטציות הס...

המערכת החיסונית האדפטיבית, המורכבת מלטמפוציטים T ו- B, משתמשת בזיכרון אימונולוגי כדי לזהות אנטיגן שנתקל בעבר וליזום תגובה מהירה. לימפוציטים נוצרים במח העצם ומתבגרים בתימוס (תאי T) או במח העצם (תאי B). הן קולטן תאי T (TCR) והן קולטן תא B (BCR) מציגים תצורות ייחודיות המאפשרות זיהוי של אנטיגנים ספציפיים. בתאי הומאוסטזיס, תאי T ו- B מסתובבים כל הזמן וסוקרים את טריליוני הפפטידים השונים המוצגים על תאים המציגים אנטיגן. TCR או קשירת BCR של אנטיגן מסוים עם זיקה גבוהה, יחד עם גירוי משותף מתאים, מוביל להפעלת תאים, וכתוצאה מכך הפרשת ציטוקינים, הרחבת שיבוטים ויצירת נוגדנים, במקרה של תאי B.
המערך העצום של תאי T או B השונים נקרא באופן קולקטיבי רפרטואר חיסוני, המאפשר הכרה באינספור אפיטופים שונים. על מנת ליצור רפרטואר כה עצום, מתרחש תהליך מורכב של הרכבה אקראית של מקטעי גנים שונים, ויוצר שילובים כמעט אינסופיים של קולטנים שיכולים לקשור אנטיגנים ייחודיים1. תהליך זה, הנקרא V(D)J recombination, כולל סידורים מחדש של משתנים שונים (V), גיוון (D) והצטרפות (J) גנים, מלווה מחיקות אקראיות והכנסות של נוקלאוטידים בצמתים2.
הארכיטקטורה של מערכת החיסון האדפטיבית עניינה מדענים בתחומים שונים במשך עשורים רבים. בעבר, רצף סנגר, קביעת אזור משלים 3 (CDR3) ספקטרtyping, ואת cytometry זרימה שימשו כדי לאפיין את הרפרטואר החיסוני, אבל סיפק רזולוציה נמוכה. בעשור האחרון, ההתקדמות בשיטות רצף הדור הבא (NGS) אפשרה תובנה מעמיקה על המאפיינים וההרכב של רפרטואר TCR ו- BCR של הפרט3,4. מערכות תפוקה גבוהה אלה (HTS) רצף ומעבד מיליוני מוצרי TCR או BCR מסודרים מחדש בו זמנית ולאפשר ניתוח ברזולוציה גבוהה של תאי T ו- B ספציפיים ברמת נוקלאוטידים או חומצת אמינו. NGS מספק אסטרטגיה חדשה לחקר הרפרטואר החיסוני הן בבריאות והן במחלות. מחקרים העושים שימוש ב- HTS הדגימו רפרטואר TCR ו- BCR שונה במחלות אוטואימוניות5, כשל חיסוני ראשוני6,7, וממאירות, כגון לוקמיה מיאלואידית חריפה8. באמצעות NGS, אנו ואחרים הראו התרחבות אוליגוקלונית של שיבוטים ספציפיים של תאי T ו- B, בחולים עם מחלות מעי דלקתיות (IBD), כולל קוליטיס כיבית ומחלת קרוהן9,10,11,12,13,14. בסך הכל, מחקרים מתחומים שונים מראים שלשינויים ברפרטואר יש תפקיד מכריע בפתוגנזה של הפרעות בתיווך חיסוני.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לבידוד דנ"א מביופסיות מעיים ודם, יצירת ספריות TCRβ ו- IGH PCR עבור NGS וביצוע ריצוף ריצה. אנו מספקים גם שלבים בסיסיים בניתוח נתונים של רפרטואר חיסוני. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם עבור הדור של ספריות TCRα, TCRγ, ו IGL גם כן. השיטה תואמת גם לאיברים אחרים (למשל, בלוטות לימפה, גידולים, נוזל סינוביאלי, רקמת שומן וכו ') כל עוד נעשה שימוש בפרוטוקולי עיכול ספציפיים לרקמות.

<table><tbody><tr><td>2-פרופנול</td><td>Sigma</td><td>I9516-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>1.7 מ"ל צינורות מיקרו צנטריפוגה</td><td>Axygen</td><td>8187631104051</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td>גריינר</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>Merck</td><td>1.08543.0250</td><td></td></tr><tr><td>Amplitaq זהב</td><td>תרמו פישר</td><td>N8080241</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP חרוזים</td><td>בקמן קולטר</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>בלוק חום</td><td>Bioer</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>רגישות גבוהה D1000 מאגר מדגם</td><td>Agilent</td><td>5067-5603</td><td>לתחנת טייפ</td></tr><tr><td>רגישות גבוהה D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td>לתחנת טייפ. צינורות הנמכרים בנפרד</td></tr><tr><td>ערכת בדיקת לימפוטראק</td><td>Invivoscribe</td><td>TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019</td><td>כל אחד כולל 24 אינדקסים</td></tr> ערכת <tr><td>ריאגנטים MiSeq v2 (500 מחזורים)</td> <td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td>כולל סוג תא זרימה סטנדרטי וכל הריאגנטים הנדרשים</td></tr><tr><td>MiSeq Sequencer</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>רצועות PCR</td><td>4titude</td><td>4ti-0792</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 פלואורומטר</td><td>תרמו פישר</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>קיוביט dsDNA HS ערכת בדיקה</td><td>תרמו פישר</td><td>Q32854</td><td>כולל חיץ, צבע, תקנים וצינורות מיוחדים</td></tr><tr><td>שייקר</td><td>ביוסן</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>ultra מים טהורים</td><td>Bio-lab</td><td>7501</td><td></td></tr><tr><td>Wizard ערכת בידוד DNA</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>כוללת תמיסת ליזה של תאים, תמיסת ליזה של גרעינים ומאגר משקעים של חלבון</td></tr></tbody></table>

ניתוח רפרטואר חיסוני של קולטן תאי t ו- b באמצעות רצף הדור הבא

T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing

זיכרון אימונולוגי, סימן ההיכר של חסינות אדפטיבית, מתוזמר על ידי לימפוציטים T ו- B. במחזור ובאיברים שונים, ישנם מיליארדי שיבוטים ייחודיים של תאי T ו- B, וכל אחד מהם יכול לקשור אנטיגן ספציפי, המוביל לשגשוג, בידול ו/או הפרשת ציטוקינים. ההטרוגניות העצומה בתאי T ו- B נוצרת על ידי שילוב אקראי של מקטעים גנטיים שונים. טכנולוגיות רצף הדור הבא (NGS), שפותחו בעשור האחרון, מאפשרות מבט מעמיק וחסר תקדים על הרפרטואר החיסוני של קולטן תאי T ו-B. מחקרים במצבים דלקתיים שונים, כשל חיסוני, זיהומים וממאירות הראו שינויים ניכרים בשיבוטיות, בשימוש בגנים ובתכונות ביופיזיות של רפרטואר מערכת החיסון, וסיפקו תובנות חשובות על תפקידן של תגובות חיסוניות מסתגלות בהפרעות שונות.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור NGS של רפרטואר המערכת החיסונית של תאי T ו- B מן הדם והרקמות. אנו מציגים צינור החל מבידוד DNA דרך הכנת הספרייה, רצף על רצף NGS וכלה בניתוחים בסיסיים. שיטה זו מאפשרת לחקור תאי T ו- B ספציפיים ברמת הנוקלאוטידים או חומצות האמינו, ובכך לזהות שינויים דינמיים באוכלוסיות לימפוציטים ופרמטרים של גיוון במחלות שונות. טכניקה זו נכנסת לאט לפרקטיקה הקלינית ויש לה פוטנציאל לזיהוי סמנים ביולוגיים חדשניים, ריבוד סיכונים ורפואה מדויקת.

בזאת, אנו מתארים שיטה לבידוד DNA מרקמת המעי והדם, הכנת ספריות עבור NGS, וצעדים בסיסיים של ריצוף לרצף רפרטואר חיסוני. הריצה תיצור קבצים fastq, אשר ניתן להמיר עוד יותר קבצי fasta לשימוש בפלטפורמת ImMunoGeneTics הבינלאומית (IMGT)/HighV-QUEST. HTS זה מבצע ומנהל ניתוחים רבים של עשרות אלפי רצפי TCRβ ו- IGH מסודרים מחדש, ברמת הנוקלאוטידים15. IMGT/HighV-QUEST מאפשר ניתוח של TCRs שונים ורפרטואר IGH הן בבריאות והן במחלות. זה יכול להוביל לזיהוי של שיבוטים "ספציפיים למחלה" חדשים, ניתוח של התרחבות שיבוטים ופרמ...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לבידוד DNA מדגימות דם וביופסיות מעיים, יצירת ספריות TCRβ ו- IGH PCR לריצוף הדור הבא, ביצועים של ריצת NGS וניתוח נתונים בסיסי.

ניתוח רפרטואר חיסוני של קולטן תאי T ו- B באמצעות רצף הדור הבא

Immunological memory, the hallmark of adaptive immunity, is orchestrated by T and B lymphocytes. In circulation and different organs, there are billions ...

שיטה זו מאפשרת לחקור תאי T ו- B ספציפיים ברמת הנוקלאוטידים או חומצות האמינו ובכך לזהות שינויים דינמיים באוכלוסיות לימפוציטים ופרמטרי גיוון בהפרעות שונות. היתרון של רצף הדור הבא הוא היכולת לזהות שיבוטים ייחודיים של תאי T או B ולעקוב אחריהם באתרים אנטומיים שונים או באנשים שונים. יש לזה פוטנציאל לזיהוי סמנים ביולוגיים חדשניים במחלות מגוונות.מי שתדגים את ההליך הזה תהיה נעמי סלמון, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי. התחל על ידי ביצוע עיכול ותזת תאים של ביופסיות מעיים. יש לאחזר ביופסיות מעיים שנאספו זה עתה או אוחסנו ב-20 מעלות צלזיוס שליליות או שליליות.אם משתמשים בביופסיות קפואות, מפשירים אותן על קרח. הוסף 600 מיקרוליטרים של תמיסת תמיסת גרעינים לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 1.7 מיליליטר, מקורר על קרח. ואז למקם ביופסיה לתוך הצינור, ולהדגיר אותו ב 65 מעלות צלזיוס במשך 15 עד 30 דקות.הוסיפו 17.5 מיקרוליטרים של 20 מיליגרם למיליליטר חלבון K, ודגרו את הצינור למשך הלילה ב-55 מעלות צלזיוס, עם רעידות עדינות. לאחר הדגירה, לאפשר לדגימה להתקרר לטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לבידוד DNA מדם, בעדינות לטלטל את הצינור עד שהוא מעורבב ביסודיות.ואז להעביר דם לצינור צנטריפוגה סטרילי 15 מיליליטר המכיל תשעה מיליליטר של תמיסת תמוגה התא. הפוך את הצינור מספר פעמים במהלך תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה ב 600 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.ואז להשליך כמה שיותר על טבעי ככל האפשר מבלי להפריע גלולה לבנה גלוי. וורטקס הצינור במרץ במשך 15 שניות עד לשימוש חוזר לחלוטין. הוסף שלושה מיליליטרים של פתרון תמוגה גרעינית, פיפטה מספר פעמים, גורם הפתרון להיות צמיג.מוסיפים למדגם מאגר משקעים לחלבון. ואז מערבולת נמרצת במשך 20 שניות, ולהדגיר אותו על קרח במשך חמש דקות. צנטריפוגה ב 16, 000g במשך ארבע דקות כדי ליצור גלולה הדוקה המכילה את החלבונים מזרז.בזהירות להעביר supernatant מבלי להפריע גלולה לצינור חדש 1.7 מיליליטר. מוסיפים מיליליטר אחד של 2-propanol לצינור המכיל את supernatant, בעדינות לערבב אותו על ידי היפוך. הדנ"א צריך להיות גלוי כחומר צף לבן.צנטריפוגה ב 16, 000 פעמים g לדקה אחת, ולהסיר את supernatant לחלוטין. מוסיפים מיליליטר אחד של 70% אתנול שהוכן זה עתה, וממירים את הצינור מספר פעמים. צנטריפוגה זה ב 16, 000 גרם לדקה אחת בטמפרטורת החדר.ואז בזהירות להשליך את supernatant. חזור על שטיפת האתנול. ואז להשאיר את גלולת ה-DNA לייבוש אוויר במשך 10 עד 15 דקות.הוסיפו לדנ"א 50 מיקרוליטרים של מים טהורים במיוחד, ובצעו כימות דנ"א כמתואר בכתב היד. השתמש 150 ננוגרם של DNA כדי להכין את הספרייה לריצוף. מניחים פיפטות וטיפים למכסה המנוע עם אור UV במשך 15 דקות כדי לשבור את ה-DNA שיורית.בינתיים, אפשרו לצינורות האינדקס השונים ולפולימראז הדנ"א להפשיר על הקרח. במכסה המנוע הביולוגי, להוסיף 45 microliters מצינורות אינדקס שונים לצינורות PCR, דואג למנוע זיהום צולב. לאחר מכן להוסיף 0.2 microliters של פולימראז DNA וחמישה microliters של ה-DNA מוכן לתוך צינורות PCR.הפעל PCR באמצעות תוכנית מוגדרת מראש בהתאם להוראות היצרן. השתמש חרוזים מגנטיים להסרת פרייומרים עודפים, נוקלאוטידים, ואנזימים. מחממים את החרוזים לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות, ומכינים מספיק 80% אתנול טרי ל-400 מיקרוליטר לדגימה.מוסיפים את החרוזים לכל צינור PCR, ומערבבים על ידי pipetting 10 פעמים. דגירה הצינורות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. מניחים את המדגם המעורב על המעמד המגנטי במשך חמש דקות.ואז לשאוף את הנוזל שקוף, ולהשליך. לשאוף את הנוזל הנותר באמצעות קצה 10 מיקרוליטר. מוסיפים 200 מיקרוליטרים של 80% אתנול לכל דגימה, ומדגרים במשך 30 שניות.לשאוף 195 מיקרוליטרים של אתנול, ולהשליך. ואז לשאוף את הנוזל הנותר באמצעות קצה 10 מיקרוליטר. חזור על שטיפת האתנול.ואז לפתוח את הכובעים של הצינורות, ולתת להם אוויר יבש במשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, להסיר את הדגימות מן המעמד המגנטי, ולהוסיף 25 microliters של מאגר elution. מערבבים על ידי pipetting עד הומוגני, ו הדגירה בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות.מניחים את הצינורות על המעמד המגנטי במשך חמש דקות. לאחר מכן להעביר 22 microliters לצינור PCR חדש, ולמדוד את ריכוז ה-DNA. לכמת את האמפליקון כמתואר בכתב היד של הטקסט.לאחר חישוב ריכוז הדנ"א הסופי והגודל בזוגות הבסיס של שיא המוצר, הכינו תערובת דילול חדשה לכל דגימה, והעבירו שני מיקרוליטרים שלה לתמהיל בריכה חדש. הכינו פתרון טרי של נתרן הידרוקסידי 0.2 רגיל, והוסיפו 10 מיקרוליטרים לספריה המדוללת. דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לרוקן את הדנ"א הדו-גדילי.לאחר מכן הוסיפו 980 מיקרוליטרים של חיץ מצונן מראש מהערכה לצינור המכיל דנ"א, ומערבולת בקצרה. טען 600 מיקרוליטרים של הספריה הסופית על המחסנית הייעודית והנח את הדגימות במכונה. כדי לבצע ניתוח רצף, הורד מדדי רצף מהרצף וודא שהנתונים נמצאים בטווחים המתאימים.חזור על ההפעלה עבור דוגמאות שאינן עומדות בקריטריונים. פרוטוקול זה שימש לביצוע ניתוח בסיסי של דגימות דם אוטולוגיות ופי הטבעת מייצגות של חולה עם מחסור בקולטן IL10 והיסטוריה של מחלת קשב ודם אינפנטילית חמורה. דגימות הושלכו הן לרפרטואר TCR-בטא והן לרפרטואר IGH.כל השיבוטים ניתן לזהות על ידי הרצף הייחודי שלהם ברמת נוקלאוטידים או חומצת אמינו. רצפים אלה ניתן להשוות בין חולים שונים בחיפוש אחר שיבוטים משותפים או באותו חולה בין אתרים אנטומיים שונים. חמשת השיבוטים השכיחים ביותר עבור כל דגימה מוצגים כאן.תמונות TreeMap נוצרו עבור סקירה רחבה של הרפרטואר. כל ריבוע צבעוני מייצג שיבוט שונה, והגודל תואם לתדר שלו. תמונות TreeMap אלה מדגימות התרחבות שיבוט ברפרטואר IGH במעיים.לעומת זאת, ברפרטואר TCR-בטא, התפשטות שיבוט מסומן נצפתה בדם בהשוואה למעי האוטולוגי. ברמת הגנים, NGS מספק מידע לגבי שימוש V, D ו- J ברמה של גן, משפחה או אלל. יתר על כן, שילובים ספציפיים VDJ ניתן להסיק מן הנתונים עבור TCR-בטא ורפרטוארים IGH, חושף דפוסי שימוש בגנים דיפרנציאליים בתנאים שונים.פרוטוקול זה יכול להיות מיושם הן על DNA והן על RNA וניתן להשתמש בו כדי ליצור TCR-אלפא, TCR-גמא, ורפרטואר IGL. זה גם תואם עם איברים אחרים לאחר שינויים קלים בעיכול.

t-b-cell-receptor-immune-repertoire-analysis-using-next-generation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

פרוטוקול זה מתאר גישה לחקירת אזורי VDJ בשרשרת כבדה של אימונוגלובולין של לימפומות על ידי ריצוף עמוק ואחזור סידור מחדש של VDJ ומצב היפרמוטציה סומטית כדי לתאר ארכיטקטורה משובטת של גידול בודד. השוואת ארכיטקטורה משובטת בין דגימות אבחנה זוגיות והישנות חושפת מצבי אבולוציה משובטים של הישנות לימפומה.

VDJ-Seq: ניתוח רצף עמוק של ג&#39;ין שרשרת מחדש Immunoglobulin כבד לחשוף את דפוסים משובטים אבולוציה של לימפומה B הסלולרי

אנו מציגים פרוטוקול מהיר וגמיש למערכת ביטוי רטרו-ויראלית מבוססת קולטן תאי T יחיד (TCR).  וקטורים רטרו-ויראלים משמשים להתמרת תאי אב של מח עצם כדי לחקור את התפתחות תאי T ותפקודם של TCR יחיד in vivo כחלופה לעכברים טרנסגניים TCR.

Retroviral התמרה של ובתאים מח עצם כדי ליצור תאי T קולטן Retrogenic עכברים

כאן, אנו מתארים זרם תא cytometric תזרים מיון נמוך קלט, הדור הבא של ספריית פרוטוקול בנייה שנועד לייצר באיכות גבוהה, נתונים exome מלא של Hodgkin ריד- Sternberg (HRS) תאים של לימפומה הודגקין קלאסית (CHL).

זרימה מיון ו Exome רצף של תאים ריד סטרנברג של לימפומה קלאסית הודג&#39;קין

בזאת אנו מתארים שיטה חדשנית להפקה לקולטנים המצויים בתאי T אנטיגן ספציפי (TCRs) על ידי התאמת TCRα או TCRβ של TCR קיים, שהוא בעל אנטיגן-הסגולי של עניין, עם hemichain המשלים של רפרטואר קולטן תא ההיקפי T. TCRs שנוצר דה נובו לשמר אנטיגן-סגולי עם משתנה זיקה.

יצירה<em&gt; דה נובו</em&gt; לקולטנים המצויים בתאי אנטיגן ספציפי האדם T על ידי retroviral התמרה של Centric Hemichain

גורמים epigenetic יכול לקיים אינטראקציה עם תוכניות גנטית כדי לווסת את ביטוי גנים ולווסת תא B פונקציה. על ידי שילוב חוץ גופית ב B-cell גירוי, לרביעיית-PCR, ו- microRNA בתפוקה גבוהה-רצף וגישות mRNA-רצף, אנחנו ניתן לנתח את אפנון epigenetic הביטוי miRNA וג'ין בתאי B.

הגנום כולו בתיווך ניתוח של HDAC מעכב אפנון של מיקרו Rna ו mRNAs ב B תאים המושרה Undergo מחלקה-מתג ה-DNA רקומבינציה, התמיינות תאים פלזמה

המשלב בפרוטוקול הנוכחי לתא בודד לזווג אדם TCR אלפא, ביתא שרשרת רצף עם אווירודינמית דור תואם במבחנה ויוו TCR והביטוי retroviral וקטורים.

יעיל בידוד TCR תא בודד, דור של וקטורים Retroviral עבור במבחנה In Vivo הביטוי של האדם TCRs

כאן, אנו מתארים פרוטוקולים עבור ניתוח ו ויזואליזציה של המבנה ואת חוקת כל נוגדן repertoires. פעולה זו כוללת הרכישה של רצפי העצום של שימוש הדור הבא רצפי RNA נוגדן.

זיהוי של נוגדנים אנושיים Repertoires על ידי הדור הבא רצפי של עכבר

שיטת BSelex כדי לזהות ולשחזר נוגדנים ספציפיים אנטיגן ספציפי של הדם היקפיים היקפי תאים מונמונומנט משלבת הזרימה cy, לנסות עם תא בודד PCR ו שיבוט.

שיטת הקרנה של תא בודד לבחירת ושחזור של נוגדנים עם הצורך הרצוי מתוך זיכרון אנושי מועשר B אוכלוסיות תאים

השימוש בגישה מבוססת RNA כדי לקבוע פרופילים חיסוניים כמותיים של רקמות הגידול מוצק ומינוף גדודים קליניים עבור גילוי החיסונית-אונקולוגיה בסמנים מתואר באמצעות פרוטוקולים מולקולריים ואינפורמטיקה.

מידול החיסונית חזוי של גידולים מוצקים

מאמר זה מציג cytometry מבוססי זרימת שיטה לחקור את הרכב החיסון של aortas. העיתון גם מדגים טכניקה נוספת המאפשרת לבחון adventitia שמסביב קיר כלי בנפרד. שיטה זו פותחת אפשרויות לבצע ניתוחים phenotypical של לויקוציטים אבי העורקים וליישם מבחני החיסונית מספר מחקרים טרשת עורקים.

ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine

למדו לבודד DNA מדגימי דם וביופסיות מעי, ליצור ספריות PCR של TCRβ ו-IGH, ולבצע ריצוף דור-הבא. שיטה זו מאפשרת לזהות שיבוטים ייחודיים של תאי T ו-B ולעקוב אחריהם באתרים אנטומיים שונים.

ניתוח רפרטואר חיסוני של קולטן תאי T ו- B באמצעות רצף הדור הבא

גלה סרטונים נוספים