טיפוח אפידרמיס אנושי תלת מימדי משוחזר בקנה מידה גדול

אין ויטרו או מודל אפידרמיס אנושי בנוי פותחו לראשונה בשנות התשעים במטרה העיקרית לפתח שיטות בדיקה חלופיות לניסויים בבעלי חיים. אלה מודלים אפידרמיס 3D משמשים כיום נפוץ כדי לבדוק הן את הבטיחות ואת היעילות של מרכיבים קוסמטיים. בעוד שניתן לרכוש אותו ממספר ספקי רקמות, היכולת לבנות מחדש דגם תלת מימד במעבדה מעניקה גמישות רבה יותר לנקודת העניין הסופית.

ישנם מספר מאמרי מחקר המתארים בקצרה את פרוטוקול ההשבה מחדש של מודל אפידרמיס תלת מימדי, אך עד כה לא היה סרטון זמין המציג את השלבים הקריטיים של תהליך ההשבה מחדש. זו הסיבה מאחורי פרסום נייר וידאו זה. הכנת האפידרמיס האנושי המשוחזר מאפשרת חופש רב בתהליך הכת, כגון שינויים בהרכב המדיום התרבותי, גורמי לחץ פרו דלקתיים או חמצוניים, השתקת גנים מעניינים ועיכוב או גירוי של תהליכים ביולוגיים מסוימים.

כדי להתחיל, להפשיר בקבוקון עם 1 מיליון קרטינוציטים אפידרמיס אנושיים שמורים קריו, או NHEKs, באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס על ידי שקוע חלק של הבקבוקון במים. דגירה את הבקבוקון במשך דקה עד שתי דקות באמבט המים, עד רק רסיס קטן של קרח גלוי. לשים מחדש את התאים בזהירות רבה על ידי pipeting למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש פעמים.

להעביר את המתלה התא לתוך שני בקבוקים T75 המכילים סך של 15 מיליליטר של מדיום הפשרה הזהיר מראש, וכתוצאה מכך צפיפות זריעה של 6.7 פעמים 10 לתאים הרביעי סנטימטר בריבוע. ממלאים מראש 24 צלחות באר עם 1.5 מיליליטר של מדיום שקוע, באופן אידיאלי באמצעות פיפטה מתקן. לאחר culturing התאים ל 80%confluency, הם מוכנים זריעה מוסיף לטיפוח אפידרמיס אנושי משוחזר, או RHEs.

הסר את המדיום הבזלי מהבקבוקים T75 עם NHEKs. לשטוף את התאים על ידי הוספת חמישה מיליליטר של PBS מחומם מראש לכל בקבוק T75, ולאחר מכן להסיר את PBS מן הבקבוקים. הוסף שניים עד שלושה מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA מחומם מראש לכל בקבוקון, מוודא כי פתרון טריפסין מופץ באותה מידה על אזור תרבות התא של הבקבוק.

מניחים את הבקבוקים באינקובטור תרבות התא במשך ארבע דקות, ולאחר מכן לבדוק אם התאים לנתק באמצעות המיקרוסקופ בהגדלה 10 X. ראפ הבקבוק כדי לעזור לתאים לשחרר מפני השטח של הבקבוק. לאחר שכל התאים מנותקים, להוסיף נפח שווה של מעכב טריפסין שחומם מראש לכל בקבוק T75, ולהעביר את השעיית התא מן הבקבוקים לצינור צנטריפוגה.

שוטפים את הבקבוקים בחמישה מיליליטר של PBS שחומם מראש ומעבירים אותו לצינור הצנטריפוגה המכיל את השעיית התא. צנטריפוגה התאים שנקטפו ב 400 פעמים G במשך חמש דקות. בזהירות להשליך את רוב supernatant משאיר כ 100 כדי 200 microliters בצינור.

בעדינות להעיף את הצינור עם האצבעות שלך כדי לשחרר בזהירות את גלולה. בעדינות resuspend גלולה של תאים בנפח נמוך של מדיום שקוע, pipeting למעלה ולמטה 5 עד 10 פעמים כדי להבטיח השעיית תא אחיד. התחל עם נפח נמוך כדי למנוע היווצרות של צבירות תאים, ולהוסיף עד מיליליטר אחד של מדיום שקוע לכל בקבוק T75 הראשונית.

ספירת התאים בהשעיה באמצעות שיטת אי-הכללה כחולה trypan. לדלל את השעיית התא עם מדיום שקוע נוסף כדי להגיע לריכוז של 3.525 פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר, באמצעות המשוואה הראשונה המסופקת בכתב היד טקסט. בצע ספירת תאים שנייה של הפתרון המדולל והשתמש במשוואה השנייה בכתב היד של הטקסט כדי לחשב את נפח השעיית התא שיש לזרוע לתוך התוסף התרבותי.

תלו את 24 תרביות הבאר במיקום הגבוה ביותר של לוחית הובלה, והעבירו את לוחית הנשא לצלחת 24 הבאר המלאה מראש במדיום שקוע. הוסף את אמצעי האחסון שנקבע של השעיית התא לכל הכנס, תוך דאגה לא לגעת בהכנס. לאחר הזריעה, דגירה את 24 לוחות באר במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי להתגבר על אפקט קצה.

אין להזיז את הצלחות במהלך תקופה זו. מעבירים את הצלחות לחממת תרבות התאים ומשאירים אותן בתנאים שקועים במשך שלושה ימים. לאחר דגירה של שלושה ימים באינקובטור תרבית התא, לחשוף את התאים שדבקו משטח הממברנה לממשק נוזל האוויר, או ALI, על ידי הסרת המדיום שקוע מן התא apical עם מערכת שאיפה פיפט פסטר זכוכית.

מלאו 24 צלחות באר חדשות ב-1.5 מיליליטר של מדיום ALI טרי ומחומם מראש, והעבירו את לוחות המוביל עם תוספות התרבות ללוחות המולטי באר החדשים. מעבירים את הצלחות הרב-בארות בחזרה לחממה של תרבות התאים. רענן את מדיום ALI כל יומיים עד שלושה ימים, במשך 14 ימים.

קרטינוציטים בתרבות דו-מימדית מציגים מורפולוגיה מסורתית עם צורה מצולעת עקבית. לאחר 15 ימים ב ALI, האפידרמיס האנושי המשוחזר יוצר רקמה מרובדת לחלוטין, אשר מסומן על ידי ארבע שכבות האפידרמיס העיקרי שלה. ניתוח אולטרה-מבני של האפידרמיס האנושי המשוחזר בנקודות זמן שונות בפרוטוקול השיקום חושף את תהליך הקרנית, עם מספר מוגבר של שכבות אתר קרנית לאורך זמן.

קרטינוציטים באפידרמיס מראים פרופילי ביטוי חלבון שונים על פי שלב הבידול שלהם. ביטוי Involucrin מופיע בעיקר בשכבת SG, ואילו הביטוי של filaggrin ו loricrin ממוקם בשכבות העליונות. ביטוי קרטין-10 נמצא בכל השכבות המעשיות למעט שכבת SB.

האפידרמיס האנושי המשוחזר מציג צמתים desmosomal פונקציונלי, כפי שצוין על ידי הביטוי של Desmoglein-1 במרחב הבין תאי של שכבות אפידרמיס קיימא. תכונות המכשול של מודל האפידרמיס המשוחזר נחקרו על ידי הערכת הכדאיות של הרקמה על טיפול מקומי עם משבש מחסום ידוע, ועל ידי הערכת שלמות הרקמה. שלמות הרקמה נקבעה לאחר 15 יום על ידי מדידת ה- TEER עם מד נפח.

היענות של האפידרמיס Lipopolysaccharide ו גורם נמק הגידול אלפא נחקרה. גם טיפולי אלפא LPS וגם TNF לא היו רעילים. יחסית לבקרת טריטון אקס-100.

שחרורו של אינטרלוקין-1 אלפא ואינטרלוקין-8 במדיום RHE כומת באמצעות תמוגה IL. טיפול LPS הביא לרגולציה משמעותית סטטיסטית בשחרור אלפא Interleukin-1 ואינטרלוקין-8. טיפול אלפא TNF הביא לרגולציה משמעותית סטטיסטית רק בשחרור של Interleukin-1 אלפא.

עם זאת, נטייה ברורה של רמות אינטרלוקין-8 מוגברת נצפתה גם על גירוי עם אלפא TNF. בהתאם לפרוטוקול זה, ניתן למדוד את TEER כערך עבור תקינות המחסום. הכדאיות או הציטוטוקסיות ניתן למדוד על ידי MTT או LDH assay, למשל.

Supernatant יכול לשמש כדי למדוד את הפרשת ציטוקינים או חלבונים אחרים. יתר על כן, הרקמה יכולה לשמש כדי ללמוד את הביטוי של חלבונים או גנים של עניין.